史珣貝林昶楊仕明吳南

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,福建省耳鼻咽喉研究所(福州350005)

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點實驗室（北京100853）

·技術(shù)與方法·

過表達mitf基因腺相關(guān)病毒的構(gòu)建與鑒定

史珣貝1林昶1楊仕明2吳南2

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,福建省耳鼻咽喉研究所(福州350005)

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點實驗室（北京100853）

目的獲得能夠過表達小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(mitf）的重組腺相關(guān)病毒載體，用于mitf基因突變相關(guān)疾病的基因治療。方法利用PCR擴增獲得目的基因，構(gòu)建攜帶目的基因mitf的重組腺相關(guān)病毒載體，利用人工脂質(zhì)體法將pAAV-RC，pHelper,以及pAAV-GFP系列載體轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，采用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法進行重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建，利用柱純化法純化病毒載體，qPCR法測定重組腺相關(guān)病毒載體滴度，病毒載體感染HEK293細(xì)胞進行病毒有效性及安全性鑒定，real-time PCR與western blot法進行mitf表達的鑒定。結(jié)果PCR擴增和測序結(jié)果一致證實成功獲得目的基因并且成功構(gòu)建mitf基因腺相關(guān)病毒載體，測得高水平病毒滴度1.0*10^12vg/ml，病毒載體感染HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為86.3%，并未發(fā)現(xiàn)HEK293細(xì)胞死亡，Real-time PCR及Western blot檢測構(gòu)建Mitf基因轉(zhuǎn)錄mRNA與表達的蛋白與正常MITF一致。結(jié)論成功構(gòu)建的攜帶mitf基因的重組腺相關(guān)病毒載體為未來進行mitf突變導(dǎo)致的遺傳性疾病的基因治療提供新思路。

MITF；腺相關(guān)病毒；基因治療

Foundation item：National 863 project young scientists(2014AA020510);the National Natural Science Foundation of China(NSFC# 81271082,81400472).Special Cultivating and Developing Program of Beijing Science and Technology Innovation Base（z151100001615050)；Key Projects of Fujian Provincial Science and Technology Department(2014I0003);Innovation and drive power engineering project of China association for science and technology（2016CXQD01）.

Declaration of interest:The authors report to no conflicts of interest.

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）位于小鼠6號染色體，人類染色體3p12.3–14.1位點，由Mitf基因編碼的含有419個氨基酸，分子量大小約為46kDa，具有組織特異性的，含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈（bHLH-Zip）的二聚體結(jié)構(gòu)[1-3]。Mitf通過bHLH-Zip結(jié)構(gòu)域識別位于靶基因啟動子區(qū)上的E-box特異序列（CATGTG），結(jié)合后啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。MITF對于黑色素細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，肥大細(xì)胞以及破骨細(xì)胞的發(fā)育以及維持細(xì)胞形態(tài)都有重要的作用[5]。因此，MITF突變會造成多種疾病發(fā)生，例如Waardenburg綜合征，視網(wǎng)膜退行性變，先天小眼球病等疾病。以往研究中使用的動物模型大多是嚙齒類動物（小鼠、大鼠、豚鼠等），或是靈長類動物，嚙齒類動物在遺傳學(xué)方面與人類相差甚遠(yuǎn)，而靈長類動物則存在倫理學(xué)問題。豬是除靈長類以外跟人類進化關(guān)系最相近的物種，并且沒有靈長類動物倫理方面問題，因此以豬為動物模型的科學(xué)研究逐漸增多，在繁殖生理學(xué)、轉(zhuǎn)基因、皮膚生理學(xué)、干細(xì)胞移植等方面都已經(jīng)進行了廣泛的研究[6-7]。因此本實驗根據(jù)正常豬的mitf基因設(shè)計引物，經(jīng)PCR擴增目的基因MITF，重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建、包裝、純化、滴度測定以及表達鑒定，成功構(gòu)建過表達mitf腺相關(guān)病毒載體，為未來在mitf基因突變疾病的基因治療中奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

