謝買勝, 李 江, 林學(xué)政, 何培青

(國(guó)家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061)

熱穩(wěn)定κ-卡拉膠酶產(chǎn)生菌Bacillus sp.Car19的發(fā)酵條件優(yōu)化

謝買勝, 李 江, 林學(xué)政, 何培青

(國(guó)家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061)

對(duì)一株分泌熱穩(wěn)定κ-卡拉膠酶印尼熱泉菌進(jìn)行了種屬鑒定, 并采用響應(yīng)面法對(duì)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。鑒定結(jié)果表明, 該菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus), 命名為Bacillus sp.Car19(GeneBank: KT865196)。發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果顯示, 9個(gè)環(huán)境因子影響B(tài)acillus sp.Car19產(chǎn)酶量。其中影響B(tài)acillus sp.Car19產(chǎn)酶量的三個(gè)主要因素分別為培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中Cu2+濃度和培養(yǎng)基中NaCl濃度。綜合次要因素對(duì)Bacillus sp.Car19產(chǎn)酶影響, Bacillus sp.Car19最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件為: 培養(yǎng)溫度52.31℃、Cu2+濃度6.93 mmol/L、NaCl濃度37.03 g/L, 培養(yǎng)基pH為6, 接種量1%, 培養(yǎng)時(shí)間36 h, 半乳糖濃度0.3 g/L,硝酸銨濃度7 g/L, 卡拉膠濃度0.5 g/L。優(yōu)化后發(fā)酵上清液酶活力達(dá)到15.21 U/mL, 與優(yōu)化前相比提高了1.5倍。

熱泉菌; 卡拉膠酶; 優(yōu)化; 響應(yīng)面

嗜熱微生物由于能合成多種具有應(yīng)用價(jià)值的耐熱酶, 已成為近年來科學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。微生物學(xué)家們普遍認(rèn)為, 能在55℃以上高溫環(huán)境生長(zhǎng)的微生物為嗜熱微生物, 包括最低等的古細(xì)菌和部分細(xì)菌,能在80℃以上環(huán)境中生長(zhǎng)的為極端嗜熱菌, 其中大部分是古細(xì)菌[2]。耐熱酶是嗜熱微生物產(chǎn)生的一類熱穩(wěn)定性酶, 這種酶特點(diǎn)就是在高溫下達(dá)到最高催化效率。高溫能提高底物和產(chǎn)物的溶解度, 減少物質(zhì)與反應(yīng)器的貼壁效應(yīng), 同時(shí)降低染菌風(fēng)險(xiǎn), 減少產(chǎn)物收集難度, 所以耐熱酶有望取代傳統(tǒng)常溫催化, 廣泛用于食品、生物制藥、廢水處理等生產(chǎn)領(lǐng)域[3-4]。

卡拉膠(carrageenan)是海洋紅藻中一種結(jié)構(gòu)性多糖, 由α-1, 3和β-1, 4糖苷鍵交替連接的D-半乳糖或其衍生物組成。它是一種親水性膠體, 主要存在于海藻細(xì)胞壁中[5]。常見的卡拉膠有κ-, λ-, ι-型, 另外也有α-, β-, θ-, μ-, ν-, γ-, δ-, ξ-, π-, ω-等類型的卡拉膠。卡拉膠的分子質(zhì)量大、溶解性差、機(jī)體不易吸收、利用率低等缺點(diǎn), 制約了卡拉膠在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[6], 目前卡拉膠主要用于食品相關(guān)工業(yè)。已有的研究結(jié)果表明: 利用卡拉膠制備的卡拉膠寡糖具有多種生物活性, 如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等[7-9], 因此在醫(yī)藥領(lǐng)域有很高應(yīng)用價(jià)值。如何利用卡拉膠制備卡拉膠寡糖, 提升卡拉膠的應(yīng)用價(jià)值已成為當(dāng)前卡拉膠研究亟需攻克的技術(shù)。制備卡拉膠寡糖的方法主要有三種: 生物酶法、化學(xué)法及物理法。傳統(tǒng)的化學(xué)法和物理法的主要缺陷是反應(yīng)條件不易控制、產(chǎn)物聚合度很高且分布不均一。利用卡拉膠酶制備卡拉膠寡糖的生物酶法, 具有反應(yīng)條件溫和易控制、底物專一性好等優(yōu)點(diǎn), 能克服物理法和化學(xué)法的缺陷。因此利用生物酶法, 開發(fā)高活性的卡拉膠酶是提升卡拉膠應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵技術(shù)。

