于競(jìng)杰，馮二凱，尹茉莉，任飛，盛程程，胡桂學(xué)，陳立志*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，長(zhǎng)春 130112)[收稿日期] 2016-06-29 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1002-1280 (2016) 09-0001-05 [中圖分類號(hào)]S852.65

生物反應(yīng)器中PRRSV TJM株在Marc-145細(xì)胞上最佳增殖條件研究

于競(jìng)杰1,2，馮二凱2，尹茉莉2，任飛2，盛程程1,2，胡桂學(xué)1*，陳立志2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，長(zhǎng)春 130112)[收稿日期] 2016-06-29 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1002-1280 (2016) 09-0001-05 [中圖分類號(hào)]S852.65

為了在Marc-145細(xì)胞上獲得更高滴度的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)TJM株，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件、細(xì)胞接種量、微載體的用量以及病毒培養(yǎng)時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,利用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞在血清為金源康且含量為10%、培養(yǎng)基為DMEM、細(xì)胞接種密度為20～30細(xì)胞/球、微載體為5 g等條件下生長(zhǎng)狀態(tài)最好；病毒最佳培養(yǎng)時(shí)間為27～36 h,病毒增殖效果好且能夠達(dá)到最高的病毒滴度。本試驗(yàn)為微載體培養(yǎng)條件下大規(guī)模生產(chǎn)PRRSV-TJM株疫苗奠定了一定理論基礎(chǔ)。

PRRSV；Marc-145細(xì)胞；微載體；生物反應(yīng)器

SHENG Cheng-cheng1,2, HU Gui-xue1*, CHEN Li-zhi2*

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的二類傳染病[1]。在20世紀(jì)80年代美國(guó)首次報(bào)道了該病[2]。1991年荷蘭成功分離到該病毒并命名為L(zhǎng)elystad病毒[3-4]。1996年郭寶清等人在國(guó)內(nèi)某豬場(chǎng)首次分離出PRRSV，并命名為CH-1α株[5]。直到2006年我國(guó)首次爆發(fā)了高致病性呼吸與繁殖綜合征，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。由于病毒經(jīng)過(guò)周期性擴(kuò)張，出現(xiàn)基因交換[7]，導(dǎo)致新亞型病毒出現(xiàn)。隨后許多高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定被相繼報(bào)道[8]。培養(yǎng)PRRSV常用的細(xì)胞系有豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)、MA-104細(xì)胞以及Marc-145細(xì)胞等。伴隨著國(guó)家第1708號(hào)公告的頒布，血清價(jià)格不斷上漲的壓力以及市場(chǎng)對(duì)于高質(zhì)量疫苗需求，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)都著手進(jìn)行PRRSV工藝革新，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于PRRSV TJM株的報(bào)道。本研究采用Marc-145細(xì)胞在生物反應(yīng)器中不同培養(yǎng)條件下對(duì)PRRSV增殖的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為疫苗的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、毒株、血清和培養(yǎng)基 Marc-145細(xì)胞由吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司保存，并經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)至第10代進(jìn)行試驗(yàn)；PRRSV TJM毒株(第78代)由吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司保存；金源康血清(批號(hào)20150629)購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；草原綠野血清(批號(hào)140101001)購(gòu)自呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司；MEM與DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司(批號(hào)160110400PM)；微載體cytodex-1(批號(hào)17044803)購(gòu)自GE公司。

1.1.2 儀器 生物反應(yīng)器購(gòu)自廣州奇志公司(型號(hào)BC-7L)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Countstar購(gòu)自上海樂(lè)純生物技術(shù)有限公司(型號(hào)IC1000)。

1.2 方法

1.2.1 Marc-145細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮罐取出凍存的細(xì)胞，放入到37 ℃水浴鍋中，輕輕搖晃使之融化，在超凈臺(tái)內(nèi)吸出細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并補(bǔ)加培養(yǎng)液置于37 ℃ 5% CO2恒溫箱中，細(xì)胞貼壁后換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞直至細(xì)胞長(zhǎng)滿單層。