AAV-CAG-ZsGreen載體由漢恒生物公司提供，NheI和KpnI酶購自Fermentas公司，T4連接酶購自Fermentas公司，大腸桿菌菌株stbl3購自Tiangen公司，抽提質(zhì)粒試劑盒購自康為世紀(jì)，胰酶購自Hy?clone公司，HEK293細(xì)胞由漢恒生物公司提供，Li?pofiterTM轉(zhuǎn)染試劑由漢恒生物公司提供，DNase I及蛋白酶K購自Fermentas公司，Trizol購自Gibco公司，RIPA裂解液購自碧云天公司，PVDF膜購自Millipore公司，MITF雙抗購自Invitrogen公司，β-actin購自In?vitrogen公司，SDS-PAGE分離膠購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建

根據(jù)已知目的基因MITF(sus scrofa,Gene ID:NM_ 001038001.1)cDNA序列設(shè)計合成基因擴增引物，利用化學(xué)合成法獲取目的基因。目的片斷插入Nhe I和Kpn I位點，由CAG啟動子調(diào)控表達，CAG啟動子后為多克隆位點區(qū)，載體中含有ZsGreen標(biāo)記基因，PCR擴增MITF基因,引物設(shè)計為F5’-ATATGCTAG?CACGCGTGCCACCATGCTGGAAATG-TAGAATATAAT-3’，R5’-ATATGGTACCGCAAGCATGCTCGGTTTCTTCCAT-3’。

AAV-CAG-ZsGreen載體用Nhe I和Kpn I酶切，酶切完成后進行膠回收。利用PCR高溫變性94℃20s，低溫退火55℃20s，引物延伸72℃90s，共25個循環(huán)，獲得的目的基因MITF片段，在T4連接酶作用下與載體進行連接反應(yīng)。氨芐霉素抗性板上37℃培養(yǎng)過夜，在感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌菌株stbl3中轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的MITF平板挑菌,37℃250轉(zhuǎn)/分鐘搖菌14小時，菌液進行PCR鑒定，將陽性克隆菌液送測序公司測序，進行測序結(jié)果比對。

1.2.2 腺相關(guān)病毒包裝

用抽提質(zhì)粒試劑盒大量提取質(zhì)粒，0.25%胰酶加入到HEK293細(xì)胞中充分消化細(xì)胞，加入預(yù)先預(yù)熱過的10%DMEM混勻，取出50μl細(xì)胞懸液再次加入10%DMEM，即為10倍稀釋，混勻，取10ul細(xì)胞于計數(shù)板中計數(shù)。計數(shù)板共4大格16小格。觀察細(xì)胞密度，80-90%滿即可進行轉(zhuǎn)染。將加入LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑的含有pAAV-RC 10μg，pHelper 20μg，以及pAAV-GFP系列載體的混合物共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72h，將培養(yǎng)皿中所有細(xì)胞用收于離心管中，將離心管在液氮及37℃水浴反復(fù)凍融三次。離心收集含病毒的上清液。用全能核酸酶處理37℃孵育1h，離心取上清液，得到的AAV病毒液加入樹脂柱進行柱純化，收集最終得到的純化后的病毒，于-70°C保存。

1.2.3 重組AAV-MITF滴度的鑒定

DNase I及蛋白酶K反應(yīng)液消化AAV病毒樣品。用PCR緩沖液將稀釋標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同拷貝梯度105、106、107、108、109、1010。QPCR測定，反應(yīng)體系為2X mix 4.8μl，引物-F 0.4μl，引物-R 0.4μl，模板1μl，水3μl。經(jīng)一次95°C 180s預(yù)變性后，94°C 30s變性，62°C 30s退火，72°C 30s延伸，進行40個循環(huán)，利用統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 重組AAV-MITF感染HEK293細(xì)胞

傳代HEK293細(xì)胞至96孔板，直至10^4細(xì)胞/孔進行轉(zhuǎn)染。次日，純化后的重組AAV-MITF-GFP轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，每孔加入5μl過表達mitf重組腺相關(guān)病毒載體。轉(zhuǎn)染后三天熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。