卡拉膠酶是能斷裂卡拉膠β-1, 4糖苷鍵的半乳糖苷水解酶。根據(jù)底物類型, 可以分為 κ-, ι-, λ-卡拉膠酶[10]。迄今發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶大部分為熱不穩(wěn)定酶,當(dāng)溫度高于60℃時(shí)就會(huì)迅速失活, 嚴(yán)重限制了卡拉膠酶的應(yīng)用。牟海津[11]研究表明, 卡拉膠降解菌M-2分泌的κ-卡拉膠酶在55℃放置30 min 即喪失全部酶活; Potin等[12]研究顯示, Cytophaga菌株分泌的κ-卡拉膠酶在40℃放置1 h, 酶活亦完全喪失。而來源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、耐熱性好等優(yōu)點(diǎn), 是生物工程領(lǐng)域具有發(fā)展前景的酶資源。本研究以一株分泌熱穩(wěn)定卡拉膠酶的印尼熱泉菌為對(duì)象, 通過16S rDNA測(cè)序的方法鑒定了該菌的種屬,用響應(yīng)面法確定了該菌的最適產(chǎn)酶發(fā)酵條件, 以期為生物酶法制備卡拉膠寡糖及卡拉膠寡糖的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

產(chǎn)卡拉膠酶的菌株分離自印度尼西亞卡利安達(dá)島東海岸的熱泉樣品(5°44′46″N, 105°35′12″E), 現(xiàn)保存于國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫中(-80)℃。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母粉(Oxoid公司); 分析純?chǔ)?、λ-、ι-卡拉膠(SIGMA公司); 混合卡拉膠(天津巴斯夫化工有限公司); 3-5二硝基水楊酸(DNS)、氫氧化鈉、結(jié)晶酚、碘單質(zhì)、碘化鉀、亞硫酸鈉、四水合酒石酸鉀鈉和甘氨酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

2216E液體培養(yǎng): 蛋白胨5g, 酵母粉1g, 1000 mL過濾海水配制;

2216E固體培養(yǎng)基: 蛋白胨5g, 酵母粉1g, 卡拉膠15g, 1000 mL過濾海水配制;

2216E斜面培養(yǎng)基: 蛋白胨5g, 酵母粉1g, 瓊脂粉 15g, 1000 mL過濾海水配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA的鑒定

以Bacillus sp.Car19菌株基因組為DNA模板,利用通用引物27F、1492R[13]對(duì)Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 使用3730測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)序并雙向測(cè)通(南京金斯瑞生物公司)。將所測(cè)序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(NCBI)用BLAST分析比對(duì)并上傳序列獲得GenBank登錄號(hào)。

1.2.2 Bacillus sp.Car19產(chǎn)卡拉膠酶的類型的確定

以2216E固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 分別加入κ-, λ-, ι-卡拉膠制成篩選平板, 取2 μL含Bacillus sp.Car19的菌液于平板上, 在55℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36 h, 然后用Lugol氏碘液染色, 觀察菌落周圍是否有透明圈, 以確定該菌產(chǎn)生的卡拉膠酶的類型。

1.2.3 卡拉膠酶活力的測(cè)定方法-DNS法[14]

前期實(shí)驗(yàn)表明, Bacillus sp.Car19發(fā)酵上清液中粗酶的最適作用條件為60℃、pH=9, 因此, 本次實(shí)驗(yàn)取1mL培養(yǎng)36h后的發(fā)酵上清液作為粗酶液, 與1mL 0.5%的卡拉膠在60℃、pH=9的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中反應(yīng)15min后, 測(cè)量反應(yīng)體系中還原糖的含量來表示粗酶的酶活。1個(gè)酶活力單位(U)定義為1mL發(fā)酵上清液在60℃和pH為9的條件下, 1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μg還原糖所需的酶量。酶活力計(jì)算公式[15]:

