黃鑫，梁劍平，郝寶成，高旭東，郭文柱

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所∕農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∕甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

丹參酮乳房注入劑中有效成分含量測(cè)定

黃鑫，梁劍平，郝寶成，高旭東，郭文柱*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所∕農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∕甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

采用高效液相色譜測(cè)定丹參酮乳房注入劑有效成分隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量。將供試品用正己烷萃取后揮干，甲醇溶解后檢測(cè)；采用反相高效液相色譜，ZORBAX SB-C18鍵合硅膠柱(4.6×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.026%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min：V(A)60→90,V(B)40→10；20～30 min：V(A)∶V(B)=90∶10)；流速1.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。丹參酮乳房注入劑中隱丹參酮含量在500～1750 μg/g(r=0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為101.15%，RSD為1.55%；丹參酮ⅡA的含量在1125～3937.5 μg/g(r=0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為100.89%，RSD為1.64%。結(jié)果顯示，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏，精密度、重復(fù)性好，可作為丹參酮乳房注入劑中有效成分含量測(cè)定的參考方法。

奶牛乳房炎；含量測(cè)定；丹參酮乳房注入劑；高效液相色譜

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最普遍、危害最大的疾病之一[1]。據(jù)美國(guó)國(guó)家乳房炎委員會(huì)(The National Mastitis Committee)1996年的統(tǒng)計(jì)，全球每年因乳房炎造成的損失約350億美元[2]。奶牛乳房炎的發(fā)生，不僅給全世界奶牛業(yè)的生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且影響著整個(gè)畜牧業(yè)的發(fā)展[3]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，人們生活水平也日益提高，在日常膳食中牛奶已成為不可或缺的一部分，但隨之而來(lái)的牛奶中抗生素殘留[4]、微生物超標(biāo)[5]、耐藥性細(xì)菌[6]等食品安全問(wèn)題也相對(duì)增多，奶牛乳房炎的防治成為世界奶牛業(yè)的難題。中草藥等天然產(chǎn)物因殘留低、毒副作用小、環(huán)保等特點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注，中草藥在奶牛乳房炎治療中的應(yīng)用也越來(lái)越普遍[7-8]。

丹參作為常用藥材，具有活血化瘀，活絡(luò)通痹，安心養(yǎng)神，解毒涼血，排膿生肌，消腫止痛，療瘡止痢等功效。丹參中含有多種有效成分，主要成分有丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、二氫丹參酮等，臨床上常作為殺菌消炎藥使用[9]。甘志華[10]等將研制的“復(fù)方丹參液”用于隱性奶牛乳房炎的治療，結(jié)果顯示治愈率達(dá)87.55%，且高效無(wú)害、簡(jiǎn)單安全。 據(jù)報(bào)道，丹參還具有抗腫瘤、抗抑郁、抗衰老、提高機(jī)體免疫力等作用[11]。丹參酮乳房注入劑是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研發(fā)的一種用于治療奶牛乳房炎的純中藥制劑，其主要成分是中藥丹參通過(guò)乙醇提取所得，再按一定比例與油質(zhì)輔料配制而成。藥效學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)顯示其用于奶牛乳房炎的治療效果顯著，丹參酮高劑量組治愈奶牛臨床型乳房炎乳區(qū)數(shù)可達(dá)72.22%，顯著優(yōu)于雙丁對(duì)照組，治療后的患牛臨床癥狀明顯改善[12-13]。為了更好地控制丹參酮乳房注入劑的質(zhì)量，確保臨床安全用藥，建立丹參酮乳房注入劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文參考已有文獻(xiàn)[14-15]，建立了更加簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏的丹參酮乳房注入劑有效成分的高效液相色譜的定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與材料 超高效液相色譜儀(Agilent 1290，配置真空脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器等)，美國(guó)Agilent 公司；KH-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；電子分析天平，德國(guó)sartorius 公司；HH-S4氮?dú)獯蹈蓛x，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司； MX-S旋渦混合器，美國(guó) scilogexscilogex公司。

含量測(cè)定對(duì)照品：隱丹參酮，批號(hào)：110852-201506，HPLC≥98.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；丹參酮ⅡA，批號(hào)：110766-201520，HPLC≥98.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

供試品：丹參酮乳房注入劑(批次：20130806、20130808、20130810)，承德金奧生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司試制。

