程健博 李朋 孫悅 高帥 張根生

哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076

核磁共振技術(shù)在大豆科學(xué)研究中的應(yīng)用

程健博 李朋 孫悅 高帥 張根生

哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076

核磁共振技術(shù)在大豆科學(xué)研究中的應(yīng)用具有重要影響，本文從核磁共振技術(shù)在大豆蛋白研究中的應(yīng)用，在大豆特定成分檢測(cè)中的應(yīng)用及在大豆油脂品質(zhì)控制中的應(yīng)用三個(gè)方面闡述了核磁共振技術(shù)對(duì)大豆科學(xué)相關(guān)研究的影響，并對(duì)核磁共振技術(shù)在大豆科學(xué)研究的探索方向進(jìn)行了展望，為該技術(shù)的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供借鑒和參考。

核磁共振技術(shù); 大豆；應(yīng)用

近年來(lái)，核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用日益成熟，且在大豆科學(xué)研究中的應(yīng)用也越來(lái)越得到重視。核磁共振波譜最早于二十世紀(jì)中葉由哈佛大學(xué)的伯塞爾((E.M.Purcell)和斯坦福大學(xué)的布洛赫(F.Bloch)等人用實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。與質(zhì)譜、紅外光譜、紫外光譜共同稱為有機(jī)分析四大譜的NMR波譜，在我國(guó)已有幾十年的發(fā)展歷史，由于其廣泛的應(yīng)用范圍和嚴(yán)密的理論基礎(chǔ)，并憑借快速、無(wú)損及操作簡(jiǎn)便的應(yīng)用特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種不可多得的重要分析手段。

目前核磁共振技術(shù)在大豆科學(xué)研究中的應(yīng)用主要集中在低場(chǎng)核磁共振（L-NMR）、氫譜高頻核磁共振（1H-NMR）、碳譜高頻核磁共振（13C-NMR）及磷譜高頻核磁共振（31P-NMR）四個(gè)方面。在大豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定、特定成分定性檢測(cè)和油脂品質(zhì)控制等領(lǐng)域的應(yīng)用均有明顯的優(yōu)勢(shì)，但NMR技術(shù)在定量測(cè)定目標(biāo)成分時(shí)，在準(zhǔn)確性方面還存在偏差，綜合評(píng)價(jià)體系還沒有建立。本文主要介紹的是NMR技術(shù)在大豆科學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 NMR技術(shù)在大豆蛋白研究中的應(yīng)用

1．1 大豆蛋白結(jié)構(gòu)的表征

NMR測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表征方法主要包括四大基本要素：（1）結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要NMR參數(shù)NOE （nuclear overhauser effect）距離測(cè)定；（2）核磁譜峰序列專一性歸屬；（3）NMR結(jié)構(gòu)計(jì)算及結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)；（4）數(shù)據(jù)收集的多維NMR技術(shù)。華菁對(duì)聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸與大豆分離蛋白接枝進(jìn)行了探究，將大豆分離蛋白分散在8mo1/L尿素水溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以過硫酸銨為引發(fā)劑，合成了大豆分離蛋白接枝聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸共聚物（SPI-g-PAMPS），對(duì)以大豆分離蛋白為基質(zhì)的層層組裝進(jìn)行了探討。用13C固態(tài)核磁共振儀（13C -NMR）對(duì)SPI-g-PAMPS進(jìn)行了表征，在δ=42、δ=53、δ=178處均有與SPI-g-PAMPS相吻合的吸收峰，證明了聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸己成功接枝到了大豆分離蛋白上。傅立葉紅外光譜儀（FTIR）及電鏡表征均證實(shí)聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸己成功接枝到了大豆分離蛋白上。Makoto Shimoyamada等在1H-NMR譜中，大豆α-乳清蛋白/皂素胰蛋白酶水解過程和α-乳清蛋白的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行表征。在探究大豆LEAI蛋白在不同環(huán)境中，保守基序Em-2M和Em-C多肽的結(jié)構(gòu)及聚集行為時(shí)，薛蓉等選用TSP-d4作為內(nèi)標(biāo)，通過核磁共振波譜(NMR)法證實(shí)Em-C的螺旋和折疊結(jié)構(gòu)特征及聚集行為可能在全長(zhǎng)蛋白的功能中起到重要作用。

