姒蜜思賴愷晨石 玨夏佳佳程志鵬

大鼠鼻竇黏膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和成骨能力研究

姒蜜思1賴愷晨2石 玨3夏佳佳4程志鵬1

目的明確大鼠鼻竇結(jié)構(gòu)，嘗試體外分離培養(yǎng)鼻竇黏膜干細(xì)胞，檢測(cè)其多向分化能力，為口腔頜面部骨缺損修復(fù)治療的體外研究尋找新的種子細(xì)胞。方法選用3月齡SD大鼠，進(jìn)行口腔頜面部和鼻竇解剖，制作冠狀位石蠟切片觀察鼻竇形態(tài)和黏膜成分。取鼻竇內(nèi)襯黏膜，改良酶消化法進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞（SMSCs）分離培養(yǎng)，檢測(cè)其成克隆能力，使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定。油紅O染色檢測(cè)SMSCs的成脂肪能力，茜素紅染色和堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)試檢驗(yàn)SMSCs的成骨能力，并與大鼠牙齦來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（GMSCs）、大鼠骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）比較。結(jié)果SD大鼠具有結(jié)構(gòu)清晰的上頜竇，竇腔內(nèi)襯黏膜呈現(xiàn)典型的三層結(jié)構(gòu)。使用該內(nèi)襯黏膜能夠成功分離培養(yǎng)出具有多向分化能力和成克隆能力且?guī)в虚g充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的SMSCs細(xì)胞。在成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，SMSCs胞外基質(zhì)礦化能力與GMSCs和BMSCs相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＞0.05）。但14天時(shí)SMSCs的ALP活性顯著大于GMSCs（孕＜0.05）。結(jié)論SD大鼠鼻竇內(nèi)襯黏膜可成功分離培養(yǎng)出具有體外成骨能力的間充質(zhì)干細(xì)胞，為口腔頜面部骨組織工程研究提供新的細(xì)胞選擇。

大鼠；鼻竇黏膜；間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞分化；骨組織工程

上頜后牙區(qū)骨量不足是口腔種植修復(fù)治療中的常見(jiàn)問(wèn)題，臨床上常使用提升上頜竇黏膜進(jìn)行骨增量的方法來(lái)保證種植體的成功植入。雖然上頜竇黏膜提升術(shù)的治療方法多樣，但竇腔內(nèi)成骨效果并不穩(wěn)定[1]。研究[2-3]表明，上頜竇黏膜中可能存在具有成骨潛力的間充質(zhì)干細(xì)胞（SMSCs），對(duì)竇腔內(nèi)新骨生成起到關(guān)鍵作用。如何激發(fā)SMSCs的成骨潛力，加速上頜竇黏膜下骨新生，保證上頜后牙區(qū)種植體功能長(zhǎng)期穩(wěn)定是目前國(guó)際研究的熱點(diǎn)。然而，由于倫理學(xué)限制，很難取得健康人上頜竇黏膜組織用于體內(nèi)外研究。尋找易于獲取、與人相近的動(dòng)物替代模型，并使用便捷可靠的方法對(duì)SMSCs進(jìn)行分離和體外培養(yǎng)，全面了解其細(xì)胞特征和成骨分化能力，是相關(guān)研究開(kāi)展的基礎(chǔ)。本研究觀察和分析大鼠鼻竇的解剖結(jié)構(gòu)和黏膜成分，并從大鼠鼻竇黏膜中嘗試分離SMSCs，研究其細(xì)胞行為和多向分化能力，并與骨髓來(lái)源和牙齦來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs和GMSCs）進(jìn)行比較。本研究擬從微觀角度對(duì)臨床和動(dòng)物研究中觀察到的上頜竇黏膜成骨作用做出初步解釋，并為進(jìn)一步利用SMSCs作為種子細(xì)胞、開(kāi)發(fā)適用于口腔及頭面部骨缺損修復(fù)的新型組織工程材料做好準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:3月齡雄性SD大鼠8只，平均體質(zhì)量250g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（許可證號(hào):SCXK滬2012-0002），飼養(yǎng)于浙江大學(xué)動(dòng)物中心。主要試劑:α-MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）、Dispase酶（美國(guó)Sigma公司）、I型膠原酶（美國(guó)Sigma公司）、流式細(xì)胞分析單克隆抗體（美國(guó)R&D Systems公司）、甲苯胺藍(lán)染色液、茜素紅染色液、油紅O染色液、堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒等（均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司）。主要儀器:流式細(xì)胞分析儀（FC500MCL，美國(guó)Beckman Coulter）、體視顯微鏡（日本Olympus）、倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）、多光譜酶標(biāo)系統(tǒng)（Tecan，infinite，m200，瑞士TECAN）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠鼻竇及內(nèi)襯黏膜的觀察分析 取3月齡雄性SD大鼠，水合氯醛過(guò)量麻醉處死后，在體式顯微鏡下截取整個(gè)頭骨和上頜，盡量剔除外表面軟組織。使用10%福爾馬林固定，酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋后行冠狀位切片固定。制作好的石蠟切片使用蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察鼻竇結(jié)構(gòu)和內(nèi)襯黏膜成分。

