李建達，于 江，張玉玉，任素芳，陳 蕾，郭立輝，孫文博，陳 智，王 淞1，，劉俊珍，杜以軍，李 俊，楊靈芝，王金寶1，＊，吳家強＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，青島266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，濟南250100；3.山東濱州沃華生物工程有限公司，濱州256600）

豬鏈球菌2型實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

李建達1，2§，于 江2§，張玉玉2，任素芳2，陳 蕾2，郭立輝2，孫文博2，陳 智2，王 淞1，2，劉俊珍2，杜以軍2，李 俊2，楊靈芝3，王金寶1，2＊，吳家強2＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，青島266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，濟南250100；3.山東濱州沃華生物工程有限公司，濱州256600）

摘 要：試驗根據(jù)豬鏈球菌2型莢膜多糖（CPS）抗原設計CPS2J基因特異性引物，建立豬鏈球菌2型實時熒光定量PCR檢測方法。結果顯示，該方法的標準曲線為y＝－3.073x＋36.87，r＝0.995，熔解曲線只有單一的特異峰。敏感性試驗顯示，該方法可以檢測出模板最低濃度為1.0×101拷貝／μL，是普通PCR的10倍；特異性試驗顯示，對豬鏈球菌2型具有良好的特異性，能夠區(qū)分其他血清型豬鏈球菌和其他細菌；重復性試驗變異系數(shù)為0.37%～0.63%，均低于2.5%。臨床檢測顯示該方法的敏感性明顯高于常規(guī)PCR方法和細菌分離的方法。以上結果表明，本研究建立的方法敏感性高、特異性強、重復性好，有利于對豬鏈球菌2型的快速檢測。

關鍵詞：豬鏈球菌2型；實時熒光定量PCR；敏感性；特異性；重復性

豬鏈球菌（Streptococcussuis）是一種危害嚴重的人獸共患病病原菌，臨床上以引起豬腦膜炎、關節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥和突發(fā)死亡等癥狀為主。至今，已鑒定出35個血清型（1～34型及1／2型）［1］。引起豬發(fā)病的主要血清型是1、2、7、9型，其中2型不僅致病性強，而且流行較為廣泛。1991年中國廣東省首次報道了豬鏈球菌2型病的發(fā)生；1998—1999年夏季江蘇省部分豬群暴發(fā)此病，嚴重威脅人畜健康［2］；2005年7月四川資陽暴發(fā)豬鏈球菌2型病并引起人員死亡［3］。目前，常規(guī)的細菌分離、抗體檢測不易區(qū)分豬鏈球菌的血清型。普通PCR無法對病料細菌進行定量檢測，而且會出現(xiàn)假陽性。實時熒光定量PCR不僅敏感性高、特異性強、易于操作，而且結果準確、直觀，并具有實時定量性，已經(jīng)廣泛用于病原微生物的檢測［4］。莢膜多糖（CPS）是豬鏈球菌的毒力因子［5－6］，CPS對豬鏈球菌2型的侵襲力有決定性作用，可以在未免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生具有抗吞噬活性的抗體，保護細菌不被巨噬細胞吞噬［7－8］。CPS2J是豬鏈球菌2型CPS中一段高度保守的序列，本試驗以CPS2J基因為靶基因設計引物，建立豬鏈球菌2型SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法，為實現(xiàn)對豬鏈球菌2型的快速診斷和定量分析提供科學方法。

1 材料與方法

1.1菌株

豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬傳染性胸膜肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌菌株均由山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所實驗室分離鑒定保存；馬獸疫鏈球菌菌株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）。

1.2主要試劑及儀器

SYBR?Premix ExTaqTMⅡ、TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNA Marker、pMD18－T載體等均購自寶生物工程（大連）有限公司；Trans－T1感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。NanoDrop2000超微量分光光度計購自Thermo Fisher Scientific公司；Light－Cycler?480Ⅱ購自Roche公司。