1.2.5 重組AAV-MITFReal-timePCR及westernblot檢測

取目的病毒和等滴度的對照病毒感染HEK293細(xì)胞，48小時后回收細(xì)胞。一部分細(xì)胞先后加入裂解液Trizol混勻裂解，提取RNA。95℃180s預(yù)變性后，經(jīng)過高溫退火94℃15s，低溫變性60℃30s，引物延伸72攝氏度30s，共40個循環(huán)。利用紫外分光光度計檢測RNA提取質(zhì)量，并通過RNA瓊脂糖凝膠電泳分析。剩下一部分細(xì)胞加入1mlRIPA裂解液10μlPMSF，充分裂解離心，取上清液。配置10% SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠，將上清液加入上樣孔中，以110V恒壓條件電泳，直至出現(xiàn)溴酚藍指示劑，停止電泳。將PVDF膜預(yù)先用5%牛血清室溫封閉1h，以110V恒壓將膠上的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)PVDF膜上，用MITF一抗（1：1000）及β-actin（1：1000）4℃過夜孵育，TBST洗膜3遍后加入二抗（1：1000）室溫孵育1h，進行Western-blot蛋白檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組腺相關(guān)病毒AAV-MITF的構(gòu)建及鑒定

利用PCR獲取MITF目的基因（圖1），MITF長度為1242bp，插入到pAAV-CAG-ZsGreen過表達載體，插入位點為Nhe I和Kpn I位點，由CAG啟動子調(diào)控表達，載體中含有ZsGreen標(biāo)記基因。重組腺相關(guān)病毒由氨卞霉素挑選出陽性克隆菌液，菌液進行PCR鑒定（圖2）。DNA測序結(jié)果顯示克隆MITF基因與正常MITF基因序列一致。

圖1 PCR獲取目的基因MITFFig.1 Target gene MITF via PCR

圖2 單克隆PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Results of monoclonal PCR identification

2.2 重組腺相關(guān)病毒AAV-MITF的滴度測定

統(tǒng)計軟件得到原始數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)公式及R平方值。根據(jù)曲線的函數(shù)公式，計算待測AAV樣品對應(yīng)的拷貝數(shù)對數(shù)X，進一步換算成拷貝數(shù)10X及病毒滴度vg/ml。測得mitf病毒滴度為1.0* 10^12vg/ml。

2.3 重組腺相關(guān)病毒AAV-MITF感染HEK293細(xì)胞

重組腺相關(guān)病毒AAV-MITF轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞3天后，在熒光顯微鏡下持續(xù)觀察96h轉(zhuǎn)染結(jié)果。圖中顯示隨機選取96孔板中的3孔轉(zhuǎn)染病毒載體后在熒光顯微鏡下觀察白光和對應(yīng)區(qū)域熒光下的觀察結(jié)果（圖3）。計數(shù)每孔中出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)后取平均值，計算出有86.3%的HEK293細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染病毒后出現(xiàn)HEK293細(xì)胞死亡現(xiàn)象。

圖3 AAV-MITF感染293細(xì)胞情況（圖1、2、3分別為隨機3孔細(xì)胞在同一區(qū)域白光和對應(yīng)熒光的觀察結(jié)果）Fig.3 AAV-MITF infection in 293 cells（Figures3(1),(2),(3) are the results of the observation of the white light and the corresponding fluorescence in the same region,respectively)

2.4 MITF基因Real-timePCR鑒定及Westernblot鑒定

病毒感染293細(xì)胞48小時后回收一部分細(xì)胞進行總RNA提取，經(jīng)檢測目的基因病毒載體AAV-MITF及對照病毒載體經(jīng)紫外分光光度計測得OD260/OD280及OD260/OD230比值均在正常范圍內(nèi)，表示RNA在提取分別測得RNA濃度為382ng/ μl，306ng/μl（圖1）。提取后的總RNA進行qPCR檢測，RNA瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如下（圖5）。另一部分細(xì)胞制備蛋白樣品進行western-blot檢測，經(jīng)免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光成像后，結(jié)果顯示AAV-MITF可以在293細(xì)胞中穩(wěn)定表達MITF蛋白（圖6）。