1．2 大豆蛋白特性的測(cè)定

在大豆科學(xué)領(lǐng)域，蛋白特性測(cè)定的準(zhǔn)確性尤為重要。劉俊梅等在探究高剪切分散乳化技術(shù)促進(jìn)凝膠持水性時(shí)，采用L-NMR技術(shù)從水分分布、水分遷移、持水能力三個(gè)方面研究高剪切分散乳化技術(shù)對(duì)大豆分離蛋白凝膠體系中水分狀態(tài)影響機(jī)制。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，橫向弛豫時(shí)間T21、T22、T23與剪切力表現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)，高剪切分散乳化技術(shù)能夠提高TG酶誘導(dǎo)的大豆蛋白凝膠持水能力，在貯存過程中，高剪切分散乳化技術(shù)能顯著提高凝膠持水性。Emmanuel Lepinel 等13C-NMR技術(shù)探究生物大豆粉中制備糠醛合成膠粘劑時(shí)，糠醛的反應(yīng)與氫氧化鈣用量相關(guān)，亞甲橋的建立通過康尼查羅反應(yīng)完成。但是，并沒有證明制備糠醛過程有共價(jià)離子的參與。相似研究還出現(xiàn)在孫超的文章中，大豆分離蛋白及其接枝產(chǎn)物兩張譜圖在化學(xué)位移δ=54和δ=173處都存在吸收峰，其應(yīng)分別歸屬于大豆分離蛋白分子中的氨基酸上的叔碳和羰基碳的吸收峰，這與于德泉、楊峻山報(bào)道的化學(xué)位移吻合。而在接枝產(chǎn)物的譜圖中新出現(xiàn)了四個(gè)吸收峰，化學(xué)位移分別δ=55、δ=16、δ=6和δ=184，它們分別歸屬于聚甲基丙烯酸接枝鏈上的仲碳、伯碳、季碳和梭基上的碳，這與謝緬諾維奇.赫拉莫娃[20]報(bào)道的c、d、e、f各自的化學(xué)位移值分別為δ=54、δ=17、δ=45和δ=179，也是吻合的。由此進(jìn)一步證明了大豆分離蛋白接枝甲基丙烯酸的成功。

1．3 擠壓大豆蛋白水分的表征

陳鋒亮等在研究大豆蛋白擠壓組織化過程中水分的變化時(shí)，選擇L-NMR法中的CPMG脈沖序列測(cè)定，用橫向弛豫時(shí)間T2進(jìn)行表征。由于擠壓組織大豆蛋白中水分含量較低，研究者將采樣點(diǎn)數(shù)（TD=21150）、采樣頻率（SW=250.00kHz）、間隔時(shí)間（TR=600ms）、回波個(gè)數(shù)（Echo Count=350）、累加次數(shù)（NS=32）均設(shè)置為較高值以增加測(cè)試準(zhǔn)確性。Ruan R. S等研究發(fā)現(xiàn)，水分子的流動(dòng)性與馳豫時(shí)間的長(zhǎng)短成正比例關(guān)系。弛豫時(shí)間越短，水分與底物結(jié)合越緊密，弛豫時(shí)間越長(zhǎng)，水分越自由。因此，根據(jù)弛豫時(shí)間的長(zhǎng)短，可以得知水分與物料的結(jié)合程度。差示量熱掃描（DSC）和L-NMR兩種方法分析擠壓組織化產(chǎn)品中水分形態(tài)結(jié)果的相關(guān)分析，可以看出，DSC測(cè)得的凍結(jié)水、非凍結(jié)水分別與L-NMR法測(cè)得的自旋-自旋弛豫時(shí)間T22和T21之間存在顯著的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.96（p＜0.01）和0.54（p＜0.05），這表明盡管DSC和L-NMR這兩種技術(shù)的測(cè)定原理截然不同，但兩種方法測(cè)定水分狀態(tài)的結(jié)果是相同的，但低場(chǎng)核磁脈沖在測(cè)定速度、成像等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

