鄧益琴, 趙 哲 劉松林, 陳 償

(1. 中國(guó)科學(xué)院 南海海洋研究所, 中國(guó)科學(xué)院 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510301; 2. 中國(guó)科學(xué)院 南海海洋研究所, 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510301; 3. 中國(guó)科學(xué)院 南海海洋研究所, 西沙、南沙深海海洋環(huán)境觀(guān)測(cè)研究站, 廣東 廣州 510301; 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

不同碳源對(duì)溶藻弧菌黏附相關(guān)表型的影響初探及Hfq對(duì)其的調(diào)控

鄧益琴1,2,4, 趙 哲1,2, 劉松林1,4, 陳 償1,2,3

(1. 中國(guó)科學(xué)院 南海海洋研究所, 中國(guó)科學(xué)院 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510301; 2. 中國(guó)科學(xué)院 南海海洋研究所, 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510301; 3. 中國(guó)科學(xué)院 南海海洋研究所, 西沙、南沙深海海洋環(huán)境觀(guān)測(cè)研究站, 廣東 廣州 510301; 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

為探討不同碳源對(duì)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)黏附相關(guān)表型的影響及Hfq對(duì)其的調(diào)控作用,研究了D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-海藻糖和D-果糖對(duì)溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq缺失株及回補(bǔ)株的運(yùn)動(dòng)性、菌落形態(tài)、鞭毛、胞外多糖及生物膜合成的影響。研究結(jié)果顯示, 4種碳源均使溶藻弧菌群集運(yùn)動(dòng)(swarmming)顯著增強(qiáng)(P＜0.001), 并受Hfq正調(diào)控; 游動(dòng)性(swimming)顯著減弱(P＜0.01), 但不受Hfq調(diào)控; 菌落變得褶皺, 并受Hfq負(fù)調(diào)控; 4種碳源不影響溶藻弧菌鞭毛及胞外多糖合成, 但D-果糖使其生物膜合成減少, 并受Hfq負(fù)調(diào)控。實(shí)驗(yàn)分析表明: 4種碳源可能通過(guò)調(diào)控溶藻弧菌黏性阻力及能量代謝來(lái)調(diào)控其運(yùn)動(dòng)性; 并可能通過(guò)調(diào)控胞外多糖分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)影響其菌落形態(tài); 另外, D-果糖在調(diào)控生物膜形成過(guò)程中具有重要作用; 因此, 添加不同碳源會(huì)影響溶藻弧菌黏附相關(guān)表型, 可能影響其致病性, 但具體調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步研究。

碳源; 溶藻弧菌; Hfq; 黏附相關(guān)表型

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)致病過(guò)程包括黏附、侵襲、體內(nèi)增殖及產(chǎn)生毒素等一系列過(guò)程。其中, 溶藻弧菌的黏附力是決定其致病性的關(guān)鍵環(huán)節(jié),而細(xì)菌的黏附性與其運(yùn)動(dòng)性、胞外多糖合成以及生物膜形成密切相關(guān)[1-3]。

海洋細(xì)菌的側(cè)生鞭毛和端生鞭毛的動(dòng)力分別來(lái)自質(zhì)子(H+)動(dòng)力和鈉離子(Na+)依賴(lài)性動(dòng)力, 這與細(xì)菌的能量代謝尤其是碳源代謝密切相關(guān)[4]。碳源是合成細(xì)菌胞外多糖必需的營(yíng)養(yǎng)元素, 不同碳源可能使其合成的多糖在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等方面有所差異, 進(jìn)而對(duì)多糖生物活性產(chǎn)生影響, 如黏度, 抗氧化能力等[5-8]。生物膜的主要成分是多糖, 因此胞外多糖在生物膜的形成過(guò)程中具有重要作用[9]。例如胞外多糖參與前期黏附過(guò)程, 使得細(xì)菌更加緊密的黏附到固體表面; 增加細(xì)胞間的距離, 穩(wěn)定生物膜結(jié)構(gòu); 并參與細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸過(guò)程等[10-11]。此外,細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性也影響生物膜形成前期對(duì)固體表面的黏附[12]。研究表明, 分子伴侶Hfq缺失導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)葡萄糖、果糖等重要碳水化合物的利用減弱, 胞外多糖合成改變、運(yùn)動(dòng)能力和生物膜形成能力降低、毒性減弱甚至消失等[13-17]。因此, Hfq很可能通過(guò)調(diào)控細(xì)菌對(duì)不同碳源的利用, 從而調(diào)控其運(yùn)動(dòng)性、胞外多糖合成以及生物膜形成, 進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌黏附性而影響其致病性。