表4 紫外分光光度計檢測RNA提取質(zhì)量檢測結(jié)果Table 4 UV spectrophotometer detection of RNA extraction quality test results

圖5 RNA瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果Fig.5 Results of RNAagarose gel electrophoresis(M:DL2000 DNA ladder，條帶自上而下為2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp；1：vector；2：OE)

圖6 western blot檢測mitf表達情況Fig.6 Western blot detection of mitf expression(1：vector；2：MITF過表達樣品)

3 討論

MITF基因具有多啟動子，它至少有9種不同的啟動子-外顯子結(jié)構(gòu)來決定MITF的不同類型，因此MITF存在不同亞型，它由第一個外顯子以及不同啟動子決定，下游外顯子是相同的，而不同亞型表達在不同細(xì)胞內(nèi)[5,8]。MITF-M mRNA特異性表達在黑色素細(xì)胞中以及黑色素瘤細(xì)胞中，在其他細(xì)胞類型中沒有發(fā)現(xiàn)，包括人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[9]。MITF-M與特異性的色素酶基因（酪氨酸酶TYR，酪氨酸酶相關(guān)蛋白TYRP，多巴色素互變異構(gòu)酶DCT）作用，調(diào)控黑色素細(xì)胞的存活與分化[1]。MITF在多種組織器官中都對于特定細(xì)胞的發(fā)育與分化起到至關(guān)重要的作用。Paula Hertwig從接受X射線66號治療的小鼠后代中出現(xiàn)的小眼白色小鼠中發(fā)現(xiàn)并且介紹了第一個小鼠Mitf突變，直至目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過24種自發(fā)和誘導(dǎo)的Mitf等位基因突變位點[10]。Mitf突變會導(dǎo)致多種遺傳性疾病，例如研究較為廣泛的Waardenburg綜合征。Waardenburg綜合征分為四型，其中Waardenburg綜合征II型是一種先天性遺傳性疾病，表現(xiàn)為先天性聾，色素異位。我們研究團隊在中國重慶榮昌縣發(fā)現(xiàn)一個與人類Waardenburg綜合征表型高度一致的豬種，已經(jīng)確定榮昌豬的耳聾突變家系就是由于MITF突變導(dǎo)致，并且進一步研究表明是由于MITF-M出現(xiàn)插入突變導(dǎo)致。內(nèi)耳的黑色素細(xì)胞位于血管紋的中間細(xì)胞，血管紋的主要功能是分泌鉀離子產(chǎn)生內(nèi)淋巴電位。根據(jù)文獻研究表明MITF-M突變的白化榮昌豬毛細(xì)胞和靜纖毛缺失，血管紋變薄，只剩兩層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，檢測不到可識別的ABR波形，內(nèi)淋巴電位（EPs)和鉀離子濃度都低于正常豬。由于EPs和高鉀環(huán)境是毛細(xì)胞將機械能轉(zhuǎn)換成電能的主要驅(qū)動力，所以EPs減少及鉀離子濃度減低會造成極重度耳聾[11]。遺傳性耳聾目前主要通過助聽器及人工耳蝸植入方式治療，雖取得一定的治療效果，但是花費巨大，因此科學(xué)家們將基因治療作為遺傳性耳聾治療的研究重點。本實驗中我們通過查找豬來源MITF的片段設(shè)計引物，進行PCR擴增獲取MITF目的基因，單克隆CPR鑒定結(jié)果以及測序結(jié)果表明構(gòu)建的MITF基因與野生型MITF基因一致，這表明此構(gòu)建的過表達mitf重組腺相關(guān)病毒載體可以為未來進行以白化榮昌豬為動物模型進行遺傳性耳聾基因治療提供研究基礎(chǔ)。