1.3引物設計與合成

根據(jù)豬鏈球菌2型莢膜抗原基因簇CPS2J基因（GenBank登錄號：AF118389）序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物序列為：CPS2J（P1）：5′－GAAAAAGTCAGCATTATTGTACCTATT－3′；CPS2J（P2）：5′－CTGAAGAACCGTCATCTATCAAAAG－3′，預計擴增目的片段為124bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4常規(guī)PCR擴增

采用直接煮沸法提取豬鏈球菌2型DNA，PCR反應體系25μL：10×Buffer（含Mg2＋）2.5μL，dNTP 2μL，上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 16μL。PCR反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，34個循環(huán)；72℃再延伸10min。反應結束后，用5μL PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5質(zhì)粒標準陽性模板的制備

1.5.1PCR產(chǎn)物的純化回收及克隆鑒定 將鑒定正確的PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化提取目的片段。將目的片段連接pMD18－T載體，轉化Trans－T1感受態(tài)細胞，在LB培養(yǎng)基（含Amp，100μg／mL）中培養(yǎng)，而后挑取陽性菌落進行單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行PCR、酶切鑒定，并將陽性質(zhì)粒送于上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.5.2重組質(zhì)粒濃度測定與標準樣品的制備用紫外分光光度計測定陽性質(zhì)粒的濃度，計算拷貝數(shù)，并將質(zhì)粒濃度稀釋到1.0×1010拷貝／μL，再倍比稀釋至1.0×105拷貝／μL，用以上稀釋度作為標準樣品模板，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6實時熒光定量PCR方法的建立

PCR反應體系為20μL：SYBR Premix ExTaqⅡ用量范圍為8～12μL，引物范圍為0.5～1μL，模板用量范圍為1～2μL。退火溫度選用范圍為58～60℃。對SYBR Premix Ex TaqⅡ、引物和模板的濃度進行篩選，優(yōu)化反應條件。

1.7標準曲線的建立

分別以1.0×105～1.0×1010拷貝／μL 10倍倍比稀釋的陽性質(zhì)粒作為模板，進行實時熒光定量PCR，得出各自動力學曲線，通過儀器軟件建立標準曲線。

1.8敏感性試驗

分別以1.0×100～1.0×107拷貝／μL倍比稀釋的樣品作為模板，進行實時熒光定量PCR檢測，同時用常規(guī)PCR進行檢測，比較兩種方法的敏感性。

1.9特異性試驗

用建立的實時熒光定量PCR反應體系檢測豬鏈球菌7型、馬獸疫鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、傳染性胸膜肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌，確定該方法的特異性。

1.10重復性試驗

取1.0×108、1.0×105、1.0×103拷貝／μL的標準樣品，每組重復3次，進行實時熒光定量PCR檢測，并計算每個稀釋度的變異系數(shù)。

1.11臨床樣品檢測

對24頭臨床癥狀疑似豬鏈球菌2型的病豬，采集關節(jié)液、心包液、肺臟、肝臟、心血，分別用細菌分離培養(yǎng)、常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR檢測，并對試驗結果進行比較。

2 結果與分析

2.1目的片段的克隆及鑒定

將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接，獲得重組質(zhì)粒，進行常規(guī)PCR擴增，得到一條124bp的條帶（圖1），與目的片段大小一致。重組質(zhì)粒測序結果與目的片段序列完全一致。

圖1　PCR擴增目的片段Fig.1 PCR amplification of targeted fragment

2.2實時熒光定量PCR方法的建立

優(yōu)化后的實時熒光定量PCR反應體系為20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物各1μL，模板2μL，ddH2O 6μL。實時熒光定量PCR反應條件：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。熔解曲線見圖2。由圖2可知，所有陽性質(zhì)粒只出現(xiàn)一種熒光峰，峰型單一，沒有雜峰，說明引物設計合理。

2.3標準曲線的建立

以標準品拷貝數(shù)對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標建立標準曲線，結果見圖3。由圖3可知，標準曲線方程為：y＝－3.073x＋36.87，r＝0.995，表明相關程度極高且呈正相關。