1.2.2 Marc-145細(xì)胞傳代及轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 將長(zhǎng)滿單層的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液棄掉，用PBS進(jìn)行沖洗1～2遍，加入0.25%的胰酶1 mL輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)瓶使細(xì)胞充分接觸胰酶后棄掉，放入溫箱待細(xì)胞培養(yǎng)瓶“發(fā)霧”并有針狀空隙后加入含8%血清的MEM培養(yǎng)液終止消化，用移液器反復(fù)吹打細(xì)胞平均分成4個(gè)瓶并補(bǔ)加培養(yǎng)液。待每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶形成Marc-145細(xì)胞單層，按照上述方法進(jìn)行消化及終止，準(zhǔn)備好一個(gè)1 L含8%血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，將這4個(gè)T125細(xì)胞瓶的細(xì)胞用移液槍吸取7～8 mL分別加入反應(yīng)體系中充分混勻，最后將1 L的細(xì)胞液倒入10 L轉(zhuǎn)瓶中，蓋上瓶塞放入轉(zhuǎn)瓶機(jī)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 轉(zhuǎn)瓶Marc-145細(xì)胞上生物反應(yīng)器培養(yǎng) 待轉(zhuǎn)瓶Marc-145細(xì)胞在顯微鏡下觀察其長(zhǎng)滿致密單層細(xì)胞，按照方瓶消化細(xì)胞的方法進(jìn)行消化，然后將細(xì)胞用移液器進(jìn)行反復(fù)吹打混勻并將細(xì)胞懸液加入到1 L含8% DMEM中混勻后吸取1 mL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后將該1 L細(xì)胞液利用管道打入生物反應(yīng)器內(nèi)，調(diào)節(jié)好四氣(CO2、O2、N2、Air)并調(diào)至自動(dòng)，7.5%的碳酸氫鈉溶液調(diào)至自動(dòng)添加，轉(zhuǎn)速調(diào)至60 r/min進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

1.2.4 病毒的復(fù)壯 取總體積為10 L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的長(zhǎng)滿單層的Marc-145細(xì)胞棄去營(yíng)養(yǎng)液，加入1 mL稀釋好的病毒液，37 ℃吸附60 min，期間每20 min搖晃1次以使病毒與細(xì)胞充分接觸，60 min后補(bǔ)加維持液置于CO2溫箱中并每天觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)CPE達(dá)到80%，反復(fù)凍融3次后置于-20 ℃保存。

1.2.5 TCID50的測(cè)定 方瓶細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，按106/mL細(xì)胞濃度向96孔板中每孔加入150 μL的細(xì)胞懸液，然后輕輕震蕩96孔板，使細(xì)胞分散均勻然后置于37 ℃的CO2溫箱中培養(yǎng)，將待測(cè)病毒進(jìn)行10倍系列稀釋至10-7，同時(shí)設(shè)立未接毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，對(duì)96孔板細(xì)胞進(jìn)行滴定，參照Reed-Muench法來(lái)計(jì)算TCID50。

1.2.6 最佳血清及培養(yǎng)基試驗(yàn) 在保證微載體量和接種細(xì)胞一定的條件下，采用分批式培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)PRRSV，分別做不同批次的10%草原綠野血清+MEM培養(yǎng)基、10%金源康血清+MEM培養(yǎng)基、10%金源康血清+DMEM培養(yǎng)基，并在不同批次不同的時(shí)間段進(jìn)行取樣后進(jìn)行病毒的滴定，測(cè)出這3組的TCID50，算出不同批次同一時(shí)間點(diǎn)的TCID50的平均值，試驗(yàn)進(jìn)行了3次重復(fù)性試驗(yàn)，取最接近平均值的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并繪制折線圖，通過(guò)比較可以得出該工藝的最佳血清和培養(yǎng)基。1.2.7 最佳細(xì)胞接種量試驗(yàn) 采用3個(gè)細(xì)胞接種量梯度進(jìn)行試驗(yàn):10～20 cells/球(2.15×105～4.3×105)、20～30 cells/球(4.3×105～6.45×105)、30～40 cells/球(6.45×105～8.6×105)。在確定最優(yōu)培養(yǎng)基和血清的條件下，保證微載體量一定時(shí)按照不同的初始上罐細(xì)胞濃度進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)，通過(guò)比較他們?cè)?4 h、48 h和72 h顯微鏡下圖觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差異情況以及在接毒后不同時(shí)間段取樣并測(cè)量病毒的TCID50來(lái)綜合考慮得出該最佳細(xì)胞接種量。

1.2.8 最佳微載體量試驗(yàn) 在血清、培養(yǎng)基和細(xì)胞接種量為最佳的條件下，分別做不同批次的3 g、5 g和8 g微載體進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)比較空球率的大小及接毒后病毒的TCID50來(lái)確定最佳微載體的含量。

1.2.9 病毒最佳培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn) 分別做不同批次及不同條件微載體懸浮試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)了五次的重復(fù)性試驗(yàn)，選取了最具有代表性的三個(gè)批次結(jié)果進(jìn)行簡(jiǎn)要分析，通過(guò)比較不同批次接毒后的TCID50，以其中TCID50最高者所對(duì)應(yīng)的取樣時(shí)間為最佳病毒培養(yǎng)時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 病毒復(fù)壯后病毒滴度 病毒復(fù)壯后其病毒滴度為107.2TCID50/mL。

