龐衛(wèi)祥許 超徐在強(qiáng)於秀玲

補(bǔ)腎活血方在兔脛骨截骨延長過程中對(duì)TGF-β2基因表達(dá)的影響

龐衛(wèi)祥1許 超2徐在強(qiáng)1於秀玲1

目的探討補(bǔ)腎活血方在牽張骨區(qū)域?qū)D(zhuǎn)化生長因子-β2（TGF-β2）基因表達(dá)的影響。方法取健康雄性新西蘭大耳白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎活血方組，造模完成后，假手術(shù)組不予任何藥物灌胃；模型組以生理鹽水灌胃；補(bǔ)腎活血方組采用中藥灌胃。牽張成骨8周后處死，取各組兔右側(cè)脛骨標(biāo)本，進(jìn)行HE染色病理組織形態(tài)觀察、免疫組織化學(xué)檢測、RT-PCR實(shí)驗(yàn)、影像學(xué)觀察等。結(jié)果影像學(xué)、病理組織形態(tài)觀察可見補(bǔ)腎活血方組兔截骨斷端有新生骨生成，骨小梁排列、密度及面積較模型組整齊。模型組TGF-β2生長因子幾乎沒有（-）或僅有微弱表達(dá)（+/-），而補(bǔ)腎活血方組在間質(zhì)細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及骨基質(zhì)中TGF-β2均有表達(dá)；補(bǔ)腎活血方組與假手術(shù)組TGF-β2基因mRNA表達(dá)量明顯高于模型組（0.512±0.080、0.546±0.087比0.381±0.093，孕＜0.05）。結(jié)論 補(bǔ)腎活血方對(duì)兔截骨延長區(qū)TGF-β2基因表達(dá)具有明顯的調(diào)控作用，通過對(duì)成骨細(xì)胞、骨基質(zhì)等影響，刺激TGF-β2的分泌和合成，有利于新骨的生成。