目前已有不少關(guān)于不同碳源對(duì)細(xì)菌胞外多糖、生物膜形成調(diào)控的研究, 如發(fā)酵乳桿菌、奇異變形桿菌、海洋假單胞菌等[1,18-20], 但相關(guān)研究在溶藻弧菌還未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于細(xì)菌黏附致病性, 研究不同碳源對(duì)致病性溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性、胞外多糖合成、生物膜形成的影響及分子伴侶Hfq在此過(guò)程中的調(diào)控作用, 以期初探不同碳源對(duì)溶藻弧菌黏附相關(guān)表型的調(diào)控, 進(jìn)而為探究碳源對(duì)溶藻弧菌的生理調(diào)控尤其是致病性調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)所用菌株: 溶藻弧菌野生株ZJ-T, hfq突變株Δhfq-T, hfq回補(bǔ)株hfq+-T見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑

結(jié)晶紫、甲醇、醋酸, 以及M63培養(yǎng)基各組分(3 g/LKH2PO4, 7 g/L K2HPO4, 2 g/L (NH4)2SO4, 0.5× 10-3g/L FeSO4, 30 g/L NaCl, 2×10-3mol/L MgSO4, 5×10-3g/L維生素B1, 添加0.4%濃度不同碳源: D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-果糖作為碳源)等生化試劑購(gòu)自廣州威佳公司。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株Tab. 1 Strains used in this study

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LBS(3%NaCL)培養(yǎng)基的組分蛋白胨、酵母粉和瓊脂粉購(gòu)自廣東環(huán)凱公司。

1.2 方法1.2.1 群集運(yùn)動(dòng)(swarmming)測(cè)定及其菌落形態(tài)觀(guān)測(cè)

將單個(gè)克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于30℃ 200 r/min 振搖培養(yǎng)過(guò)夜; 調(diào)整培養(yǎng)液濃度至相同吸光度(OD600nm= 1.0), 取5 μL平行3次點(diǎn)樣到LBS及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖的固體平板上測(cè)試其群集運(yùn)動(dòng), 30℃靜置培養(yǎng)48 h, 測(cè)量菌斑直徑, 同時(shí)觀(guān)察菌落形態(tài)。

1.2.2 游動(dòng)性(swimming)測(cè)定

將單個(gè)克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于30℃ 200 r/min 振搖培養(yǎng)過(guò)夜; 調(diào)整培養(yǎng)液濃度至相同吸光度(OD600nm= 1.0), 取5 μL平行3次點(diǎn)樣到LBS及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖的0.3%瓊脂半固體平板上測(cè)試其游動(dòng)性, 30℃靜置培養(yǎng)16 h, 測(cè)量菌斑直徑。

1.2.3 細(xì)菌鞭毛的透射電鏡觀(guān)測(cè)

將單個(gè)克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于30℃ 200 r/min 振搖培養(yǎng)過(guò)夜; 按1︰1000重新接菌于LBS及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖的新鮮液體培養(yǎng)基中, 30℃ 200 r/min振搖培養(yǎng)10 h后進(jìn)行負(fù)染, 用日本日立公司H-7650型透射電鏡拍攝細(xì)菌鞭毛。

1.2.4 細(xì)菌胞外多糖(Extracellular polysaccharide, ECPs)的定量分析

將單個(gè)克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于30 200 ℃r/min振搖培養(yǎng)過(guò)夜。取5 μL平行3次點(diǎn)樣到LBS及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖的固體平板上, 30℃靜置培養(yǎng)48 h后將菌落刮取至4 mmol/L EDTA中, 重懸并調(diào)整培養(yǎng)液濃度至相同OD600nm吸光度, 并用阿爾新藍(lán)法定量細(xì)菌胞外多糖OD620nm[21], 最后胞外多糖分泌量歸一化為OD620nm/OD600nm。

1.2.5 生物膜形成實(shí)驗(yàn)