1.3 Bacillus sp.Car19的發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、不同碳源、不同氮源、最適碳源濃度、最適氮源濃度、不同金屬離子、最適金屬離子濃度、卡拉膠濃度及NaCl濃度作為唯一變量, 進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),確定各種環(huán)境因素對(duì)Bacillus sp.Car19產(chǎn)酶的影響。各因素及水平見表1。以發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm下的吸光度代表其生物量, 離心發(fā)酵上清液酶活力最高時(shí)條件為單因素實(shí)驗(yàn)下最適產(chǎn)酶條件, 并將該條件下酶活力定義為100%。分別確定影響B(tài)acillus sp.Car19產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)溫度、最適培養(yǎng)基pH、最適培養(yǎng)時(shí)間、最適接種量、最適碳源、最適氮源、最適碳源濃度、最適氮源濃度、最適金屬離子、最適金屬離子濃度、最適NaCl濃度以及卡拉膠濃度。其中, 確定最適碳源、氮源、金屬離子后, 進(jìn)一步設(shè)置不同濃度梯度找出最適碳源、氮源、金屬離子的最適濃度。

1.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus sp. Car19發(fā)酵條件

1.3.2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)[16]

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 對(duì)上述9個(gè)因素進(jìn)一步考察, 采用Factors=9, Runs=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì), 選取各因素最高和最低2個(gè)水平, 進(jìn)行50 mL發(fā)酵實(shí)驗(yàn), 用每毫升發(fā)酵上清液中卡拉膠酶活力表示響應(yīng)值R1, 確定影響B(tài)acillus sp. Car19發(fā)酵產(chǎn)酶的主要因素, 實(shí)驗(yàn)因素代碼(實(shí)驗(yàn)因素對(duì)應(yīng)代碼全文不變)及水平見表2。

1.3.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)[17]

據(jù)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 利用Designexpert.v8.05軟件進(jìn)行各因素的方差分析, 得到各因素重要性排名順序, 對(duì)排名前三的實(shí)驗(yàn)因素, 選擇適合的坡度進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn), 得到發(fā)酵上清酶活力逼近最大響應(yīng)面區(qū)域時(shí)的條件。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素及水平Tab. 1 Factors and levels in single factor experiment

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)中影響B(tài)acillus sp.Car19產(chǎn)酶的因素及水平Tab. 2 Factors and levels affecting Bacillus sp. Car19 production of carrageenase in Plackett-Burman experiment

1.3.2.3 響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[18]

利用Design-expert.v8.05軟件中Box-Benhnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn), 考察三個(gè)顯著因素之間的交互作用及獲得發(fā)酵上清液酶活力最高時(shí)的三因素組合。各因素代碼及水平見表3, 其中以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中酶活力最高時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件, 作為Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn), 圍繞中心點(diǎn)附近取一個(gè)最高和最低水平, 進(jìn)行15個(gè)不同條件組合的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Tab. 3 Box-Behnken factors and level values

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA經(jīng)測(cè)序拼接后長(zhǎng)度為1461 bp, 與NCBI數(shù)據(jù)庫中Bacillus licheniformis DHXJ13菌株16S rDNA基因的相似度為99%, 因此確定該熱泉菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus), 命名為Bacillus sp.Car19。將該序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫, 獲得GenBank登錄號(hào)為(KT865196), 根據(jù) Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 根據(jù)Bacillus sp.Car19菌株16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Neighbor-joining tree of Bacillus sp.Car19 based on 16S rDNA gene sequence

2.2 Bacillus sp.Car19所產(chǎn)卡拉膠酶的類型

Bacillus sp.Car19在含有不同類型卡拉膠的篩選平板生長(zhǎng)36 h后, 只在含有κ-卡拉膠的篩選平板上產(chǎn)生明顯的透明圈(圖2), 而在其他類型卡拉膠的平板上沒有透明圈(圖略), 因此確定該酶為κ-卡拉膠酶。

圖2 Bacillus sp.Car19在κ-卡拉膠平板上產(chǎn)生的透明圈Fig. 2 Bacillus sp. Car19 produced transparent circle on Kappa-carragenan solid medium