圖2　熔解曲線Fig.2 Melting curve

圖3　標準曲線Fig.3 Standard curve

2.4敏感性試驗

將陽性質(zhì)粒依次倍比稀釋作為模板，一般認為Ct值＞35時計為陰性，實時熒光定量PCR反應結果見圖4，常規(guī)PCR擴增結果見圖5。由圖4可知，此方法可檢測出模板最低濃度為1.0×101拷貝／μL，而常規(guī)PCR可以檢測出模板最低濃度為1.0×102拷貝／μL（圖5），說明實時熒光定量PCR的敏感性比常規(guī)PCR高10倍。

2.5特異性試驗

以馬獸疫鏈球菌、豬鏈球菌7型、副豬嗜血桿菌、豬巴氏桿菌、豬傳染性胸膜肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌為模板進行實時熒光定量PCR，檢測結果（Ct值＞35時，計為陰性）均為陰性（圖6），表明本試驗方法具有較高的特異性。

2.6重復性試驗

由表1可知，1.0×108、1.0×105、1.0×103拷貝／μL的標準樣品的變異系數(shù)分別為0.63%、0.37%和0.59%，均低于2.5%，說明該方法具有良好的穩(wěn)定性和重復性。

2.7臨床樣品檢測

對24頭臨床癥狀疑似豬鏈球菌2型的病豬分別進行細菌分離、常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR檢測，結果見表2。由表2可知，實時熒光定量PCR的敏感性高于常規(guī)PCR，且明顯高于細菌分離方法。所得檢測結果經(jīng)國標法（GB 19915.7—2005）復檢，實時熒光定量PCR檢測與國標法的檢測結果一致率達100%。

圖4　實時熒光定量PCR敏感性試驗Fig.4 Sensibility tests of quantitative Real－time PCR

圖5　常規(guī)PCR敏感性試驗Fig.5 Sensibility tests of PCR

圖6　實時熒光定量PCR特異性試驗Fig.6 Specialty tests of quantitative Real－time PCR

表1　實時熒光定量PCR重復性試驗Table 1 Repeatability test of quantitative Real－time PCR

表2　臨床樣品檢測Table 2 The test of clinical samples

3 討 論

豬鏈球菌2型是豬鏈球菌中毒力最強、危害最嚴重、流行最廣泛的血清型之一［9－10］。豬鏈球菌可定植于健康豬的扁桃體內(nèi)，帶菌率高達42.6%［11］，而隨著豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）和豬圓環(huán)病毒?。≒CV）等免疫抑制性疾病的流行，導致豬鏈球菌2型感染率明顯上升［12－14］。

目前，檢測該菌的方法主要是細菌分離鑒定和常規(guī)PCR檢測，細菌分離鑒定方法不僅耗時、易污染，而且不易區(qū)分豬鏈球菌的血清型［14］。常規(guī)PCR方法雖然能夠檢測出豬鏈球菌2型，具有較高的特異性，但操作時間長、操作繁瑣、敏感性低，而且存在假陽性的可能［15］。本試驗建立了豬鏈球菌2型實時熒光定量PCR檢測方法，不僅操作簡單快速、不易出現(xiàn)假陽性，而且可以對樣品進行定量分析［16］，對臨床的診斷和檢測具有指導性意義。