試劑：色譜純甲醇、乙腈，美國(guó)賽默飛世爾(Fisher Scientific)公司；異丙醇(色譜純，批號(hào)：2015080601)，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；磷酸(分析純，批號(hào)：20150601)，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18鍵合硅膠柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.026%磷酸(取520 μL磷酸加入至2 L超純水中，即得)溶液為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫30 ℃；流速1.2 mL/min。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相比例

1.3 溶液配制的方法

1.3.1 對(duì)照品溶液配制 分別精密稱(chēng)取隱丹參酮和丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品20、45 mg置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備成每1 mL約含隱丹參酮200 μg和丹參酮ⅡA 450 μg的200%混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1.3.2 供試品溶液配制 精密量取丹參酮乳房注入劑2 g，加入乙腈30 mL，用力振搖3 min，再加入正己烷10 mL，用力振搖3 min，靜置至分層；取下層溶液，再加入正己烷10 mL，振搖3 min，靜置至分層；取下層溶液置于蒸發(fā)皿中，氮?dú)獯蹈桑儆眉状既芙?，定容?5 mL容量瓶中，然后用0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，保留后續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 專(zhuān)屬性 將配制好的對(duì)照品溶液和已知批次(20130806)丹參酮乳房注入劑供試品溶液，按色譜條件進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖1(A、B)所示。

圖1 對(duì)照品和樣品的HPLC 色譜圖(1為隱丹參酮峰，2為丹參酮ⅡA峰，3為雜質(zhì)峰)

2.1.2 中間精密度 在色譜條件下，將配制好的同一批次(批號(hào)：20130806)供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 d，每天重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄隱丹參酮和丹參酮ⅡA的峰面積，得到中間精密度(表2)。

表2 丹參酮乳房注入劑的中間精密度

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 按照試驗(yàn)用色譜條件，將200%標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液梯度稀釋成6個(gè)濃度(140%、120%、100%、80%、60%、40%)，然后按表1中的方法進(jìn)行分析，每個(gè)濃度的對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，分別記錄圖譜中各濃度隱丹參酮和丹參酮ⅡA的峰面積。分別以隱丹參酮和丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，平均峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程(表3)。

表3 丹參酮乳房注入劑中主要成分的回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限

2.3 加樣回收 精密量取已測(cè)定含量的同一批次(20130806)樣品6份，每份樣品中各加入一定適量的隱丹參酮和丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后按照供試品溶液制備方法，將樣品萃取揮干，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，備用。在已選定的色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積并分別計(jì)算隱丹參酮和丹參酮ⅡA的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

2.4 重復(fù)性 精密稱(chēng)取6份同一批次(20130806)丹參酮乳房注入劑樣品，每份按照供試品配制方法將其配制成同一濃度的供試品溶液，然后按照色譜條件進(jìn)行分析，每份樣品重復(fù)3次進(jìn)樣，記錄色譜圖，求得丹參酮乳房注入劑中隱丹參酮的平均含量為643.25 μg/g，RSD為1.56%；丹參酮ⅡA的平均含量為1895.38 μg/g，RSD為1.62%。

表4 樣品中隱丹參酮加樣回收率

表5 樣品中丹參酮ⅡA加樣回收率

2.5 樣品含量測(cè)定 取不同批次(20130806、20130808、20130810)供試樣品，每個(gè)批次樣品取3份，依照供試品配制方法制備，在實(shí)驗(yàn)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算含量,結(jié)果如表6所示。

表6 丹參酮乳房注入劑中主要成分的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 結(jié)合紫外吸收光譜圖以及2010年版《中國(guó)獸藥典》中對(duì)丹參提取物的高效液相色譜檢測(cè)方法，參考其最大吸收波長(zhǎng)，以確保試驗(yàn)靈敏度較高，選擇在270 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)丹參酮乳房注入劑中主要有效成分隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量，并且在方法驗(yàn)證耐用性研究中證實(shí)270 nm是其有效成分的最適波長(zhǎng)。

3.2 溶劑的選擇與樣品前處理的方法 由于丹參提取物中有效成分均不溶于水等溶劑，所以溶劑選取和樣品前處理方法對(duì)丹參酮乳房注入劑中有效成分隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量檢測(cè)影響較大。在選用溶劑溶解隱丹參酮和丹參酮ⅡA的標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙腈和丙酮等均能使其溶解，但考慮到甲醇的毒性和刺激性較小，所以選定甲醇為溶劑。