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各種環(huán)境因素對(duì)Bacillus sp.Car19生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響情況見圖3。由(圖3-a)可以看出該菌在60℃時(shí)生物量達(dá)到最大值, 但相對(duì)酶活力在培養(yǎng)溫度為50℃時(shí)最高; pH對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶影響較小, 菌體在培養(yǎng)基pH=6時(shí)相對(duì)酶活力最高(圖3-b); (圖3-c)的結(jié)果表明最高酶活力出現(xiàn)在培養(yǎng)36 h時(shí), 但菌的生物量還在繼續(xù)增加, 直到48 h后才開始降低; 接種量在0.5%～1%(圖3-d)之間時(shí), 發(fā)酵上清液粗酶的酶活力保持增加趨勢(shì), 但接種量超過1%后, 發(fā)酵上清液粗酶酶活力開始降低, 但接種量過小, 菌體培養(yǎng)時(shí)間就會(huì)相對(duì)延長(zhǎng)[19]。同時(shí)研究結(jié)果也表明, 最佳碳源為0.3 g/L的半乳糖(圖3-e和圖3-g), 最佳氮源為7 g/L的硝酸銨(圖3-f和圖3-h), 培養(yǎng)基中卡拉膠最佳濃度則為0.5 g/L(圖3-k); 金屬離子對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶有較明顯的影響, 特別是培養(yǎng)基中Cu2+濃度為5 mmol/L(圖3-j)以及NaCl濃度為30 g/L時(shí)(圖3-l)。

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。從表4中可以看出: 進(jìn)行12個(gè)不同因素最高最低水平組合的實(shí)驗(yàn)時(shí), 發(fā)酵上清液最高酶活力為15.08 U/mL, 最低為9.35 U/mL。且不同條件組合下, 發(fā)酵液上清酶活力在9～12 U/mL之間比較集中。同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn), 結(jié)果見表5, 從表5中可以看出影響B(tài)acillus sp.Car19產(chǎn)酶的三個(gè)重要的因素依次是培養(yǎng)溫度, 培養(yǎng)基中Cu2+含量, NaCl濃度, P值均小于0.05, 說明這 3 個(gè)因素對(duì) Bacillus sp.Car19產(chǎn)酶活力影響顯著, 因此選擇這 3 個(gè)因子作為最陡爬坡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察影響B(tài)acillus sp.Car19產(chǎn)酶量的對(duì)象。

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)Bacillus sp. Car19生長(zhǎng)及產(chǎn)卡拉膠酶的影響Fig. 3 Influence of different culture conditions on Bacillus sp. Car19 growth and carrageenase production

2.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù) Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)各因素重要性的排列順序, 選出影響B(tài)acillus sp.Car19產(chǎn)酶前三的因素進(jìn)行梯度爬坡實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。從表中可以看出在培養(yǎng)溫度為54℃、Cu2+7 mmol/L、NaCl濃度36 g/L時(shí)發(fā)酵上清液的酶活力達(dá)到最大值15.07 U/mL, 因此將該條件作為下一步Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.4.3 響應(yīng)面Box-Behnken法獲得最優(yōu)發(fā)酵條件結(jié)果

以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得到的發(fā)酵上清酶活力最高實(shí)驗(yàn)條件為中心值, 分別取離中心值附近的各對(duì)稱條件為最高最低水平, 采用factors=3, run=15進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì), 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸方差分析, 得到發(fā)酵上清液酶活力R1與自變量培養(yǎng)溫度X1、Cu2+濃度X7、NaCl濃度X8的的多元回歸方程為:

R1=12.47+2.61X1+2.67X7+2.86X8-0.24X1X7+2.48 X1X8+1.42X7X8-2.03X12-2.14X72-2.90X82

回歸模型方差分析見表8。從表中可以看出模型P=0.0401小于0.05, 說明線性模型回歸顯著, 模擬得到的方程可信。X1、X7、X8的P值均小于0.05, 對(duì)Bacillus sp.Car19產(chǎn)酶影響顯著, 交互項(xiàng)和二次項(xiàng)的中X1X8、X82的P值小于0.05, 說明Bacillus sp.Car19卡拉膠酶產(chǎn)量受三因素之間交互作用的影響。決定系數(shù)R2=0. 9056, 失擬項(xiàng)CV=27.04%, 表明模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好, 得到的方程可用。因此通過多元回歸得到的方程可以很好的說明Bacillus sp.Car19產(chǎn)酶量與培養(yǎng)溫度X1、Cu2+濃度X7、NaCl濃度X8之間的關(guān)系。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果Tab. 4 Plackett-Burman design and response results