1.2.2 大鼠SMSCs的分離培養(yǎng) （1）改良酶消化法原代培養(yǎng):取3月齡雄性SD大鼠5只，按上述方法處死后，在75%酒精中浸泡消毒約5min后移至超凈臺(tái)，并解剖鼻腔及鼻旁竇。小心剝離鼻竇腔內(nèi)襯黏膜，置于含抗生素的磷酸緩沖液（PBS）中反復(fù)沖洗，加4mg/mL的Dispase，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化30min。體式顯微鏡下分離棄去上皮層，并將剩下的組織盡可能剪碎，加入3mg/mL的I型膠原酶置培養(yǎng)箱中繼續(xù)消化20min。加入含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，直至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合（此時(shí)為P0）。（2）單克隆培養(yǎng):取上述P0細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度并接種于96孔板中，保證每孔1～2個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合長(zhǎng)至孔底1/2時(shí)，將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)（P1）。

1.2.3 大鼠SMSCs表面標(biāo)志物鑒定 使用流式細(xì)胞分選技術(shù)（FACS）檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志物。使用的細(xì)胞表面特異性單克隆抗體有:CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、STRO-1。

1.2.4 大鼠SMSCs成克隆能力分析 取P2代SMSCs細(xì)胞，按1×103個(gè)/皿接種于10cm的培養(yǎng)皿中，加10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)14天，使用4%多聚甲醛室溫固定、甲苯胺藍(lán)染色后觀察細(xì)胞克隆形態(tài)。大于50個(gè)細(xì)胞的集落記為1個(gè)克隆，計(jì)算細(xì)胞克隆形成效率?？寺⌒纬陕?細(xì)胞克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 大鼠SMSCs、GMSCs和BMSCs的多向分化能力比較

1.2.5.1 大鼠 GMSCs和 BMSCs獲取 在獲取SMSCs的同時(shí)進(jìn)行大鼠GMSCs和BMSCs分離。按上述方法處死3月齡SD雄性大鼠后，切取雙側(cè)磨牙周?chē)例l組織。使用改良酶消化法（同SMSCs）進(jìn)行GMSCs原代培養(yǎng)。同時(shí)無(wú)菌取出完整脛骨和股骨，剔除軟組織及兩端部分骨組織，露出骨髓腔。用一次性無(wú)菌注射器吸取新鮮α-MEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，將細(xì)胞沖洗液置培養(yǎng)皿中進(jìn)行BMSCs原代培養(yǎng)。獲取原代GMSCs和BMSCs后再進(jìn)行單克隆培養(yǎng)和表面標(biāo)志物鑒定。

