孫 帥，張慶霞，薛盧艷，劉金杰，唐 暉，劉 力,*

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001；2. 北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

Rapid HIT 200在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中的應(yīng)用

孫 帥1，張慶霞2，薛盧艷2，劉金杰2，唐 暉2，劉 力2,*

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001；2. 北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

目的檢驗(yàn)Rapid HIT 200系統(tǒng)快速檢測(cè)DNA的法醫(yī)學(xué)可應(yīng)用性。方法將血斑、唾液斑、脫落細(xì)胞及各種組織以該系統(tǒng)檢測(cè)，從靈敏度、適應(yīng)性、重復(fù)性和防污染等方面評(píng)估其效能。結(jié)果該系統(tǒng)檢測(cè)全血樣本（血液）靈敏度為1 μL，模板量30 pg左右；血斑、組織與唾液斑的檢出率均在80 %以上，但對(duì)脫落細(xì)胞僅為16 %；對(duì)測(cè)試的100個(gè)樣本中，未發(fā)生樣本自身或彼此間的轉(zhuǎn)移污染；對(duì)血斑、唾液斑、脫落細(xì)胞的重復(fù)性檢驗(yàn)，其基因座一致性檢出率達(dá)90 %以上。結(jié)論該系統(tǒng)具備防污染能力，對(duì)常量檢材的檢測(cè)能力優(yōu)于微量。

Rapid HIT 200系統(tǒng)；STR基因座；靈敏性；適應(yīng)性；防污染；重復(fù)性

通常法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)工作流程包含四個(gè)步驟：（1）生物樣本的DNA提取；（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）；（3）毛細(xì)管電泳分離；（4）選用軟件分析結(jié)果。一般需7～8 h完成。近十年來(lái)，DNA自動(dòng)化分析技術(shù)取得了顯著進(jìn)步，基因座數(shù)量的增加進(jìn)一步提高了個(gè)體識(shí)別能力，耗時(shí)更短的PCR縮短了DNA定量和STR復(fù)制的過(guò)程[1-7]。正是由于更快速的檢測(cè)對(duì)于案件的偵查和審判更具時(shí)效性和價(jià)值，因此提高自動(dòng)化程度，對(duì)生物檢材進(jìn)行更快速檢測(cè)分析，是法醫(yī)工作者們永恒的追求。

應(yīng)用微流控芯片技術(shù)研發(fā)的Rapid HIT 200系統(tǒng)[8]（IntegenX, Pleasanton CA, USA) 集DNA提取、擴(kuò)增、電泳和分析四大功能于一體，實(shí)現(xiàn)了樣品檢測(cè)自動(dòng)化，降低了人為操作造成污染的風(fēng)險(xiǎn)，檢驗(yàn)可在2 h內(nèi)完成。本文應(yīng)用該系統(tǒng)，對(duì)其靈敏度、各種現(xiàn)場(chǎng)檢材的適應(yīng)性、可重復(fù)性、防污染等方面進(jìn)行測(cè)試分析。

1 材料與方法

Rapid HIT 200系統(tǒng) (瑞捷200)，采用Promega的DNAIQTM進(jìn)行樣品提取，適配兩種PCR試劑：Powerplex?16HS (Promega，USA)和GlobalFilerTM(Life Technologies, USA)，用8道毛細(xì)管電泳進(jìn)行片段快速分離，結(jié)果分析應(yīng)用Gene Marker?HID軟件 (Soft Genetics, LLC）。8道毛細(xì)管中，5道為檢測(cè)樣本，其余3道分別為陰、陽(yáng)性對(duì)照和Ladder。

因樣品在樣品盒中有可能發(fā)生漂移，因此使用Rapid HIT 200系統(tǒng)，最好對(duì)檢材作固定處理，該系統(tǒng)設(shè)有兩種檢測(cè)模式：一種針對(duì)于常量檢材，選用口腔拭子；另一種針對(duì)于微量檢材，選擇其他工具模式。常量模式的PCR循環(huán)次數(shù)比微量模式少兩個(gè)循環(huán)，電泳結(jié)束后，用Gene Marker HID?V2.6.13軟件對(duì)電泳數(shù)據(jù)進(jìn)行STR分型。