2.2 血清和培養(yǎng)基的選擇 結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同血清及培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)微載體顯微形態(tài)觀察

通過(guò)觀察圖1中三組細(xì)胞顯微鏡下的生長(zhǎng)形態(tài)可以看出：A組中細(xì)胞大部分沒(méi)有長(zhǎng)到載體上，而D組空球較少，因此可以得出血清應(yīng)該選用金源康；G組和D組在24 h細(xì)胞生長(zhǎng)差異不大，但到72 h可以看出G組細(xì)胞輪廓清晰且每個(gè)球都長(zhǎng)滿細(xì)胞而F組仍然有沒(méi)有長(zhǎng)滿的球。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所選血清和培養(yǎng)基，我們對(duì)培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞進(jìn)行病毒的滴定，測(cè)得TCID50結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過(guò)比較可以看出，圖2-C中的TCID50數(shù)值明顯高于另外2組，所以最佳血清和培養(yǎng)基的選擇為金源康血清和DMEM培養(yǎng)基。

圖2 不同血清和培養(yǎng)基條件下的TCID50取樣分布圖

圖3 不同梯度的細(xì)胞接種量微載體顯微鏡下的形態(tài)觀察

2.3 最佳細(xì)胞接種量試驗(yàn) Marc-145細(xì)胞在載體上生長(zhǎng)結(jié)果見(jiàn)圖3。10～20 cells/球上罐經(jīng)過(guò)24 h取樣，顯微鏡下觀察出現(xiàn)大量空載體，極少數(shù)細(xì)胞能夠長(zhǎng)在載體上，直到培養(yǎng)至72 h，載體上的細(xì)胞仍然沒(méi)有長(zhǎng)到致密球體。20～30 cells/球和30～40 cells/球的試驗(yàn)，接種后72 h內(nèi)都能獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，病毒的滴度達(dá)到108.5TCID50/mL。但以40 cells/球的接種，培養(yǎng)48 h后載體上的細(xì)胞過(guò)多導(dǎo)致細(xì)胞有脫落，72 h有細(xì)胞老死脫落現(xiàn)象和大量的細(xì)胞碎片，接毒后病毒的滴度最高也只能達(dá)到107.75TCID50/mL。本梯度試驗(yàn)進(jìn)行了大量重復(fù)性試驗(yàn)，如10～20 cells/球這一梯度，進(jìn)行了(10、13、15和18 cells/球)試驗(yàn)，同理20～30 cells/球和

30～40 cells/球也進(jìn)行了多次試驗(yàn)，選取各個(gè)梯度細(xì)胞生長(zhǎng)差異明顯的一組為10 cells/球、25 cells/球和40 cells/球進(jìn)行了分析和說(shuō)明。2.4 最佳微載體量試驗(yàn) 我們?cè)诒ＷC一定細(xì)胞接種量，一定血清和培養(yǎng)基的條件下，微載體量按3 g/L、5 g/L和8 g/L進(jìn)行試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)多個(gè)批次的大量重復(fù)性試驗(yàn)，取樣觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：微載體為3 g/L時(shí)，每個(gè)載體上的細(xì)胞過(guò)多，當(dāng)培養(yǎng)到72 h，細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密，導(dǎo)致細(xì)胞從載體上脫落，致使細(xì)胞懸液中出現(xiàn)大量死細(xì)胞及細(xì)胞碎片；微載體為5 g/L時(shí)，每個(gè)載體都有細(xì)胞，沒(méi)有空球出現(xiàn)而且細(xì)胞量適中，接毒后的不同時(shí)間段內(nèi)取樣，病毒的滴度都能在108TCID50/mL以上；微載體為8 g/L時(shí)，取樣顯微鏡下觀察出現(xiàn)大量的空球，極少數(shù)細(xì)胞長(zhǎng)在載體上，培養(yǎng)至72 h也沒(méi)有長(zhǎng)滿致密球體，不滿足接毒條件。2.5 病毒最佳培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn) Marc-145細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)至致密球體后進(jìn)行接毒(MOI=0.05)，在不同時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行取樣觀察細(xì)胞病變情況并進(jìn)行病毒的滴定及TCID50的測(cè)定，所做的三個(gè)批次是基于不同條件(草原綠野血清+MEM培養(yǎng)基、金源康血清+MEM培養(yǎng)基、金源康血清+DMEM培養(yǎng)基)進(jìn)行試驗(yàn)，TCID50最高者為最佳病毒培養(yǎng)時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖4。在不同條件下生物反應(yīng)器培養(yǎng)PRRSV，其最佳病毒培養(yǎng)時(shí)間確定為27～36 h。