表5 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)主效應(yīng)分析Tab. 5 Analysis of main effects of Plackett-Burman design

表6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 6 Experimental design and response of steepest ascent

根據(jù)多元回歸方程(1)繪制的培養(yǎng)溫度、Cu2+濃度、NaCl濃度兩兩交互作用的響應(yīng)曲面及等高線見圖4～圖6。從響應(yīng)曲面圖可以看出發(fā)酵上清液酶活R1的值在所選因素范圍內(nèi)有最大值, 最大值即為等高面圖的中心點(diǎn)。為求出多元回歸方程(1)所構(gòu)建模型的最大值及最大值條件下對(duì)應(yīng)各因素的組合, 對(duì)所得的回歸擬合方程分別求各自變量的一階偏導(dǎo)數(shù), 并令其為0, 得到三元一次方程組, 求解此方程組得到模型R1在最大值條件下各因素對(duì)應(yīng)的值[20]: X1=52.31、X7=6.93、X8=37.03, 即當(dāng)培養(yǎng)溫度為52.31℃、Cu2+濃度為6.93 mmol/L、NaCl濃度為37.03 g/L時(shí), 理論發(fā)酵上清液酶活力R1的最大值為15.82 U/mL。為進(jìn)一步驗(yàn)證模型是否正確, 進(jìn)行三組發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證, 每組培養(yǎng)基均為優(yōu)化后得到的最優(yōu)條件, 用三組數(shù)據(jù)平均值來表示優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活力。測(cè)得優(yōu)化后發(fā)酵上清液酶活力R1=15.21 U/mL, 接近預(yù)測(cè)值,表明優(yōu)化得到的發(fā)酵條件可信。發(fā)酵后的酶活力是未優(yōu)化前的1.5倍, 優(yōu)化后的培養(yǎng)基提高了Bacillus sp. Car19 的產(chǎn)酶量。

表7 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 7 Box-Behnken design and results

表8 回歸方程方差分析Tab. 8 Analysis of variance by regression equation

圖4 NaCl濃度和培養(yǎng)溫度影響B(tài)acillus sp. Car19產(chǎn)卡拉膠酶繪制的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plot of NaCl concentration and temperature influence on Bacillus sp. Car19 carrageenase production

圖5 Cu2+濃度和培養(yǎng)溫度影響B(tài)acillus sp. Car19產(chǎn)卡拉膠酶繪制的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plot of Cu2+concentration and temperature influence Bacillus sp. Car19 carrageenase production

圖6 NaCl濃度和Cu2+濃度影響B(tài)acillus sp. Car19產(chǎn)卡拉膠酶繪制的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plot of NaCl concentration and Cu2+concentration influence on Bacillus sp. Car19 carrageenase production

3 討論

自從1966年首次在海洋微生物中發(fā)現(xiàn)能分泌卡拉膠酶的假單胞菌 Pseudomonas carrageenovora[21]以來, 已發(fā)現(xiàn)多種屬的海洋微生物能產(chǎn)生卡拉膠酶,如噬纖維菌屬、假單胞菌屬、別單胞菌屬、弧菌屬等[22], 這些細(xì)菌多分離自海藻表面或以海藻為食的軟體動(dòng)物, 且多為熱不穩(wěn)定酶。本文研究的產(chǎn)酶菌株分離自印度尼西亞卡利安達(dá)島東海岸的熱泉群(5°44′46″N, 105°35′12″E), 熱泉水溫可達(dá)50～97℃[1],周邊毗鄰大型海藻床, 經(jīng)鑒定該菌屬于Bacillus屬,與胡秋實(shí)等[23]發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)卡拉膠酶菌株一致, 但前者為λ-卡拉膠降解菌, 而本研究中的菌株為κ-卡拉膠降解菌, 目前有關(guān)熱泉菌產(chǎn)卡拉膠酶的報(bào)道尚不多見。