1.2.5.2 成骨分化能力鑒定 在α-MEM培養(yǎng)基中加入10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μmol/L維生VC、0.1μmol/L地塞米松、10%FBS制成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。使用α-MEM培養(yǎng)基作為非誘導(dǎo)性對(duì)照培養(yǎng)基。將P2代SMSCs、GMSCs和BMSCs按5×104個(gè)/孔分別接種于6孔板中，使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和非誘導(dǎo)性培養(yǎng)基培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第7天和第14天使用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定ALP濃度和總蛋白濃度，按ALP/BCA計(jì)算出ALP的相對(duì)濃度，代表培養(yǎng)物的ALP活性。在培養(yǎng)的第21天使用茜素紅染色觀察胞外基質(zhì)礦化情況。

1.2.5.3 成脂分化能力鑒定 在α-MEM培養(yǎng)基中加入1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L甲基黃嘌呤異丁酯、10μmol/L胰島素、200μmol/L吲哚美辛、10%FBS制成成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。使用α-MEM培養(yǎng)基作為非誘導(dǎo)性對(duì)照培養(yǎng)基。將P2代SMSCs、GMSCs和BMSCs按5×104個(gè)/孔分別接種于6孔板中，使用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基和非誘導(dǎo)性培養(yǎng)基培養(yǎng)28天。使用4%多聚甲醛室溫固定、0.05%油紅O染色后觀察培養(yǎng)物中脂滴形成情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s） 表示。檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性，并使用One-way-ANOVA進(jìn)行組間比較，需多重比較時(shí)使用Bonferroni法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠鼻竇結(jié)構(gòu)及內(nèi)襯黏膜成分 大體解剖見(jiàn)SD大鼠鼻道外側(cè)有“小室”樣的鼻旁竇結(jié)構(gòu)，與鼻道間有不完整的薄層骨壁相隔。鼻道和鼻竇腔內(nèi)面有薄紗狀內(nèi)襯黏膜，表面有少量黏液。顯微鏡下觀察大鼠頭骨冠狀位切片，可見(jiàn)鼻道旁鼻竇樣結(jié)構(gòu)（大鼠上頜竇，圖1A，見(jiàn)封二），與鼻道有交通。鼻竇內(nèi)襯黏膜呈現(xiàn)典型的三層結(jié)構(gòu)，自腔內(nèi)面至骨面依次為:假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮、富含血管和小腺體的黏膜下層、緊貼骨面的骨膜樣結(jié)構(gòu)（圖1B，見(jiàn)封二）。

2.2 大鼠SMSCs表面標(biāo)志物和成克隆能力 FACS結(jié)果表明，從5只SD大鼠獲取的SMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45表達(dá)陰性，CD90、CD105、STRO-1表達(dá)陽(yáng)性，見(jiàn)表1。培養(yǎng)12天后，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，核呈橢圓形，能形成典型的干細(xì)胞克隆形態(tài)（圖1C，見(jiàn)封二），克隆成形率平均為29.3%。

表1 大鼠鼻竇黏膜干細(xì)胞（SMSCs）表面標(biāo)志物表達(dá)（%）和成克隆能力（%）

2.3 大鼠SMSCs、GMSCs和BMSCs的多向分化能力比較 茜素紅染色結(jié)果表明大鼠SMSCs胞外基質(zhì)礦化能力與GMSCs和BMSCs相當(dāng)。三種細(xì)胞均能在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)情況下形成大量的礦化結(jié)節(jié)（圖2，見(jiàn)封二），說(shuō)明三種細(xì)胞體外成骨能力基本相似。7天和14天時(shí)三種細(xì)胞誘導(dǎo)組ALP活性均顯著高于非誘導(dǎo)對(duì)照組（孕＜0.05）。三種細(xì)胞相比較，誘導(dǎo)組7天時(shí)ALP活性無(wú)顯著差異（孕＞0.05），14天時(shí)SMSCs的ALP活性顯著大于GMSCs（孕＜0.05），但與BMSCs相比無(wú)顯著性差異（孕＞0.05），見(jiàn)圖3（封二）。使用成脂誘導(dǎo)基培養(yǎng)28天后，油紅O染色結(jié)果表明大鼠GMSCs胞內(nèi)外形成大量橘色脂滴，但SMSCs和BMSCs的脂滴形成較少（圖2，見(jiàn)封二）。說(shuō)明GMSCs成脂肪能力較強(qiáng)，而SMSCs和BMSCs成脂肪能力較弱。