圖4 不同培養(yǎng)條件及不同取樣時(shí)間的TCID50分布圖

3 討論

細(xì)胞的微載體技術(shù)是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最先進(jìn)的技術(shù)之一，為細(xì)胞的大量生產(chǎn)提供了可能，即從>小培養(yǎng)體積得到高產(chǎn)量的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究10～20、20～30和30～40 cells/球的細(xì)胞接種密度對(duì)細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明細(xì)胞接種量過(guò)少則會(huì)出現(xiàn)大量空球，也會(huì)影響病毒的滴度，細(xì)胞接種量過(guò)高，培養(yǎng)至72 h出現(xiàn)脫落現(xiàn)象以及伴有大量細(xì)胞碎片，對(duì)細(xì)胞有毒性作用，從而降低細(xì)胞活性，導(dǎo)致病毒滴度不高于107.75TCID50/mL。在研究3、5和8 g/L的最佳微載體量試驗(yàn)時(shí)，消化所得到的細(xì)胞密度不能完全相同，我們只能讓細(xì)胞接種密度保持在一個(gè)相對(duì)一致的范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)所得結(jié)論的影響不大。使用的生物反應(yīng)器為半自動(dòng)系統(tǒng)，營(yíng)養(yǎng)液與維持液的更換需要人為控制；如果換成全自動(dòng)生物反應(yīng)器能夠替換細(xì)胞生長(zhǎng)耗盡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并能去除抑制細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的代謝廢物，那樣細(xì)胞的產(chǎn)量也能繼續(xù)擴(kuò)大，一定程度上微載體培養(yǎng)的病毒滴度還能有很大的提升空間[9]。國(guó)外疫苗生產(chǎn)企業(yè)的微載體培養(yǎng)技術(shù)水平已經(jīng)達(dá)到能夠連續(xù)放大至6 t 反應(yīng)器自動(dòng)控制的規(guī)模(企業(yè)交流信息)，生產(chǎn)效能呈幾何級(jí)數(shù)放大，而國(guó)內(nèi)微載體技術(shù)應(yīng)用于人用或獸用疫苗的生產(chǎn)才剛剛起步，培養(yǎng)工藝、培養(yǎng)規(guī)模均遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于國(guó)外。我國(guó)學(xué)者馮磊等[10]所用的PRRSV為國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保藏毒種，利用3 g/L的微載體量以及用不同培養(yǎng)方式對(duì)Marc-145細(xì)胞懸浮培養(yǎng)PRRSV工藝進(jìn)行優(yōu)化，病毒的效價(jià)能達(dá)到107.92TCID50/mL。區(qū)別在于我們對(duì)微載體的量做進(jìn)一步摸索，即分3個(gè)梯度進(jìn)行摸索，結(jié)果微載體的量在5 g/L細(xì)胞狀態(tài)最好，滴定結(jié)果均能達(dá)到108TCID50/mL以上，最高達(dá)到108.5TCID50/mL。目前我國(guó)微載體培養(yǎng)技術(shù)還處于起步階段，未來(lái)必將躋身于我國(guó)動(dòng)物疫苗生產(chǎn)的主流技術(shù)之中。

本研究摸索建立了PRRSV TJM株在生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞上的增殖條件(血清和培養(yǎng)基、細(xì)胞接種量、微載體用量及病毒培養(yǎng)時(shí)間等)，為建立規(guī)?；i繁殖與呼吸綜合征疫苗生物反應(yīng)器工藝奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯：李文平)

Best Propagation Conditions of PRRSV TJM Strain on Marc-145 Cells in Bioreactor

YU Jing-jie1,2, FENG Er-kai2, YIN Mo-li2, REN Fei2,

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JiLinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China；2.JLTeyanBiologicalTechnologyLimitedLiabilityCompany,Changchun130112,China)

In order to obtain higher titers of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) TJM strain on Marc-145 cells, cell culture conditions, cell inoculation, the amount of microcarrier and time of virus culture, etc. were optimized. The results showed that the growth status of Marc-145 cells was the best by using suspension culture in the bioreactor under followed conditions: serum was Jin Yuan Kang and content was 10%; medium was DMEM; cell concentration was 20～30 cells per microcarrier; weight of microcarriers were 5 grams. Besides, when the culture time of virus was 27～36 h, the effect of virus reproduction was best and the titer was highest. This study provided a theoretical basis for large-scale production of PRRSV TJM strain vaccine.

PRRSV; Marc-145 cell; microcarrier; bioreactor

國(guó)家科技攻關(guān)計(jì)劃?rùn)M向課題(201500001)；吉林省科技攻關(guān)計(jì)劃(20150204073NY)

于競(jìng)杰，碩士研究生，從事動(dòng)物分子病毒學(xué)研究。

胡桂學(xué)，E-mail: Huguixue901103@163.com；陳立志，E-mail: tcsclz@126.com