在樣品的前處理過(guò)程中，由于丹參酮乳房注入劑的輔料是植物油，黏性較大，且不溶于甲醇等溶劑，檢測(cè)時(shí)容易損壞色譜柱，所以采用乙腈和正己烷進(jìn)行液液萃取的方式，將樣品中的有效成分隱丹參酮和丹參酮ⅡA萃取在溶劑乙腈中，再將乙腈揮發(fā)后溶于甲醇中進(jìn)行檢測(cè)。本研究還對(duì)樣品的溶解方法做了考察，經(jīng)比較超聲溶解優(yōu)于手動(dòng)振蕩溶解；使用氮?dú)鈸]干儀優(yōu)于常溫?fù)]發(fā)和水浴揮發(fā)，因此樣品處理選擇乙腈萃取后氮?dú)獯蹈?，用甲醇超聲溶解?/p>

3.3 流動(dòng)相及柱溫的優(yōu)化 在查閱了大量丹參提取物液相檢測(cè)方法并參照《中國(guó)獸藥典》后，選擇乙腈和磷酸水溶液作為流動(dòng)相，并利用梯度洗脫的方法檢測(cè)，方法驗(yàn)證耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在此流動(dòng)相下對(duì)照品出峰良好，符合要求，最終確定流動(dòng)相乙腈(A)-0.026%磷酸水溶液(B)梯度洗脫，0～20 min時(shí)V(A)(60→90),V(B)(40→10)，20～30 min時(shí)V(A)∶V(B)為90∶10，在此條件下檢測(cè)時(shí)，目的峰峰形較好，無(wú)拖尾。

柱溫對(duì)樣品中隱丹參酮和丹參酮ⅡA的峰型均有影響，尤其以隱丹參酮的影響最為嚴(yán)重，在隱丹參酮出峰前后有一較高峰伴隨，如果柱溫太低，則達(dá)不到分離效果，提高柱溫能很好的改善峰型，但考慮到樣品中有效成分對(duì)溫度較為敏感，選擇柱溫為30 ℃。

丹參酮乳房注入劑是一種新的治療奶牛乳房炎的純中藥制劑，主要藥效成分為隱丹參酮和丹參酮ⅡA，臨床試驗(yàn)顯示其對(duì)奶牛乳房炎具有良好的效果，臨床應(yīng)用前景廣闊。本文建立的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)丹參酮乳房注入劑中有效成分含量的方法，峰型對(duì)稱(chēng)性較好，分離度、回收率較高，且此方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，精密度、重復(fù)性好，可作為丹參酮乳房注入劑質(zhì)量監(jiān)控的參考方法。

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(編輯：侯向輝)

Determination of Active Ingredient Content in Tanshinone Injection Agent for the Treatment of Bovine Mastitis

HUANG Xin，LIANG Jian-ping, HAO Bao-cheng, GAO Xu-dong, GUO Wen-zhu*

(LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalSciencesofCAAS,KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProject,GansuProvince,KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticalDevelopment,MinistryofAgriculture,Lanzhou730050,China)

This study is aimed to establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method to determine the active ingredient in tanshinone injection agent for the treatment of bovine mastitis. Samples were dried with hexane extraction and analyzed by reverse phase high performance liquid chromatography after dissolved with methanol.The target cryptotanshinone and tanshinone II A were separated on a ZORBAX SB-C18 column (4.6×250 mm, 5 μm) using acetonitrile(A) and 0.026% phosphoric acid solution(B) (0～20 min,V(A)60→90,V(B)40→10；20～30 min：V(A)∶V(B)=90∶10) as the mobile phase by gradient elution, the flow rate was 1.2 mL/min with colomn temperature of 30 ℃ and detection wavelength of 270 nm. The content of cryptotanshinone in tanshinone injection agent for the bovine mastitis showed good linear relationship at the range of 500～1750 μg/g(r=0.9999), the average recovery was 101.15% with the relative standard deviation of 1.55%. The other content of tanshinone II A in it also displayed a good linear relationship at the range of 1125～3937.5 μg/g (r=0.9999), The average recovery was 100.89% with the relative standard deviation of 1.64%. The results showed that the method demonstrated advantage of simpleness, accuraty and sensitivity, and successfully applied to the analysis of cryptotanshinone and tanshinone II A in tanshinone injection agent for the bovine mastitis.

bovine mastitis；determination of content；tanshinone injection agent for the bovine mastitis；HPLC

黃鑫，在讀碩士，從事天然獸用藥開(kāi)發(fā)與應(yīng)用工作。

郭文柱。E-mail：417052657@qq.com

2016-05-26

A

1002-1280 (2016) 09-0053-05

S859.2