2 NMR技術(shù)在大豆特定成分檢測(cè)中的應(yīng)用

2．1 大豆卵磷脂含量的測(cè)定

核磁共振波譜可用來(lái)作定量分析，其定量分析的基礎(chǔ)是各化學(xué)環(huán)境不同的核、吸收峰出現(xiàn)的位置不同，可得到不同化學(xué)位移信號(hào)。施邑屏等采用了核磁共振法（31P-NMR）對(duì)針劑大豆卵磷脂的組份進(jìn)行了定性及定量分析。與定磷法等經(jīng)典磷脂分析方法相比，31P-NMR法分析磷脂化合物具有快速、靈敏、干擾因素較小，準(zhǔn)確度較高的優(yōu)點(diǎn)。不足之處是樣品需要量較大，在90兆核磁共振儀中，一般需要30～60mg。類似的研究還出現(xiàn)在對(duì)磷脂酶A1催化水解大豆卵磷脂后的樣品中，卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰膽堿的相對(duì)含量的測(cè)定試驗(yàn)中。杜章斌等利用1H-NMR，分別選取化學(xué)位移δ=3.76～ 3.83、δ=4.14～4.16、δ=4.40～4. 50處的信號(hào)峰作為卵磷脂、溶血磷脂和甘油磷脂酰膽堿的特征性質(zhì)子峰，并根據(jù)質(zhì)子峰相對(duì)面積與物質(zhì)的量的對(duì)應(yīng)關(guān)系確定三者的含量。結(jié)果表明，卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰膽堿的加標(biāo)回收率分別為101.6%～107.0%、79.8%～92.4% 、102. 0%～107.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.6%～2.5%、3. 6%～6.5%、5.6%～6.7%。精密度試驗(yàn)中卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰膽堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.2% 、3.5% 、2.3%；對(duì)磷脂酶A1催化水解大豆卵磷脂4h與8h的兩個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明樣品中卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰膽堿的相對(duì)含量分別為71.2% 、22.1 %、6.7%、22.4%、0、77.6%。

鄭衛(wèi)琴等采用1H-NMR和31P-NMR兩個(gè)圖譜結(jié)合起來(lái)分析高純大豆卵磷脂HLB值的方法，通過建立求算HLB值得方程式HLB=21.4R，可快速有效測(cè)定出非離子表面活性劑大豆卵磷脂不同PC純度的HLB值，這對(duì)產(chǎn)業(yè)化制備高純度卵磷脂有實(shí)質(zhì)性意義，比HPLC法分析更快速，但在準(zhǔn)確度上與HPLC法稍有差距。楊麗華等用31P-NMR法對(duì)磷脂中磷含量及卵磷脂含量進(jìn)行測(cè)定。即用31P-NMR譜測(cè)定總磷含量，并以已知含磷量的三苯基膦為樣品，驗(yàn)證該方法的可行性，誤差在±5%。用31H-NMR譜測(cè)定了磷脂中卵磷脂含量，該方法簡(jiǎn)單便捷，結(jié)果反應(yīng)迅速，可用于對(duì)大豆磷脂含量的快速檢測(cè)。

2．2 大豆中油脂含量的測(cè)定

利用NMR技術(shù)快速無(wú)損測(cè)定成分含量，是一項(xiàng)國(guó)際前沿技術(shù)。馬愛萍等利用索氏提取法、NMR法和NIRS法對(duì)大豆種子脂肪含量進(jìn)行測(cè)量比較，結(jié)果表明NMR法測(cè)定的結(jié)果與索式提取法更接近，偏差均小于95%，最低偏差僅為2%，而NIRS法與索式提取法有較大偏差。宋丹陽(yáng)等用NMR法建立大豆含油量核磁共振法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行了大量樣品數(shù)據(jù)分析（大豆含油量的分析）。NMR法測(cè)定與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)索氏抽提法測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=09632x+07937，相關(guān)系數(shù)為0 98%，與索氏抽提法相比，具有簡(jiǎn)便快速、安全、不損傷種子且不需烘干樣品等優(yōu)點(diǎn)。在大豆品種改良、收購(gòu)及加工利用和進(jìn)出口貿(mào)易等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 NMR技術(shù)在大豆油脂品質(zhì)控制中的應(yīng)用

3．1 大豆油品質(zhì)的測(cè)定

煎炸食品的質(zhì)量與煎炸油的品質(zhì)關(guān)系巨大，油脂的酸價(jià)、碘價(jià)、極性組分含量、煙點(diǎn)、過氧化值、羰基價(jià)等指標(biāo)都是反映其質(zhì)量的重要指標(biāo)。低頻核磁共振（L-NMR）技術(shù)作為一種快速、準(zhǔn)確、無(wú)損的檢測(cè)方法，可廣泛用于油品質(zhì)的監(jiān)測(cè)過程。張瑜等[30]通過核磁共振弛豫時(shí)間T2w與煎炸時(shí)間、酸價(jià)、撥基價(jià)、極性組分含量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，兩者呈負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在0.9058～0.994之間。Justyna Sadowska等同樣對(duì)大豆油的氧化影響進(jìn)行了研究。經(jīng)1H-NMR及13 C-NMR分析，氧化時(shí)間影響大豆油酸價(jià)，粘度和摩爾質(zhì)量。王永巍等同樣應(yīng)用L-NMR技術(shù)對(duì)煎炸大豆油油樣進(jìn)行檢測(cè)，通過對(duì)T2、T2w及S21分析，煎炸4h后圖譜中10ms左右出現(xiàn)特征峰，峰值較小，且S21和T2w與煎炸時(shí)間、酸價(jià)、粘度、吸光度和極性組分含量呈明顯的規(guī)律性，相關(guān)系數(shù)在0.941 ～0.997之間。 分析煎炸過程中，氧化、聚合、水解等反應(yīng)可能產(chǎn)生了不同于甘油三酷的物質(zhì)，導(dǎo)致理化指標(biāo)改變，進(jìn)而引起油脂內(nèi)部磁場(chǎng)的改變，氫質(zhì)子從磁場(chǎng)的激發(fā)態(tài)到平靜狀態(tài)的恢復(fù)時(shí)間發(fā)生了變化。