將單個(gè)克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于30℃ 200 r/min 振搖培養(yǎng)過(guò)夜, 6000 r/min 3 min離心收集細(xì)菌細(xì)胞, 用無(wú)碳源的M63培養(yǎng)基洗滌兩次后重懸, 并調(diào)整細(xì)菌濃度至相同吸光度(OD600nm=1.0)。按1 mL/孔用量于24孔培養(yǎng)板中加入不同碳源作為碳源的M63 培養(yǎng)基, 同一菌株平行3次分別將10 μL調(diào)試菌液加到1 mL培養(yǎng)基中, 30℃靜置培養(yǎng)。于4, 8, 12, 24, 36, 48 h取樣, 利用結(jié)晶紫染色法定量測(cè)定生物膜生成量OD590nm。結(jié)晶紫染色法操作參見(jiàn)CHEN等[22]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次以上, 使用統(tǒng)計(jì)分析軟件IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行單因素方差LDS分析, P＜0.05被認(rèn)為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)溶藻弧菌群集運(yùn)動(dòng)及菌落形態(tài)的調(diào)控

在LBS及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖的固體平板上, hfq缺失均造成溶藻弧菌群集運(yùn)動(dòng)能力顯著下降(P＜0.001); 在hfq+-T中, 運(yùn)動(dòng)能力的缺失得到回補(bǔ)(圖1A, 1B)。此外, LBS平板中添加所測(cè)試的不同碳源后, 野生株及回補(bǔ)株群集運(yùn)動(dòng)能力相對(duì)于LBS平板呈現(xiàn)顯著上升(P＜0.001), 而hfq缺失株群集運(yùn)動(dòng)能力變化不顯著(P＞0.05)(圖1A, 1B)。結(jié)果說(shuō)明, 所測(cè)試的不同碳源正調(diào)控溶藻弧菌的群集運(yùn)動(dòng), 并且這種調(diào)控作用受到Hfq的促進(jìn)。

在LBS平板上分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖后, 均使hfq缺失株Δhfq-T菌落變得褶皺, 相對(duì)其他碳源的菌落發(fā)生褶皺時(shí)間為48 h, 添加0.4%D-果糖后褶皺出現(xiàn)更快為24 h, 而野生株ZJ-T及hfq回補(bǔ)株hfq+-T的菌落形態(tài)不變, 與LBS平板上表現(xiàn)一致, 菌落光滑透明(圖2)。這說(shuō)明所測(cè)試的不同碳源調(diào)控溶藻弧菌的菌落形態(tài), 并且這種調(diào)控作用受到Hfq的抑制。

圖1 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和 hfq+-T在LBS, 以及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖固體平板上的群集運(yùn)動(dòng)(A)及統(tǒng)計(jì)分析(B)Fig. 1 Swarming of ZJ-T, Δhfq-T, and hfq+-T on LBS and LBS plus 0.4% D-Glucose, 0.4% D-Maltose, 0.4% D-Trehalose or 0.4% D-Fructose agar plates (A) and statistical analysis (B)

2.2 不同碳源對(duì)溶藻弧菌游動(dòng)性的調(diào)控

在LBS及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖的0.3%瓊脂半固體平板上, hfq缺失均造成溶藻弧菌游動(dòng)能力顯著下降(P＜0.001); 在hfq+-T中, 運(yùn)動(dòng)能力的缺失得到回補(bǔ)(圖3A, 3B)。此外, LBS 0.3%瓊脂半固體平板中添加所測(cè)試的不同碳源后, 野生株ZJ-T、hfq缺失株Δhfq-T及回補(bǔ)株hfq+-T游動(dòng)能力相對(duì)于LBS 0.3%瓊脂半固體均呈現(xiàn)顯著下降(P＜0.01)(圖3A, 3B)。以上結(jié)果說(shuō)明, 所測(cè)試的不同碳源負(fù)調(diào)控溶藻弧菌的游動(dòng)性, 但這種調(diào)控作用不受Hfq的影響。

圖2 溶藻弧菌hfq缺失株Δhfq-T在LBS, 以及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖固體平板上的菌落形態(tài)(300%縮放比例)Fig. 2 Colony morphology of Vibrio alginolyticus hfq mutant strain Δhfq-T on LBS and LBS plus 0.4% D-Glucose, 0.4% D-Maltose, 0.4% D-Trehalose, or 0.4% D-Fructose agar plates. (Scale: 300%)

圖3 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和 hfq+-T在LBS, 以及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖固體平板上的游動(dòng)性(A)及統(tǒng)計(jì)分析(B)Fig. 3 Swimming of ZJ-T, Δhfq-T, and hfq+-T on LBS and LBS plus 0.4% D-Glucose, 0.4% D-Maltose, 0.4% D-Trehalose or 0.4% D-Fructose agar plates (A) and statistical analysis (B)