CPS是唯一被證明的豬鏈球菌2型主要的毒力因子，在細菌致病過程中起著重要作用，有研究表明，缺失CPS基因的變異株完全喪失毒力，能很快被清除［17－19］。CPS對豬鏈球菌2型的侵入有決定性作用，可以在未免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生具有抗吞噬活性功能的抗體，保護細菌不被吞噬［20］。莢膜的存在降低了豬鏈球菌被吞噬的程度，有研究表明缺失莢膜多糖的菌株疏水性增強，更容易被吞噬［21－22］。CPS2J基因是豬鏈球菌2型莢膜抗原基因簇，序列高度保守，與其他血清型同源性低。本試驗選取CPS2J為靶基因設計引物，通過構建質(zhì)粒，將倍比稀釋的陽性質(zhì)粒作為實時熒光定量PCR模板，建立了豬鏈球菌2型實時熒光定量PCR檢測方法。利用建立的方法對其他不同血清型的豬鏈球菌和其他細菌進行檢測，結果顯示，只有豬鏈球菌2型有擴增曲線，表明該方法具有較高的特異性；重復性試驗結果表明，3組變異系數(shù)均低于2.5%，說明該方法具有較好的重復性。該方法可以檢測出最低濃度為1×101拷貝／μL，敏感性優(yōu)于普通PCR。

4 結 論

本試驗通過優(yōu)化熒光定量PCR反應體系，建立了重復性較好的標準曲線，成功建立了豬鏈球菌2型實時熒光定量PCR檢測方法，該方法有較高的特異性、重復性和敏感性，對豬鏈球菌2型的快速檢測及豬鏈球菌防控有重要意義。

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（責任編輯 姚倩倩）

中圖分類號：S858.28

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3107－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.004

收稿日期：2016－05－18

基金項目：泰山學者特聘專家工程經(jīng)費；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（SDAIT）；山東省農(nóng)業(yè)科學院重大科技成果培育計劃（2014CGPY04）；山東省農(nóng)業(yè)重大應用技術創(chuàng)新項目；山東省自然科學基金（ZR2015YL078）；山東省農(nóng)業(yè)科學院青年科研基金（2015YQN51）；山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2016B14）

作者簡介：李建達（1992－），男，山東濟南人，碩士生，研究方向：動物微生物與免疫學，E－mail：ljd4453＠163.com于 江（1985－），女，山東萊州人，博士，研究方向：動物微生物與免疫學，E－mail：yujiang＿2213＠163.com李建達和于江對本文具有同等貢獻，并列為第一作者

通信作者：＊王金寶（1962－），男，山東昌邑人，教授，博士生導師，研究方向：動物病原學與免疫學，E－mail：wangjb＠saas.ac.cn吳家強（1975－），男，山東諸城人，博士，研究員，研究方向：動物病原學與免疫學，E－mail：wujiaqiang2000＠sina.com

Establishment and Application of Quantitative Real－time PCR Method to DetectStreptococcussuisSerotype 2

LI Jian－da1，2§，YU Jiang2§，ZHANG Yu－yu2，REN Su－fang2.CHEN Lei2，GUO Li－h(huán)ui2，SUN Wen－bo2，CHEN Zhi2，WANG Song1，2，LIU Jun－zhen3，DU Yi－jun2，LI Jun2，YANG Ling－zhi3，WANG Jin－bao1，2＊，WU Jia－qiang2＊
（1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China；2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100，China；3.WohuaBiotechCo.，Ltd.，Binzhou256600，China）

Abstract：In this study，aquantitative Real－time PCR method using the specific primers according toCPS2Jgene was established to detectStreptococcussuisserotype 2.The result showed that the equation of standard curve was y＝－3.073x＋36.87，r＝0.995，which demonstrated that the assay had good linear relationship.The melting curve analysis showed that there was only specific peak.Sensitivity test showed that the method could detect the template at the lowest concentration of 1.0×101copies／μL，which was 10times higher than the ordinary PCR.The specific tests showed that this method could able to detectStreptococcussuisserotype 2specially and had nocross－reaction with other serotypes or other bacteria from swine.The CV of repeatability test was 0.37%to 0.63%，lower than 2.5%.The clinical diagnosis showed this assay was more sensitive than ordinary PCR and bacteria isolation.All the results showed that the established method was sensitive，specific and reproducible，which could be used for the rapid diagnosis and quantitative detection ofStreptococcussuisserotype 2.

Key words：Streptococcussuisserotype 2；quantitative Real－time PCR；sensibility；specificity；repeatability