Maritana Fariasa等在基于氧化鉬（VI）絡(luò)合物運(yùn)用均相催化系統(tǒng)研究大豆油環(huán)氧化問題時(shí)，在800℃條件下，反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)8小時(shí)后，形成單環(huán)氧化物的產(chǎn)品可以從1H-NMR譜中，2.9 ppm處出現(xiàn)有關(guān)形成環(huán)氧基團(tuán)中的氫信號(hào)得到驗(yàn)證。張鐘華等基于核磁共振原理，研制的一種大豆含油量快速測(cè)定儀，與傳統(tǒng)檢測(cè)大豆含油量過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性不夠高的萃取方法相比，該設(shè)備可快速得到大豆含油量讀數(shù)。且測(cè)量范圍為10%～25%，讀數(shù)精確度大于99%。以上研究說(shuō)明L-NMR技術(shù)可有效地反映大豆煎炸油品質(zhì)的改變。楊揚(yáng)等利用1H-NMR，13C-NMR光譜（核磁共振氫譜、碳譜）檢測(cè)了大豆油及地溝油進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地溝油在氫譜圖的δ5.50、δ5.10和δ3.73等處有明顯的雜峰；地溝油在氫譜圖的δ1.26處的峰比δ1.30處明顯強(qiáng)很多；地溝油碳譜圖在δ178.33，δ173.87，δ86.60，δ68. 39和δ65. 06處有明顯的小峰存在，這是由于其產(chǎn)生酸敗和處理過程中有部分甘油酯的分子發(fā)生變化造成的。所以該方法可以作為判斷地溝油的依據(jù)。

3．2 大豆生物柴油品質(zhì)的測(cè)定

Isac G. Rosset等在用南極洲念珠菌固定化脂肪酶催化酶解大豆油時(shí)，利用1H-NMR技術(shù)和氣相色譜對(duì)生成生物柴油過程進(jìn)行定量分析。在1H-NMR譜中，明顯發(fā)現(xiàn)南極念珠菌B型固定化脂肪酶催化大豆油的條件更溫且得率高。1H-NMR技術(shù)和氣相色譜均可對(duì)其進(jìn)行表征，但1H-NMR技術(shù)更加簡(jiǎn)便。M.R. Monteiro等使用1H-NMR定量描述大豆油制備生物柴油過程，采用核磁共振和積分運(yùn)算分析油脂結(jié)構(gòu)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，1H-NMR法可以不受任何生物柴油或柴油類型的影響，因此，這種技術(shù)是特別有價(jià)值的測(cè)定方法。

4 結(jié)語(yǔ)

自從二十世紀(jì)中葉以來(lái)，就有關(guān)于NMR技術(shù)在大豆科學(xué)研究中應(yīng)用的報(bào)道出現(xiàn)，但大多數(shù)是研究NMR技術(shù)的表層機(jī)理。建立NMR技術(shù)在大豆蛋研究，大豆特定成分檢測(cè)及在大豆油脂品質(zhì)控制等領(lǐng)域的綜合評(píng)價(jià)體系，是未來(lái)探索的重要方向之一。這類體系的建立，不僅可以更廣泛的準(zhǔn)確定量檢測(cè)目標(biāo)成分，同時(shí)也可以更加快速便捷的獲得試驗(yàn)結(jié)果，這將對(duì) NMR技術(shù)在大豆科學(xué)研究中的應(yīng)用有極為重要的意義。

[1]高明珠．核磁共振技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展[J]．信息記錄材料,2011(03): 48-51．

[2]黃友如,裘愛泳,華欲飛．核磁共振技術(shù)在大豆蛋白研究中應(yīng)用[J]．糧食與油脂,2004(02): 19-21．

哈爾濱商業(yè)大學(xué)創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目 201510240162

程健博(1991—)，男，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)．

?通訊作者：張根生(1964—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。