在以往的研究中，曾經(jīng)有研究者通過重組腺病毒載體包載野生型mitf基因轉(zhuǎn)染B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞以及人類黑色素細(xì)胞[12]。但腺病毒不能整合到宿主的基因組中，并且會產(chǎn)生較強的免疫原性[13]。而腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus,AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒，是目前所發(fā)現(xiàn)的動物病毒中最小的病毒，其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒[14]。在病毒載體中它的優(yōu)勢在于：1.安全性高；2.免疫原性弱；3.宿主范圍廣；4.物理性質(zhì)穩(wěn)定；5.表達穩(wěn)定[13]。所以腺相關(guān)病毒是目前基因治療中常用的載體之一，并且已經(jīng)取得了初步的研究結(jié)果。Omar Akil利用Vglut3基因敲除小鼠模型，將AAV1-VGLIT3-GFP導(dǎo)入小鼠耳蝸中，成功使耳聾小鼠ABR閾值恢復(fù)至正常范圍內(nèi)，并且至少持續(xù)7w，其中有兩只小鼠可以保持1年半[13,15]。因此本實驗選用腺相關(guān)病毒包載目的基因mitf，利用雙酶切方法構(gòu)建過表達mitf基因重組腺相關(guān)病毒載體，并進行了純化及滴度測定，證明此構(gòu)建的過表達Mitf重組腺相關(guān)病毒載體具有有效滴度。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞結(jié)果顯示綠色熒光蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達率為86.3%，并且無HEK293細(xì)胞死亡現(xiàn)象，證明病毒載體具有安全性和有效性。Western blot及RT-PCR檢測證明過表達mitf基因重組腺相關(guān)病毒載體可以有效轉(zhuǎn)錄出正常Mitf基因的mRNA并且可以表達出正常的MITF蛋白，大小為46KDa。本次研究首次成功構(gòu)建過表達mitf重組腺相關(guān)病毒載體，這一載體的構(gòu)建不僅為白化榮昌豬遺傳性耳聾的基因治療提供基礎(chǔ)，也為未來進行MITF突變導(dǎo)致的其他遺傳性疾病的基因治療提供新思路。

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Construction and qualification of recombinant mitf adeno-associated virus gene vector

SHI Xunbei1,LIN Chang1,YANG Shiming2WU Nan2
1 Department of Otolaryngology,First Affiliated Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China
2 Department Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Oto-Neurobiology Centre,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

ObjectiveTo construct a recombinant adeno-associated virus vector for potential gene therapy for mitf mutations.MethodsWe acquired the target gene via PCR amplification.pAAV-RC,pHelper and pAAV-GFP were transfected into HEK293 cells using the artificial liposome method and the recombinant adeno-associated virus vector product was purified via column purification.Titers of the recombinant adeno-associated virus vector were determined by qPCR.The recombinant adeno-associated virus vector was used to infect 293 cells.Real-time PCR and western blot were used to identify expression of the recombinant adeno-associated virus vector carrying mitf.ResultsPCR amplification and DNA sequencing illustrated that the target gene and recombinant adeno-associated virus vector were constructed successfully with high titers (1.0*10^12 vg/ml).Recombinant adeno-associated virus vectors infected 293 cells successfully with an expression efficiency of 86.3%.No cell death was found.The constructed mitf gene was equivalent to the normal mitf gene based on real-time PCR and western blot results.ConclusionThe recombinant adeno-associated virus vector carrying mitf provides a new way of gene therapy for hereditary diseases caused by mitf mutations.

MITF,adeno-associated virus vector,gene therapy

R764

A

1672-2922（2016）06-841-5

2016-12-04審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.06.027

國家863青年科學(xué)家項目(2014AA020510)；國家自然科學(xué)基金（面上項目81271082，青年基金81400472）；北京科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展專項（z151100001615050）；福建省科技廳重點項目（2014I0003）；中國科協(xié)創(chuàng)新驅(qū)動助力工程（2016CXQD01）。

史珣貝，研究生，研究方向：毛細(xì)胞再生及基因治療

吳南,Email:maxpanda1979@126.com