1.1 靈敏性

針對(duì)檢材的靈敏性，將全血檢測(cè)分為兩類(lèi)：一類(lèi)為未稀釋的全血，分別取全血5、3、1 μL均勻地涂于棉簽頭部；另一類(lèi)取5 μL全血分別按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶150、1∶250的比例稀釋?zhuān)蠓謩e取20 μL稀釋血均勻地涂于棉簽頭部，上述按照不同比例稀釋的血的實(shí)際含量分別相當(dāng)于全血量的3.3, 2.0, 1.0, 0.4, 0.2, 0.13, 0.08 μL。自然陰干30 min后，將兩類(lèi)樣本棉簽置于檢測(cè)通道中。

1.2 不同檢材適應(yīng)性

收集不同類(lèi)型的檢材，包括血斑49份、唾液斑26份、組織(包括肌肉、皮膚、肝臟、脾臟、心臟和腦組織)40份、脫落細(xì)胞50份。

1.3 防污染性

系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)，樣本自身或彼此轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生污染，因此有必要評(píng)估其防污染能力。使用空白拭子即未使用過(guò)的棉簽，用于檢測(cè)樣本自身或在彼此轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生污染的可能性（測(cè)試空白拭子是否能檢出STR真峰，有檢出即發(fā)生了污染）。該系統(tǒng)的每次運(yùn)行都設(shè)置空白拭子作檢測(cè)對(duì)照。

1.4 重復(fù)性研究

血斑來(lái)源于8名個(gè)體 (分別為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8)，分別重復(fù)檢驗(yàn)次數(shù)為2、2、2、4、5、5、6、6；唾液斑來(lái)源于5名個(gè)體（分別為B1、B2、B3、B4、B5)，分別重復(fù)檢驗(yàn)次數(shù)為2、3、3、3、6；脫落細(xì)胞樣本源于2名個(gè)體 (分別為C1、C2)，均重復(fù)檢驗(yàn)2次。對(duì)檢出的基因座數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

上述4種研究方法均采用GlobalFilerTM系統(tǒng)進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 靈敏性

即未稀釋的全血與稀釋后的全血（在不同稀釋比例條件下各取20 μL）所分別檢出基因座數(shù)目的比較。全血最低閾值含量的完整基因座檢出圖譜如圖1，檢出情況見(jiàn)表1。

圖1 全血最低閾值含量的基因座檢出完整圖譜Fig.1 The complete genetic profles detected under the lowest threshold of whole blood volume

2.2 不同檢材的適應(yīng)性

血斑、組織、唾液斑、脫落細(xì)胞檢出的等位基因百分比見(jiàn)表2。

2.3 污染的研究

本測(cè)試Rapid HIT 200系統(tǒng)共設(shè)置了100個(gè)空白拭子樣本，均未顯示發(fā)生樣本自身或彼此間的污染。

2.4 重復(fù)性

血斑、唾液斑、脫落細(xì)胞經(jīng)不同重復(fù)次數(shù)的檢測(cè)，其基因座一致性檢出率見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 靈敏性

由表1可見(jiàn)，隨著全血量的減少，無(wú)論是未稀釋全血，還是稀釋全血，檢出基因座數(shù)目都呈遞減趨勢(shì)；同時(shí)盡管稀釋后全血實(shí)際含量≤未稀釋全血量，但檢出的基因座數(shù)目卻是對(duì)應(yīng)稀釋后全血≥未經(jīng)稀釋全血。這可能是稀釋的血液中抑制PCR反應(yīng)的血紅素含量減少所致。此外，未稀釋全血較稀釋后血因粘度原因從槍頭內(nèi)不能完全排凈，而使得實(shí)際被測(cè)血量亦即DNA量減少，也會(huì)使檢出基因座數(shù)目降低，或又是另一個(gè)原因。通過(guò)比較未經(jīng)稀釋和稀釋后全血所檢出的基因座數(shù)目，推測(cè)Rapid HIT 200系統(tǒng)檢測(cè)血液樣本的靈敏度為1 μL全血，即模板量30 pg左右。