2.3 不同碳源對(duì)溶藻弧菌鞭毛合成的調(diào)控

透射電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)(圖4), 溶藻弧菌野生株ZJ-T、hfq缺失株Δhfq-T及回補(bǔ)株hfq+-T在LBS及LBS分別添加0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖的液體培養(yǎng)基中, 均具有端生鞭毛, 且細(xì)胞大小形態(tài)差異較小, 均短小并彎曲成弧形。這說(shuō)明在溶藻弧菌中, 所測(cè)試的碳源并不直接調(diào)控鞭毛合成的相關(guān)基因, 溶藻弧菌的運(yùn)動(dòng)性表型的調(diào)控可能涉及多個(gè)因子的參與。

2.4 不同碳源對(duì)溶藻弧菌胞外多糖合成的調(diào)控

從圖5中可見(jiàn), hfq缺失后使得細(xì)菌胞外多糖的合成顯著增加, 約為野生株ZJ-T及回補(bǔ)株hfq+-T的兩倍; 但在LBS添加不同碳源: 0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖的固體平板中, 30℃靜置培養(yǎng)48 h后, 這種增加的趨勢(shì)沒(méi)有改變, 且同一菌株在不同培養(yǎng)基中胞外多糖合成量也幾乎不變。這說(shuō)明在溶藻弧菌中, 所測(cè)試的碳源并不直接調(diào)控細(xì)菌胞外多糖的合成。

圖4 不同培養(yǎng)基中溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和 hfq+-T端生鞭毛的透射電鏡觀(guān)測(cè)(ZJ-T: a-e, a: 5.0K, b: 4.0K, c: 5.0K, d: 5.0K, e: 5.0K; Δhfq-T: f-j, f: 5.0K, g: 2.0K, h: 5.0K, i: 5.0K, j: 2.0K; hfq+-T: k-o, k: 5.0K, l: 3.0K, m: 5.0K, n: 5.0K, o: 5.0K; 1.0K=放大1000倍)Fig. 4 Observation of polar flagella by a Hitachi H-7650 TEM in ZJ-T, Δhfq-T, and hfq+-T in different media. (ZJ-T: a-e, a: 5.0 K, b: 4.0 K, c: 5.0 K, d: 5.0 K , e: 5.0 K; Δhfq-T: f-j, f: 5.0 K, g: 2.0 K, h: 5.0 K, i: 5.0 K , j: 2.0 K; hfq+-T: k-o, k: 5.0 K, l: 3.0 K, m: 5.0 K, n: 5.0 K , o: 5.0 K; 1.0 K = 1000 magnification)

2.5 不同碳源對(duì)溶藻弧菌生物膜合成的調(diào)控

在細(xì)菌生物膜形成的動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)中, 可見(jiàn)hfq缺失后并不影響生物膜成熟的時(shí)間, 仍可在M63添加不同碳源: 0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖、0.4%D-果糖的培養(yǎng)基中, 30℃靜置培養(yǎng)12 h后到達(dá)頂峰,但hfq的缺失使得成熟期生物膜生成量顯著下降, 且其前期的合成速度以及后期的解離速度均下降(圖6)。此外, hfq缺失株Δhfq-T在以0.4%D-果糖為碳源的M63培養(yǎng)基中成熟期的生物膜生成量較以0.4%D-葡萄糖、0.4%D-麥芽糖、0.4%D-海藻糖為碳源時(shí)低; 而單獨(dú)的野生株ZJ-T或者h(yuǎn)fq缺失株Δhfq-T, 在4種碳源分別存在時(shí), 成熟期生物膜生成量、前期合成速度及后期解離速度都基本不變(圖7)。