兔；截骨延長；補(bǔ)腎活血方；TGF-β2；脛骨；基因表達(dá)；影響

自上世紀(jì)90年代McCarthy等[1]第一次成功采 用截骨手術(shù)后，該技術(shù)因手術(shù)操作簡單易行，創(chuàng)傷性較小，周圍組織、血管等亦能得到良好改善的優(yōu)點(diǎn)，迅速得到推廣。在牽張成骨過程中，涉及多種生長因子相互作用，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β2（TGF-β2）尤其重要。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）由骨組織中的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨髓細(xì)胞等通過其特有的特性合成，是一種重要的骨生長調(diào)節(jié)因子，與多種調(diào)節(jié)生長因子協(xié)同作用，使成骨細(xì)胞聚集，從而促進(jìn)骨的再生和修復(fù)[2-3]。但到目前為止，還沒有形成統(tǒng)一的牽張成骨的分子學(xué)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用放射學(xué)檢查、組織學(xué)檢測等研究延長區(qū)骨愈合的過程，免疫組化檢測及RT-PCR探討延長區(qū)TGF-β2的表達(dá)情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性新西蘭大耳白兔24只，體質(zhì)量2.5～3.0kg，3月齡。購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（浙）2009-0015。飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)鐵籠飼養(yǎng)1只，喂養(yǎng)清潔飼料由浙江省中醫(yī)藥研究院提供，溫度22±1℃，相對(duì)濕度50%～70%，每1h換風(fēng)15～20次，光照150～200Lx，12h明暗交替，噪音＜50dB，自由攝食飲水，設(shè)有溫度、濕度、光照、壓力梯度等自動(dòng)控制和顯示系統(tǒng)，使用許可證:SYXK（浙）2008-0215。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材 本實(shí)驗(yàn)所采用的骨延長器是張家港市富康醫(yī)械制造有限公司制造的外固定器，為單邊外固定支架系統(tǒng)。骨牽引針螺釘直徑2.0mm，長度10cm，T型上釘器一套，螺桿外徑為1.0cm，長度8cm，螺紋距為1mm/2圈，每延長一圈螺桿肢體延長0.5mm。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與藥物 10%水合氯醛（浙江省中醫(yī)院制劑室）、3%戊巴比妥鈉（上海博蘊(yùn)生物科技有限公司）、慶大霉素（浙江瑞新藥業(yè)）、10%甲醛溶液（浙江衢州巨化試劑有限公司）、進(jìn)口脫鈣液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、TGF-β2抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、SP試劑盒（北京中山技術(shù)有限公司）、RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司）、PCR試劑與引物（上海申友合成）等。補(bǔ)腎活血方:熟地黃9g，枸杞、杜仲（姜制）、炒山藥、桃仁、制附子各6g，山茱萸、肉桂、炙甘草、紅花各3g（中藥材由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，中藥制劑由浙江杭州紅葉制藥有限公司制備，每毫升含生藥2g）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 兔脛骨截骨延長術(shù)牽張成骨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備完全隨機(jī)方法將24只新西蘭大白兔分為假手術(shù)組、模型組和補(bǔ)腎活血方組，每組8只。3%戊巴比妥溶液1mL/kg靜脈注射麻醉后，保持手術(shù)區(qū)無污染，將兔左側(cè)臥位于手術(shù)臺(tái)上，將右后肢脫毛、消毒、鋪無菌單。脛骨結(jié)節(jié)下方1cm處行前內(nèi)側(cè)切口縱行切開皮膚深達(dá)骨膜。假手術(shù)組僅將脛骨中段肌肉組織切斷，慶大霉素加生理鹽水沖洗后縫合。模型組和補(bǔ)腎活血方組于骨膜下剝離，低速電鉆垂直脛骨，在脛骨結(jié)節(jié)水平及其下方2cm處穿入兩組直徑1.2mm克氏針，后拔出克氏針，將外固定器置于脛骨（直徑2.0mm，深度為15mm），用線鋸于上兩組克氏針之間橫行鋸斷脛骨，同時(shí)截?cái)嚯韫?，?duì)位后安放自行設(shè)計(jì)單邊外固定器使其固定，慶大霉素加生理鹽水沖洗后，直視下將截骨斷端解剖對(duì)位加壓固定，逐層縫合組織。術(shù)后均給予青霉素肌肉注射40萬U/只，1天1次，連續(xù)5天；每日予以PVP碘傷口消毒，連續(xù)5天。

2.2 給藥方式 假手術(shù)組:術(shù)后不予任何灌胃處理。模型組:自截骨術(shù)后第1天，給予生理鹽水8mL/只灌胃，1天1次，連續(xù)灌胃4周。補(bǔ)腎活血方組:大白兔口飼給藥劑量均按成人日用臨床劑量，經(jīng)人-大白兔體表面積比值折算成8mL/只，自截骨術(shù)后第一天起灌胃，1天1次，連續(xù)灌胃4周。

2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集及制片 造模8周后，取右側(cè)脛骨全段（新鮮樣本）后處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，解剖脛骨，剔凈周圍軟組織，盡量完整保留骨痂部分組織。取脛骨延長區(qū)標(biāo)本放入10%中性甲醛緩沖溶液固定，進(jìn)口脫鈣液脫鈣，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色，光鏡觀察骨小梁及骨形態(tài)基質(zhì)，并通過組織學(xué)觀察截骨端的愈合情況，光鏡下觀察牽張骨區(qū)域骨細(xì)胞壞死、核濃縮情況。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測 取造模8周后的脛骨組織切片，用3%過氧化氫封閉內(nèi)源酶，正常羊血清封閉非特異性染色，按常規(guī)SP方法兔疫組化染色。據(jù)Tavkli的免疫染色評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析[4]?！?++”、“++”、“+”分別代表染色的強(qiáng)、中、弱，“-”代表染色為陰性，“+/-”代表不確定或極微陽性染色。