3 討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新能力，并具有多向分化潛力的干細(xì)胞。它對(duì)骨組織、軟骨組織、脂肪、肌肉、肌腱、韌帶等的發(fā)育和修復(fù)有重要作用[4]。雖然目前MSCs在骨組織工程和細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究和應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，但可用于研究的MSC種類卻較少。最常用的是骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），其次是從脂肪組織、牙髓組織和臍帶及血管周?chē)?xì)胞等來(lái)源的MSCs。對(duì)于頜面部器官來(lái)源的MSCs卻知之甚少[5]。由于口腔種植修復(fù)相關(guān)上頜竇提升術(shù)的發(fā)展需要，近期陸續(xù)有研究從人上頜竇黏膜固有層中發(fā)現(xiàn)了一種新的間充質(zhì)干細(xì)胞種類——SMSCs[2-3]，成為上頜竇內(nèi)成骨研究的重大突破。SMSCs與頜面部來(lái)源的其他間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，來(lái)源于外胚層的神經(jīng)嵴部分，并能在一定條件的刺激下分化為成骨細(xì)胞，參與到成骨過(guò)程中。

本研究使用組織學(xué)方法對(duì)大鼠鼻道和鼻竇結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，證實(shí)大鼠存在相對(duì)完整的上頜竇樣結(jié)構(gòu)。在鼻竇內(nèi)表面存在完整的內(nèi)襯黏膜，其三層結(jié)構(gòu)與先前研究報(bào)道的人上頜竇黏膜成分一致[6]。這為從大鼠鼻竇黏膜中分離出SMSCs提供了理論前提。本研究接下來(lái)使用了改良酶消化法成功體外分離培養(yǎng)出大鼠SMSCs，并證明其具有多向分化能力，并能表達(dá)符合MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞表面標(biāo)志物[4]。在體外成骨能力方面，SMSCs與牙齦來(lái)源的GMSCs和骨髓來(lái)源的BMSCs能力相當(dāng)。kim等[6]和Graziano等[7]從人和其他動(dòng)物上頜竇黏膜中分離出的SMSCs也表現(xiàn)出與本研究相似的體外成骨能力。證明大鼠SMSCs與人或其他動(dòng)物來(lái)源的SMSCs一樣，可用于骨再生研究。

另一方面，本研究結(jié)果還表明，與BMSCs、尤其是GMSCs相比，SMSCs顯示出較弱的體外成脂分化能力。SMSCs在體外較難被誘導(dǎo)分化為脂肪組織。先前研究報(bào)道，呼吸道來(lái)源的MSCs與BMSCs相比，增殖速度和向成骨細(xì)胞分化的傾向性上雖然有明顯優(yōu)勢(shì)，但不易被誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞[8]。這也進(jìn)一步說(shuō)明了不同來(lái)源的MSCs具有不同的細(xì)胞特征，也可能具有不同的多向分化能力[4]。故在不同的部位使用與該部位同源的MSCs可能獲得更好的效果[9]。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，SMSCs在成骨誘導(dǎo)7天和14天時(shí)ALP活性維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平。且在14天時(shí)，SMSCs的ALP活性顯著高于牙齦來(lái)源的GMSCs（孕＜0.05），甚至高于BMSCs（孕＞0.05）。這說(shuō)明與其他來(lái)源的MSCs相比，SMSCs骨再生相關(guān)蛋白（ALP）的活性維持時(shí)間較長(zhǎng)，可能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)（14天）維持高水平的骨再生能力。這一結(jié)果不僅能對(duì)臨床上觀察到的上頜竇內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)成骨現(xiàn)象做出解釋，并對(duì)尋找更適合此區(qū)域的骨增量方法提供了新的研究方向。