以上結(jié)果說(shuō)明, D-果糖可能參與調(diào)控溶藻弧菌生物膜的合成, 并且這種調(diào)控作用受Hfq抑制。

3 討論

所測(cè)試的四種不同碳源: D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-果糖均使得溶藻弧菌野生株游動(dòng)性顯著下降(P＜0.001)并不受Hfq的調(diào)控, 而群集運(yùn)動(dòng)顯著增加(P＜0.01)并受Hfq的促進(jìn)性調(diào)控, 而在任意同一培養(yǎng)基中, hfq缺失后使得溶藻弧菌游動(dòng)性和群集運(yùn)動(dòng)均顯著下降。運(yùn)動(dòng)能力是細(xì)菌尤其是病原菌趨化作用、黏附和侵入的必要條件, 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力主要由鞭毛驅(qū)動(dòng), 且質(zhì)子(H+)動(dòng)力和鈉離子(Na+)依賴(lài)性動(dòng)力等均可影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力[4]。溶藻弧菌在半固體環(huán)境中其運(yùn)動(dòng)性表現(xiàn)為游動(dòng)性, 而在固體環(huán)境中表現(xiàn)為群集運(yùn)動(dòng), 且群集運(yùn)動(dòng)耐受黏度環(huán)境的能力比游動(dòng)性強(qiáng)[23]。這里所測(cè)試的4種碳源并沒(méi)有影響其鞭毛的合成, 因此, 在半固體環(huán)境且鈉離子(Na+)不改變的情況下, 所測(cè)試的碳源可能主要通過(guò)增加細(xì)菌表面黏性阻力從而減弱其游動(dòng)性[23-25]; 而在固體環(huán)境下則主要通過(guò)增強(qiáng)細(xì)菌能量代謝從而提高其質(zhì)子(H+)動(dòng)力來(lái)增強(qiáng)其群集運(yùn)動(dòng)[4]。此外, 根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室已有研究, hfq缺失后, 導(dǎo)致包括4個(gè)拷貝的fliC(flagellin)基因, 3個(gè)拷貝的mcp(methyl-accepting chemotaxis protein)基因, 馬達(dá)蛋白基因motA/motB以及趨化蛋白基因cheB/cheM等11個(gè)運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá), 因此Hfq很可能通過(guò)調(diào)控動(dòng)力基因表達(dá), 而不影響鞭毛組裝來(lái)調(diào)控溶藻弧菌運(yùn)動(dòng)性; 且Hfq還可通過(guò)調(diào)控碳運(yùn)輸和代謝等過(guò)程相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而起到促進(jìn)作用, 這與根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的研究結(jié)果相似[15-16]; 因此, 從運(yùn)動(dòng)性角度出發(fā), 4種碳源可能參與了溶藻弧菌的致病性調(diào)控, 且Hfq體現(xiàn)了其輔助調(diào)控作用。

圖5 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T在不同培養(yǎng)基中細(xì)菌胞外多糖的合成Fig. 5 Extracellular polysaccharide synthesis of ZJ-T, Δhfq-T, and hfq+-T in different media

圖6 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和 hfq+-T細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的細(xì)菌生物膜形成動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)Fig. 6 Kinetic biofilm formation of ZJ-T, Δhfq-T, and hfq+-T in different media

圖7 不同碳源存在情況下, 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T細(xì)胞生物膜形成動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)Fig. 7 Kinetic biofilm formation of ZJ-T and Δhfq-T with different carbon sources

hfq缺失后, 4種碳源的存在使得溶藻弧菌在固體平板上菌落變得褶皺, 這種褶皺表型被認(rèn)為與胞外多糖密切相關(guān)[26]。根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室已有研究, hfq缺失后, 溶藻弧菌在LB(1%NaCL)平板上菌落變得褶皺, 且胞外多糖合成減少; 這里在LBS(3%NaCL)平板上, hfq缺失后菌落并未變得褶皺, 且胞外多糖合成增加, 因此, 鹽度會(huì)影響胞外多糖合成量, 進(jìn)而影響菌落表型[6]。該研究顯示, 在D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-果糖存在情況下, 溶藻弧菌胞外多糖的合成量并沒(méi)有顯著變化, 因此, 該研究中菌落褶皺并非由胞外多糖量變引起。REZENDE 等的研究表明, 褶皺表型表現(xiàn)出更強(qiáng)的附著能力[27]。FUKUDA、陳曉紅等的研究結(jié)果表明不同碳源培養(yǎng)得到的細(xì)菌胞外多糖分子組成與分子質(zhì)量等存在差異, 而這與胞外多糖黏度變化有著一定聯(lián)系, 一般分子質(zhì)量越大, 多糖黏度越大[6-7], 并在乳酸桿菌中發(fā)現(xiàn), 以果糖為碳源時(shí)合成的胞外多糖分子質(zhì)量相對(duì)葡萄糖和麥芽糖更大[6], 該研究發(fā)現(xiàn)添加D-果糖后, 細(xì)菌菌落褶皺發(fā)生時(shí)間僅為添加其他碳源的1/2,這可能與合成的胞外多糖分子質(zhì)量更大, 進(jìn)而導(dǎo)致黏度更大相關(guān)。因此, 所測(cè)試的4種碳源可能通過(guò)改變胞外多糖的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì), 影響其黏度,從而致使溶藻弧菌菌落表現(xiàn)褶皺[27], 這可能調(diào)控其致病性。