2.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 先采用Trizol一步法提取組織的總mRNA，再根據(jù)Revertaid TM First Strand cDNA Synthesis Kit說明書，以總mRNA為模板合成相應(yīng)的互補(bǔ)cDNA，反應(yīng)體系為30μL，反應(yīng)條件為70℃變性5min，42℃反轉(zhuǎn)錄1h，最后70℃ 5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。最后進(jìn)行cDNA的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共循環(huán)29次，最后72℃再延伸5min（CR擴(kuò)增的目的基因?yàn)門GF-β2，以GAPDH為內(nèi)參），對(duì)比各組mRNA的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)采用的引物為TGF-β2上游5’-CTCGTCACTCGGGTCGTAAT-3’、下游5’-CCAGACCATGATCACACAG G-3’；β-actin上游5’-GCACCGTCAAGGCTAGAAC-3’、下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

2.6 放射學(xué)檢測 取延長區(qū)標(biāo)本，做好標(biāo)記。拍攝標(biāo)準(zhǔn)的新西蘭大耳白兔右側(cè)脛骨側(cè)位數(shù)字放射線片，觀察標(biāo)本截骨延長區(qū)對(duì)位、連接情況、周圍骨痂生長情況和新生骨生成，同時(shí)觀察截骨延長區(qū)域骨皮質(zhì)、骨截面情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s ）表示，多樣本比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊性采用LSD法，不同分組觀察時(shí)采用方差分析，方差不齊采用Dunnett's T3，以孕＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 免疫組織化學(xué)觀察 在牽張成骨區(qū)新生骨組織中，模型組TGF-β2生長因子幾乎沒有（-）或僅有微弱表達(dá)（+/-）。而補(bǔ)腎活血方組在間質(zhì)細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及骨基質(zhì)中對(duì)TGF-β2生長因子均有表達(dá)，表達(dá)水平不同，且于成骨細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性（+++），見表1。

表1 TGF-β2染色分級(jí)比較

3.2 TGF-β2基因表達(dá) RT-PCR檢測結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血方組與假手術(shù)組TGF-β2基因mRNA表達(dá)量明顯高于模型組（孕＜0.05），見表2。

表2 TGF-β2基因mRNA表達(dá)量比較（±s）

表2 TGF-β2基因mRNA表達(dá)量比較（±s）

注:與模型組比較，*孕＜0.05

組別假手術(shù)組模型組補(bǔ)腎活血方組只數(shù)8 8 8 TGF-β2mRNA 0.546±0.087* 0.381±0.093 0.512±0.080*

3.3 右側(cè)脛骨標(biāo)本X片影像觀察結(jié)果 造模8周后，模型組有少量骨痂生成，形成不規(guī)則的骨痂連接，截骨面較為模糊；而補(bǔ)腎活血方組在截骨斷端可見有規(guī)則的骨痂連接，骨皮質(zhì)清晰可見，有新生骨生成，與自身組織融合較好，見圖1（插頁）。

3.4 組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組骨皮質(zhì)連續(xù)完整較好、致密均勻，軟骨面光滑，骨小梁粗細(xì)適中、均勻，排列整齊，無斷裂、稀疏變窄等改變，無炎性區(qū)域出現(xiàn)，與主應(yīng)力的方向一致。模型組右側(cè)脛骨外側(cè)骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)不完整，骨小梁粗細(xì)、排列較假手術(shù)組與補(bǔ)腎活血方組明顯不均勻、紊亂，與主應(yīng)力的方向不一致，大量內(nèi)側(cè)骨皮基質(zhì)破壞，軟骨基質(zhì)不均勻，骨小梁稀疏，有些區(qū)域呈連續(xù)性小梁，少量軟骨細(xì)胞生成，有大量炎性反應(yīng)伴骨吸收。見圖2（插頁）。