但也有研究不認(rèn)同上頜竇黏膜的成骨能力。Scala等[10-11]利用靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)行單純上頜竇提升術(shù)而不植入任何骨材料時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然在上頜竇腔內(nèi)產(chǎn)生了一定量的新生骨，但這種新生骨只存在于靠近原有竇底的種植體兩側(cè)，而種植體根尖部分始終沒(méi)有新骨生成。也有研究提出，SMSCs只有在某些特殊培養(yǎng)情況中才表現(xiàn)出向成骨細(xì)胞分化的潛力[7]。因而推測(cè)SMSCs的成骨分化是有條件的，可能受到一些細(xì)胞因子的調(diào)控。但究竟是哪些因子參與此作用，其調(diào)控機(jī)制又如何，需要進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果證明，SD大鼠鼻竇內(nèi)襯黏膜可成功分離培養(yǎng)出具有體外成骨能力的間充質(zhì)干細(xì)胞，為口腔頜面部骨組織工程研究提供新的細(xì)胞選擇。

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（收稿:2016-06-01 修回:2016-06-28）

Isolation and Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Rat Sinus Membrane

SIMisi1,LAI Kaichen2,SHI Jue3,XIA Jiajia4,CHENG Zhipeng1. 1 Department of Implantology,Stomatology Hospital affiliated to School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou(310000),China;2 Faculty of Stomatology and Dentistry,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou(310000),China;3 Department of Oral and Maxillo-Facial Surgery,Stomatology Hospital affiliated to School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou(310000),China;4 Department of Stomatology,Binjiang Branch of Second Affiliated Hospital,School of Medicine,Zhejiang University, Hangzhou(310000),China

ObjectiveTo investigate the anatomy of rat sinus in order to isolate mesenchymal stem cells （MSCs）from rat sinus membrane and compare its differentiation capability with MSCs derived from other tissues.MethodsEight Sprague-Dawley rats of 3 months were sacrificed.Paraffin sections of rat skulls with HE staining were prepared for anatomic structure observation.MSCs were isolated from the lining membrane of the rat sinus by modified enzyme digestion（SMSCs）.The cell surface markers were characterized by flow cytometric analysis.The self-renewal capability was tested by colony-forming units（CFUs）assay.Its potential of osteogenic and adipogenic differentiation were analyzed by Alizarin red staining,alkaline phosphatase（ALP）activity and Oil red O staining, whose results were compared with gingival and bone marrow derived MSCs（GMSCs and BMSCs）.ResultsAn obvious structure of paranasal sinus and its three-layer lining membrane were observed on sections of rat skull.SMSCs with multi-lineage differentiation and colony-forming capability were isolated from rat sinus membrane.After certain days of osteogenic induction,the extra-cellular calcification showed no significant differences among SMSCs, GMSCs and BMSCs（孕＞0.05）.But the ALP activity of SMSCs at 14 days was significant higher than that of GMSCs.ConclusionSMSCs of comparable osteogenic potential can be isolated and cultured in vitro from the sinus membrane of Sprague-Dawley rats.This might provide a new cell resource for future studies on bone regenerationin oral and maxillo-facial surgery.

rats;sinus membrane;mesenchymal stem cells;cell culture;differentiation;bone regeneration

浙江省教育廳科研項(xiàng)目（No.Y201431418）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（No.81401774）

1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔種植科（杭州 310000）；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系（杭州 310000）；3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科（杭州 310000）；4浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院濱江分院口腔科（杭州 310000）

姒蜜思，E-mail:mickeysimisi@hotmail.com