運(yùn)動(dòng)性和胞外多糖都參與調(diào)控細(xì)菌生物膜形成前期對(duì)固體表面的黏附, 并且胞外多糖還通過(guò)增加細(xì)胞間距離以穩(wěn)定生物膜結(jié)構(gòu)而參與生物膜成熟過(guò)程, 且這些過(guò)程與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)[10-11,28-29]。研究表明, ZJ-T或者Δhfq-T, 在4種碳源分別存在時(shí),成熟期生物膜生成量、前期合成速度及后期解離速度都基本不變; 而任何一種碳源存在情況下, hfq缺失株成熟期生物膜生成量、前期合成速度和后期解離速度相對(duì)野生株ZJ-T均下降。因此, hfq缺失造成細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力下降從而很可能影響細(xì)胞前期的附著,而細(xì)胞附著后的生物膜成熟過(guò)程, 還需要細(xì)菌分泌的胞外多糖等生物膜基質(zhì)組分參與。此外, 最后的細(xì)菌脫離即生物膜解離階段, 是單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞或多細(xì)胞團(tuán)脫離到環(huán)境中, 并在新的固體表面開(kāi)始附著的過(guò)程[2]。長(zhǎng)時(shí)間的聚集導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物的匱乏和代謝廢物的累積, 將激發(fā)生物膜內(nèi)的細(xì)菌產(chǎn)生解離因子, 通過(guò)釋放單個(gè)細(xì)胞或小塊生物膜可獲得更多的營(yíng)養(yǎng)[12,30]。根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室已有研究, hfq缺失后, 溶藻弧菌在不同碳源培養(yǎng)基中, 相對(duì)野生菌株生長(zhǎng)潛伏期延長(zhǎng)、對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率減慢, 且穩(wěn)定期細(xì)胞密度降低。因此,相對(duì)野生菌株, hfq缺失株出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)缺乏的時(shí)間延長(zhǎng),且相關(guān)解離因子的形成能力減弱, 從而很可能導(dǎo)致其后期生物膜解離速度下降。另外, 在以0.4%D-果糖為碳源的情況下, hfq缺失后, 其成熟期生物膜生成量減少最多, 因此D-果糖在Hfq抑制作用下減少了溶藻弧菌生物膜的合成, 從而很有可能參與調(diào)控溶藻弧菌的致病性。

4 結(jié)論

D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-果糖通過(guò)增加溶藻弧菌表面黏附阻力從而減弱其游動(dòng)性; 增強(qiáng)能量代謝進(jìn)而提高其群集運(yùn)動(dòng); 并且很可能通過(guò)改變胞外多糖的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì), 如分子質(zhì)量,進(jìn)而改變其黏度, 使得細(xì)菌菌落表現(xiàn)褶皺; D-果糖還有可能通過(guò)減少溶藻弧菌生物膜的合成而參與調(diào)控其致病性。分子伴侶Hfq也在其中體現(xiàn)了其多效性的調(diào)控作用。具體調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步研究, 并在基因水平深入探討。該研究為進(jìn)一步探討其它碳源對(duì)溶藻弧菌的生理調(diào)控尤其是致病性調(diào)控提供了理論指導(dǎo)。

[1] Moryl M, Kaleta A, Strzelecki K, et al. Effect of nutrient and stress factors on polysaccharides synthesis in Proteus mirabilis biofilm[J]. Acta Biochimica Polonica, 2014, 61(1): 133-139.

[2] 干霞芳, 李蒙英. 生物膜和生物膜形成菌的研究 [J].安徽大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版), 2007, 31(6): 91-94. Gan Xiafang, Li Mengying. Research progress on biofilm and biofilm-forming bacterium[J]. Journal of Anhui University (Natural Science Edition), 2007, 31(6): 91-94.

[3] 陳強(qiáng), 鄢慶枇, 馬甡. 溶藻弧菌致病性研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué), 2006, 30(8): 83-89. Chen Qiang, Yan Qingpi, Ma Shen. Progress on pathogenicity research of Vibrio alginolyticus[J]. MarineSciences, 2006, 30(8): 83-89.

[4] 鄧國(guó)宏, 徐啟旺, 劉俊康, 等. 細(xì)菌鞭毛馬達(dá)——種卓越的分子機(jī)器[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2000, 27(6): 612-615. Deng Guohong, Xu Qiwang, Liu Junkang, et al. Bacterial Flagellar Motor: A Splendid Molecular Motor[J]. Progress In Biochemistry and Biophysics, 2000, 27(6): 612-615.

[5] Rao Y M, Suresh, A K, Suraishkumar G K. Free radical aspects of Xanthomonas campestris cultivation with liquid phase oxygen supply strategy[J]. Process Biochemistry, 2003, 38(9): 1301-1310.