4 討 論

牽張成骨是在特定機(jī)械張力作用下的特殊骨再生技術(shù)，涉及多種生長因子相互作用。近年來，關(guān)于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β調(diào)節(jié)骨生長、骨愈合過程的機(jī)制是研究的重點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β2（TGF-β2）在牽張成骨中占有非常重要的地位。本實(shí)驗(yàn)通過相關(guān)檢測證實(shí)補(bǔ)腎活血中藥組中TGF-β2基因的表達(dá)量顯著高于模型組，說明TGF-β2基因在中藥組中的高表達(dá)與補(bǔ)腎活血中藥在牽張成骨中的作用密不可分。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血方組與及假手術(shù)組TGF-β2基因的mRNA表達(dá)量明顯高于模型組（孕＜0.05）。因此，我們認(rèn)為良好的牽張成骨效果獲益于補(bǔ)腎活血中藥對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β2）基因的明顯調(diào)控作用。

許兵等[5]研究證明，補(bǔ)腎活血顆粒可提高雌激素水平，由此促進(jìn)骨的生成，增加骨量。臧洪敏等[6]將不同濃度的補(bǔ)腎活血方應(yīng)用于臨床研究對(duì)比，結(jié)果大量礦化結(jié)節(jié)形成，從而獲得良好的骨形態(tài)表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過組織學(xué)觀察顯示，模型組少量軟骨細(xì)胞生成，有大量炎性反應(yīng)伴骨吸收。骨小梁扭曲明顯，甚至斷裂，其骨小梁間隙增寬或骨小梁變細(xì)薄，密度較低或面積低于其余兩組；而補(bǔ)腎活血方組骨小梁排列、密度及面積較模型組整齊，其骨小梁間隙雖有增大，但無模型組明顯，牽張成骨區(qū)部分骨細(xì)胞壞死，部分細(xì)胞核濃縮、破裂，甚至消失。伴有少量炎性細(xì)胞、軟骨細(xì)胞生成，血管數(shù)量增多，明顯網(wǎng)狀新骨生成。臨床上活血化瘀是牽張成骨的早期治療原則，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，補(bǔ)腎活血方促進(jìn)TGF-β2的分泌而對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化起到重要推動(dòng)作用。說明本實(shí)驗(yàn)通過補(bǔ)腎活血中藥的干預(yù)，使成骨細(xì)胞不斷增多，加速合成、分泌TGF-β2生長因子。

以往研究[7]亦表明TGF-β2可促進(jìn)骨細(xì)胞增殖與分化，通過成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨重建，TGF-β2在創(chuàng)傷愈合、新骨組織修復(fù)重建及新生骨形成中都起著至關(guān)重要的作用。Yeung HY等[8]關(guān)于TGF-β2在牽張成骨骨痂和骨折時(shí)骨痂表達(dá)的對(duì)比研究，顯示TGF-β2均有高表達(dá)跡象。吳巍等[9]研究表明TGF-β2在牽張成骨的過程中已成為新骨生成的重要驅(qū)動(dòng)因素，成骨細(xì)胞在受到牽張機(jī)械力作用下數(shù)目大量增加，與此同時(shí)，該轉(zhuǎn)化生長因子的表達(dá)也相應(yīng)增加?？梢娡ㄟ^補(bǔ)充其它細(xì)胞因子激活的已分化細(xì)胞是TGF-β2對(duì)骨形成的基本作用。TGF-β2與其它多種調(diào)節(jié)生長因子共同作用參與細(xì)胞分化，使成骨細(xì)胞聚集，從而促進(jìn)骨的再生和修復(fù)，Schliephake H[10]研究證實(shí)多種生長因子共同參與牽張成骨的過程，但具體的生物學(xué)分子機(jī)制還不明確。本實(shí)驗(yàn)在免疫觀察中顯示，模型組TGF-β2生長因子幾乎沒有（-）或僅有微弱表達(dá)（+/-），而補(bǔ)腎活血方組在間質(zhì)細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及骨基質(zhì)中對(duì)TGF-β2生長因子均有表達(dá)，表達(dá)水平不同，且于成骨細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性（+++）。說明TGF-β2的表達(dá)由牽張兩側(cè)向牽張中心移行，對(duì)成骨細(xì)胞的生成有促進(jìn)作用。也說明補(bǔ)腎活血方中藥可促進(jìn)成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及骨基質(zhì)等生成，從而加速TGF-β2生長因子的合成分泌，對(duì)TGF-β2基因表達(dá)有明顯的調(diào)控作用。