表1 不同全血量的檢出情況Table 1 The detected STR loci numbers under various whole blood volumes

表2 不同類(lèi)型檢材檢出情況匯總表Table 2 Ratio to total amount of each item by the respective item-different samples exposing their STR loci to certain extent

3.2 不同檢材的適應(yīng)性

當(dāng)檢出的等位基因數(shù)百分比在95 %～100 %區(qū)間時(shí)，血斑、組織、唾液斑樣本比例遠(yuǎn)超半數(shù)，分別為91.8 %、80 %、100 %，而脫落細(xì)胞樣本的比例最低，僅為16 %。這是由于血斑、組織細(xì)胞、唾液斑等常量檢材的細(xì)胞含量大，DNA模板量高，故基因座數(shù)目檢出多，而微量檢材脫落細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，模板量低，故檢出比例也就少。由此可見(jiàn)，Rapid HIT 200系統(tǒng)對(duì)常量檢材的檢測(cè)能力優(yōu)于微量檢材。但是，檢測(cè)樣本數(shù)的不同會(huì)影響檢出基因座的比率分布區(qū)間占比，比如，組織樣本數(shù)為12時(shí)，其檢出等位基因百分比區(qū)間50 %～80 %的檢材數(shù)為3（25 %），80 %～95 %區(qū)間是0，95 %～100 %區(qū)間為9（75 %）；而對(duì)于脫落細(xì)胞，當(dāng)樣本數(shù)為30時(shí)，其在50～80%檢出等位基因百分比區(qū)間的檢材數(shù)為20（66.7 %），80 %～95 %區(qū)間是2（6.7 %），95 %～100 %則為8（26.7 %）；與表2其各自檢材總數(shù)為40和50時(shí)所呈現(xiàn)的相應(yīng)比率分布區(qū)間明顯不同，概因低樣本數(shù)時(shí)檢材個(gè)體差異所導(dǎo)致的統(tǒng)計(jì)分布異常使然。因此，欲得到符合規(guī)律和常理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，樣本總數(shù)不能太少。不過(guò)，這些結(jié)果恰也證明Rapid HIT 200系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確反映檢測(cè)樣本的真實(shí)情況。

3.3 污染的研究

在空白拭子中發(fā)現(xiàn)一些非特異性譜帶，即非等位基因基線位置出現(xiàn)一些未標(biāo)記的等位基因，但是其峰高均低于100 RFU，顯著低于從血拭子中獲得的特異性峰高。非特異性譜帶有拔起峰、釘子峰等，這幾類(lèi)峰可采用Gene Marker HID?V2.6.13軟件加以分析刪除。對(duì)于在黃色和紫色條帶的空白拭子中觀察到的拔高偽峰，則可能是在沒(méi)有相匹配的STR-PCR復(fù)制子存在的情況下，毛細(xì)管電泳產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度過(guò)高所致[9]。因此，可排除所檢測(cè)的血拭子有外源性污染的問(wèn)題。以上結(jié)果表明當(dāng)Rapid HIT 200系統(tǒng)由專(zhuān)業(yè)法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)人員操作時(shí)，從樣本進(jìn)樣到圖譜顯示，應(yīng)不會(huì)有污染產(chǎn)生。

表3 不同樣本重復(fù)性研究基因座檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Reproducible detectivity of the STR loci from the item-various samples