[6] 陳曉紅, 董明盛, 黃文利, 等. 不同碳源對(duì) Lactococcus FML02-8 合成胞外多糖的影響[J]. 無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 食品與生物技術(shù), 2004, 23(6): 13-17. Chen Xiaohong, Dong Mingsheng, Huang Wenli, et al. Effect of Carbon Sources on Exopolysaccharides Produced by Lactococcus FML02-8 [J]. Journal of Wuxi University of Light Industry, 2004, 23(6): 13-17.

[7] Fukuda K, Shi T, Nagami K, et al. Effects of carbohydrate source on physicochemical properties of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus fermentum TDS030603 in a chemically defined medium [J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 79(4): 1040-1045.

[8] 孫海紅, 毛文君, 錢(qián)葉苗, 等. 海洋微生物活性胞外多糖的研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 2011, 35(11): 134-138. Sun Haihong, Mao Wenjun, Qian Yemiao, et al. Advances on the characteristics and bioactivities of exopolysaccharides from marine microorganism[J]. Marine Sciences, 2011, 35(11): 134-138.

[9] 李江, 陳靠山, 郝林華, 等. 細(xì)菌胞外多糖的研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 2006, 30(4): 74-77. Li Jiang, Chen Kaoshan, Hao Linhua, et al. The progress on extracellular polysaccharide of bacteria[J]. Marine Sciences, 2006, 30(4): 74-77.

[10] Sutherland I W. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework[J]. Microbiology, 2001, 147(1): 3-9.

[11] Nwodo U U, Green E, Okoh A I. Bacterial exopolysaccharides: functionality and prospects[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(11): 14002-14015.

[12] Davey M E, O'toole G A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics [J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2000, 64(4): 847-867.

[13] Chiang M K, Lu M C, Liu L C, et al. Impact of Hfq on global gene expression and virulence in Klebsiella pneumoniae [J]. PloS One, 2011, 6(7): e22248.

[14] Cui M, Wang T, Xu J, et al. Impact of Hfq on global gene expression and intracellular survival in Brucella melitensis[J]. PloS One, 2013, 8(8): e71933.(doi: 10.1371/journal.pone.0071933)

[15] M?ller P, Overl?per A, F?rstner K U, et al. Profound impact of Hfq on nutrient acquisition, metabolism and motility in the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens[J]. PLoS One, 2014, 9(10): e110427. (doi: 10.1371/ journal.pone.0110427)

[16] Arce-rodríguez A, Calles B, Nikel P I, et al. The RNA chaperone Hfq enables the environmental stress tolerance super-phenotype of Pseudomonas putida [J]. Environmental Microbiology, 2015. (doi: 10.1111/1462-2920.13052)

[17] Liu H, Wang Q, Liu Q, et al. Roles of Hfq in the stress adaptation and virulence in fish pathogen Vibrio alginolyticus and its potential application as a target for live attenuated vaccine [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 91(2): 353-364.

[18] 辛躍強(qiáng), 梁榮榮, 王瑞明. 低聚半乳糖對(duì)腸道益生菌產(chǎn)胞外多糖作用的研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31(6): 144-150. Xin Yueqiang, Liang Rongrong, Wang Ruiming. Effects of Galactooligosaccharide on Exopolysaccharide Produced by Intestinal Probiotics[J]. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(6): 144-150.

[19] 張萃逸, 張培帥, 朱駿, 等. 基于不同碳源的生物膜特性分析[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012, 41(2): 186-195. Zhang Cuiyi, Zhang Peishuai, Zhu Jun, et al. Analysis on biofilm property based on different carbon source[J]. Journal of Shanghai Normal University (Natural Sciences), 2012, 41(2): 186-195.

[20] 張佳佳, 屈菲, 萬(wàn)慧萍, 等. 不同碳源對(duì)海洋假單胞菌 PT-8 合成胞外多糖的抗氧化性的影響 [J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 32(6): 413-416. Zhang Jiajia, Qu Fei, Wan Huiping, et al. Effect of different carbon sources on oxidation of the Pseudomonas PT-8 extracellular polysaccharide[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2013, 32(6): 413-416.

[21] Croxatto A, Lauritz J, Chen C, et al. Vibrio anguillarum colonization of rainbow trout integument requires a DNA locus involved in exopolysaccharide transport and biosynthesis[J]. Environmental Microbiology, 2007, 9(2): 370-382.