利用影像學(xué)評(píng)價(jià)牽張間隙內(nèi)新生骨骨組織，推斷新骨生成，國內(nèi)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。李華[11]在牽張成骨新生骨評(píng)價(jià)方法的研究及應(yīng)用進(jìn)展已有明確表述。因此，本實(shí)驗(yàn)從影像學(xué)檢查觀察，模型組有少量骨痂生成，形成不規(guī)則的骨痂連接，截骨面較為模糊；而補(bǔ)腎活血方組在截骨斷端可見有規(guī)則的骨痂連接，骨皮質(zhì)清晰可見，有新生骨生成，與自身組織融合較好。由此可推斷，補(bǔ)腎活血方在截骨延長術(shù)過程中能積極促進(jìn)TGF-β2基因表達(dá)，從而促進(jìn)新骨的生成。崔明軍等[12]在山羊下頜骨牽張成骨的影像學(xué)觀察研究中也證實(shí)了其成骨效果。邵楨等[13]在下頜骨牽張成骨實(shí)驗(yàn)中得出TGF-β2持續(xù)高表達(dá)，尤其于新骨小梁成骨細(xì)胞帶，同其它因子共同刺激成骨細(xì)胞合成。

綜上所述，補(bǔ)腎活血中藥通過補(bǔ)腎壯骨、活血化瘀，減少炎性滲出，促進(jìn)血液循環(huán)，使成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等骨細(xì)胞活性始終處于活躍狀態(tài)，TGF-β2分泌增加，促進(jìn)牽張成骨效果，利于新骨生成，為臨床應(yīng)用補(bǔ)腎活血復(fù)方提供可靠的理論依據(jù)，也為中醫(yī)藥應(yīng)用于牽張成骨提供理論依據(jù)。

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（收稿:2016-02-07 修回:2016-04-29）

Impact of Bushen Huoxue Decoction on the Expression of TGF-β2 Gene of Rabbits after Tibial Lengthen-ing Osteotomy

PANG Weixiang1,XU Chao2,XU Zaiqiang1,YU Xiuling1.1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Osteotology,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

ObjectiveTo investigate the effect of Bushen huoxue decoction on the expression of TGF-β2 gene in distraction area after tibial osteotomy.MethodsHealthy male New Zealand big-eared rabbits were randomly divided into sham-operation group,model group and Bushen huoxue decoction group.After operation,sham-operation group was not given any drug;model group was given normal saline by lavage;and Bushen huoxue decoction group was administered with the Chinese medicine by lavage.After 8 weeks of distraction osteogenesis,all rabbits were sacrificed to make tibial specimens for the histopathologic morphology observation with H-E staining,immunohistochemical detection,RT-PCR experiments,and imaging observation.ResultsImaging and histopatholigic morphology observation showed that new bone formation was observed in Bushen huoxue decoction group and that compared with model group,rabbits trabecular bone in Bushen huoxue decoction group were neatly arranged,the bone density and area were close to normal.The expression of TGF-β2 gene was nearly not observable in model group,while it was observed in mesenchymal cells,osteocytes，and osteoblasts in Bushen huoxue decoction group. The mRNA expression of TGF-β2 gene in Bushen huoxue decoction group and sham-operation group was higher than that in model group（0.512 0.080,0.546 0.087 vs 0.381 0.093,孕＜0.05）.ConclusionBushen huoxue decoction can regulate the expression of TGF-β2 gene in osteoblasts and bone matrix during distraction osteogenesis to accelerate new bone formation.

rabbit;distraction lengthening;Bushen huoxue decoction；TGF-β2;tibia;gene expression;effect

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2012ZB058）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州 310053）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨二科（杭州 310005）

許超，Tel:13336047228；E-mail:docxuchao@126.com