培養(yǎng)條件的優(yōu)化在微生物代謝產(chǎn)物的研究中起著重要的作用, 與傳統(tǒng)的單次單因子法和正交實(shí)驗(yàn)相比, 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短, 不僅能夠評(píng)價(jià)各因素對(duì)生物過程的影響, 并且還能體現(xiàn)各因素之間的交互作用得到最佳條件, 是優(yōu)化培養(yǎng)條件的有效方法[24]。為了提高Bacillus sp. Car19產(chǎn)卡拉膠酶的能力, 本文采用響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)條件經(jīng)行了優(yōu)化, 發(fā)現(xiàn)影響B(tài)acillus sp. Car19產(chǎn)卡拉膠酶的三個(gè)主要因素分別為培養(yǎng)溫度、NaCl濃度和Cu2+濃度。培養(yǎng)溫度是微生物生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵因素, 由于Bacillus sp. Car19來源于熱泉, 因此較高的培養(yǎng)溫度也與其生長(zhǎng)環(huán)境相一致, 較高的培養(yǎng)溫度不僅能夠縮短培養(yǎng)周期, 而且也可有效的避免雜菌的生長(zhǎng);李俊等[19]對(duì)HC4菌株產(chǎn)卡拉膠酶條件優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn), NaCl濃度對(duì)其產(chǎn)卡拉膠酶能力有較大影響, 且NaCl的最適濃度在20 g/L左右, 而本研究中NaCl濃度達(dá)到37.03g/L, 比普通海水的濃度略高; 至于Cu2+濃度對(duì)產(chǎn)酶能力的影響機(jī)制目前尚不清楚, 有待今后結(jié)合熱泉樣品的組成成分進(jìn)行綜合分析。

經(jīng)過優(yōu)化后, 發(fā)酵上清液的酶活力達(dá)到15.21 U /mL,比優(yōu)化前提高了1.5倍, 加之Bacillus sp. Car19所產(chǎn)的卡拉膠酶作用溫度高, 在后續(xù)制備產(chǎn)物的過程中雜菌很難生存, 能減少雜菌代謝物對(duì)產(chǎn)物的污染,同時(shí)減少物質(zhì)的貼壁效應(yīng), 使得收集卡拉膠寡糖相對(duì)容易, 因而具有一定的應(yīng)用潛力。

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Received: Jan. 25, 2016

Optimization of fermentation conditions for thermostable κ-carrageenase production of strain Bacillus sp. Car19

XIE Mai-sheng, LI Jiang, LIN Xue-zheng, HE Pei-qing
(First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China)

Hot spring bacterium; Carrageenase; Optimization; Response surface

In this study, we identified a high-yield κ-carrageenase bacteria strain by its 16S rDNA sequence and optimized the fermentation conditions using a response surface methodology. The results show that the hot-spring bacterium was 99% identical to Bacillus sp. and therefore we assigned it to the Bacillus genus and named it Bacillus sp. Car19 (GenBank accession number: KT865196). The optimized fermentation conditions of Bacillus sp. Car19 involve nine factors that affect Bacillus sp. Car19 carrageenase production, and the three main factors are culture temperature, Cu2+concentration, and NaCl concentration. Combined with subordinate factors, the final optimized fermentation conditions for maximal activity, as determined by regression analysis are as follows: a culture temperature of 52.31℃, a Cu2+concentration of 6.93 mmol/L, an NaCl concentration of 37.03 g/L, medium pH = 6, 1% inoculation quantity, 36 h incubation time, a galactose concentration of 0.3 g/L, an ammonium nitrate concentration of 7 g/L, and a carrageenan concentration of 0.5 g/L. The supernatant carrageenase activity after optimized fermentation can reach 15.82 U/mL, which is 1.5 times that without optimization.

Q178.53

A

1000-3096(2016)11-0007-10

10.11759/hykx20160125001

(本文編輯: 康亦兼)

2016-01-25;

2016-04-26

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201505026); 青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(14-2-4-14-jch); 國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(MBSMAT-2015-06)

[Foundation: Public Science and Technology Research Funds Project of Ocean (201505026); Qingdao Fundamental and Applied Research Project (14-2-4-14-jch); Key Lab of Marine Bioactive Substance and Modern Analytical Technique, SOA (MBSMAT-2015-06)]

謝買勝(1992-), 男, 江西九江人, 碩士研究生, 研究方向:極地微生物學(xué), E-mail: 903741992 @qq.com 電話: 13127057267; 李江, 通信作者, 副研究員, 博士, 研究方向: 極端微生物環(huán)境適應(yīng)性及其活性物質(zhì)研究, Email: lijiang@fio.org.cn