對(duì)于每一個(gè)空白拭子的各熒光條帶的峰信號(hào)強(qiáng)度要實(shí)驗(yàn)確定其分析閾值（Analytical threshold，AT），該閾值可用于區(qū)別一個(gè)真正等位基因峰和基線雜信號(hào)。因藍(lán)色通道最小閾值為17RFU、綠色通道10RFU、黃色通道13RFU、紅色通道16RFU、紫色通道46RFU，故針對(duì)于所有熒光通道可設(shè)AT值為50RFU。

本測(cè)試結(jié)果表明，所有實(shí)驗(yàn)樣本中空白拭子AT值均在50RFU以下；所有STR分型圖譜沒(méi)有雜峰，峰高比例均衡，故樣本運(yùn)行中未發(fā)生樣本自身或彼此間轉(zhuǎn)移的污染。Rapid HIT 200系統(tǒng)的運(yùn)行應(yīng)是防污染的。

3.4 重復(fù)性

血斑、唾液斑和脫落細(xì)胞的基因座一致性檢出率很高，均在90 %以上，可見(jiàn)Rapid HIT 200系統(tǒng)對(duì)常見(jiàn)樣本的重復(fù)性檢測(cè)性能好。Rapid HIT 200系統(tǒng)運(yùn)行方便，具有快速便捷的優(yōu)點(diǎn)。本測(cè)試推測(cè)該系統(tǒng)檢驗(yàn)血液樣本的靈敏度為1 μL全血，即DNA模板量30 pg左右，檢測(cè)常量檢材能力優(yōu)于微量檢材，具有防污染能力，對(duì)于血斑、唾液斑和脫落細(xì)胞等檢材均具有很高的重復(fù)性。故Rapid HIT 200系統(tǒng)可用于法醫(yī)DNA快速檢測(cè)，但其樣本適應(yīng)性還需進(jìn)一步改善。

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The Applicability of Rapid HIT 200 Apparatus for Forensic DNA Test

SUN Shuai1, ZHANG Qingxia2, XUE Luyan2, LIU Jinjie2, TANG Hui2, LIU Li2,*
(1. The Forensic College of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2. Beijing Identifcation Center for Public Security and Justice, Beijing 100192, China)

ObjectiveTo test the applicability of Rapid HIT 200 apparatus into quick detection of forensic DNA.MethodsRapid HIT 200 apparatus was used to test the samples including whole blood fluid, bloodstains, saliva stains, exfoliated cells and tissues, for evaluating its sensitivity, adaptability, reproducibility and preventability against contamination.ResultsThe sensitivity for testing whole blood fuid is 1μL, equivalent to 30 pg quantity of DNA template. For the quantity-eligible samples of tissues, bloodstains and saliva stains, more than 80 % of the tested genetic loci are shown their genotyping profles, whereas mere 16 % of the tested genetic loci are exposed for the exfoliated cells. Among the 100 samples processed by Rapid HIT 200 apparatus, no contamination occurs within the samples themselves or one another during their transferring or testing. The reproducibility and consistency of the tested genetic loci exceed 90% for either the bloodstains or saliva stains or exfoliated cells.ConclusionsRapid HIT 200 apparatus is capable of preventing contamination, applicable for detecting DNA extracted from both the quantity-normal samples and trifing ones albeit a better result prone to emerge for the former than the latter ones.

Rapid HIT 200 apparatus; STR loci; sensitivity; adaptability; preventability against contamination; reproducibility

DF795.2

B

1008-3650(2016)06-0500-04

2015-09-20

格式：孫帥，張慶霞，薛盧艷，等. Rapid HIT 200在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J]. 刑事技術(shù)，2016,41(6):500-503.

10.16467/j.1008-3650.2016.06.017

孫帥（1989—），男，山西忻州人，碩士研究生，研究方向?yàn)镈NA法醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用。E-mail: ss0030@163.com

* 通訊作者：劉力（1963—），男，遼寧沈陽(yáng)人，主任法醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)學(xué)。E-mail:13901212325@163.com