[22] Chen C, Jie J, Hu C Q. Phenotypic and genetic differences between opaque and translucent colonies of Vibrio alginolyticus[J]. Biofouling, 2009, 25(6): 525-531.

[23] Atsumi T, Maekawa Y, Yamada T, et al. Effect of viscosity on swimming by the lateral and polar flagella of Vibrio alginolyticus[J]. Journal of Bacteriology, 1996, 178(16): 5024-5026.

[24] Magariyama Y, Sugiyama S, Muramoto K, et al. Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed[J]. Biophysical Journal, 1995, 69(5): 2154-2162.

[25] Kawagishi I, Imagawa M, Imae Y, et al. The so-dium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression[J]. Molecular Microbiology, 1996, 20(4): 693-699.

[26] Yildiz fh, Liu X S, Heydorn A, et al. Molecular analysis of rugosity in a Vibrio cholerae O1 El Tor phase variant[J]. Molecular Microbiology, 2004, 53(2): 497-515.

[27] De rezende C E, Anriany Y, Carr L E, et al. Capsular polysaccharide surrounds smooth and rugose types of Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(11): 7345-7351.

[28] 滕勇勇, 王琪, 吳雷, 等. 致病性弧菌的生物學(xué)特性和致病因子研究進(jìn)展[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 14(010): 1396-1398. Teng Yongyong, Wang Qi, Wu Lei, et al. The progress of biological characteristics and virulence factors of pathogenic Vibrios[J]. Journal of Tropical Medicine, 2014, 14(010): 1396-1398.

[29] Wyckoff E E, Allred B E, Raymond K N, et al. Catechol Siderophore Transport by Vibrio cholerae[J]. Journal of Bacteriology, 2015, 197(17): 2840-2849.

[30] 歐美珍, 凌均棨. D-型氨基酸對(duì)細(xì)菌生物膜解離分散的作用[J]. 國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 42(2): 203-205. Ou Meizhen, Ling Junqi. Effects of D-type amino acids on biofilm dissociation[J]. International Journal of Stomatology, 2015, 42(2): 203-205.

Received: Feb. 25, 2016

Preliminary research of effect of different carbon sources on adhesion-related phenotypes in Vibrio alginolyticus

DENG Yi-qin1,2,4, ZHAO Zhe1,2, LIU Song-lin1,4, CHEN Chang1,2,3
(1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 3. Xisha/Nansha Ocean Observation and Research Station, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

carbon sources; Vibrio alginolyticus; Hfq; adhesion related phenotypes

To gain insight into regulation by different carbon sources and Hfq on adhesion-related phenotypes in Vibrio alginolyticus, we studied the effects of D-Glucose, D-Maltose, D-Trehalsoe, and D-Fructose on the motility, colony morphology, flagella, extracellular polysaccharides (ECPs), and synthesis of biofilm in V. alginolyticus wild type ZJ-T and hfq mutant and complementary strains. The results show that the addition of each of these four carbon sources may significantly increase swarming ability (P ＜ 0.001), which was also positively regulated by Hfq; significantly reduce swimming ability (P ＜ 0.01), which was not affected by Hfq; and wrinkle the colony, which was negatively regulated by Hfq. These four carbon sources did not affect the synthesis of flagella and ECPs but D-Fructose decreased the synthesis of biofilm that was negatively regulated by Hfq. Our study indicates that these four carbon sources regulate the motility of V. alginolyticus possibly by regulating their viscous resistance and energy metabolism. They also affect colony morphology possibly by regulating the molecular structure and physicochemical properties of ECPs. Furthermore, D-Frutose plays an important role in the synthesis of biofilm. Simultaneously, these four carbon sources regulate adhesion-related phenotypes in V. alginolyticus and are speculated to affect its virulence. The regulation mechanisms should be further studied.

Q939.99

A

1000-3096(2016)11-0099-09

10.11759/hykx20160225001

(本文編輯: 康亦兼)

2016-02-25;

2016-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272697, 41276163); 廣州市珠江科技新星項(xiàng)目(2013J2200094); 廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B030301064) [Foundation: National Natural Science Foundation of China, No.31272697, No.41276163; Project of Science and Technology New Star of Zhujiang in Guangzhou city, No.2013J2200094; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China, No.2014B030301064]

鄧益琴(1990-), 女, 江西撫州人, 博士研究生, 主要從事海洋微生物研究, 電話(huà): 020-89023216, E-mail: yiqindd@163.com; 陳償, 通信作者, 研究員, 主要從事海洋微生物研, 電話(huà): 020-89235772, E-mail: chen.chang@scsio.ac.cn