單核細胞趨化蛋白-1 A-2518G基因多態(tài)性與2型糖尿病及葡萄糖耐量異常的關系▲

陳 冰 王美寧 何海寧 黃勇奇 蔣杰球 唐智清 劉巧玲

(1 廣西醫(yī)科大學附屬南寧市第一人民醫(yī)院內(nèi)科，南寧市 530022，E-mail：bbc12306@hotmail.com；2 南方電網(wǎng)公司醫(yī)務所；3 廣西醫(yī)科大學生化教研室；4 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，南寧市 530022)

論著·臨床研究

單核細胞趨化蛋白-1 A-2518G基因多態(tài)性與2型糖尿病及葡萄糖耐量異常的關系▲

陳 冰1王美寧1何海寧2黃勇奇3蔣杰球4唐智清1劉巧玲1

(1 廣西醫(yī)科大學附屬南寧市第一人民醫(yī)院內(nèi)科，南寧市 530022，E-mail：bbc12306@hotmail.com；2 南方電網(wǎng)公司醫(yī)務所；3 廣西醫(yī)科大學生化教研室；4 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，南寧市 530022)

目的 探討單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)A-2518G基因多態(tài)性與葡萄糖耐量異常(IGT)、新發(fā)2型糖尿病(T2DM)的關系。方法 對111例健康人(NC組)、82例IGT患者(IGT組)及76例新發(fā)T2DM患者(T2DM組)采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性技術，觀察MCP-1A-2518G基因多態(tài)性，分析其與IGT和T2DM的關系。結果 IGT、T2DM組與NC組的MCP-1等位基因和基因頻率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，logistic回歸分析結果顯示，腰臀比、胰島素抵抗指數(shù)、MCP-1 AA是IGT及新發(fā)T2DM發(fā)病的獨立危險因素(P<0.05)。結論 MCP-1 A-2518G基因多態(tài)性可能參與IGT及新發(fā)T2DM的發(fā)病機制，AA基因攜帶增加人群IGT及新發(fā)T2DM的患病風險。

2型糖尿??；葡萄糖耐量異常；單核細胞趨化蛋白-1；胰島素抵抗；基因多態(tài)性

糖耐量異常(impaired glucose tolerance，IGT)，也稱為糖尿病前期，是介于正常血糖和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的中間血糖狀態(tài)，與T2DM一樣是以胰島素抵抗及胰島素分泌異常為特征的慢性代謝性疾病[1]。胰島素抵抗是IGT及T2DM發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，也是代謝綜合征的基礎障礙。肥胖是導致胰島素抵抗的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)肥胖及T2DM患者循環(huán)血中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)等水平升高，體重減輕可以降低這些免疫介質(zhì)的水平[2-3]。鼠動物模型研究發(fā)現(xiàn)鼠脂肪組織MCP-1表達增高，MCP-1通過減少脂質(zhì)堆積、蛋白酪氨酸磷酸化、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4表達及胰島素刺激的葡萄糖攝取等多方面影響脂肪細胞的代謝[4]。在人體的研究發(fā)現(xiàn)，IGT及T2DM患者血漿MCP-1水平升高[3，5]，這些研究表明脂肪組織細胞浸潤與肥胖相關的胰島素抵抗有關。

不同的遺傳背景在趨化因子中的表達是造成個體之間炎癥嚴重程度差異的主要原因。人MCP-1的轉(zhuǎn)錄在5′未翻譯區(qū)內(nèi)受兩個不同區(qū)域的調(diào)控。其遠端含有兩個核轉(zhuǎn)錄因子-kB(nuclear factor-kB，NF-kB)結合區(qū)，是獨立于細胞因子調(diào)節(jié)所必需的，而近端區(qū)域含有一個GC盒，主要是為了調(diào)節(jié)組織特異表達。在-2518位置一個常見的A→G的基因變異在遠端調(diào)節(jié)區(qū)調(diào)控MCP-1表達[5]。已有研究報告該基因變異與T2DM、胰島素抵抗[5]、心血管疾病[6]相關。本研究存在探討MCP-1 A-2518G基因多態(tài)性與IGT、T2DM的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 抽取2006年7月及2013年5～8月在我院體檢的健康人群111例為正常對照組(NC組)，其中男62例，女49例，年齡33～62(47.31±6.94)歲，均無糖尿病、心血管疾病，無其他內(nèi)分泌及代謝系統(tǒng)疾病，無感染、無糖尿病家族史。選取同期IGT患者(IGT組)82例，其中男48例，女34例，年齡42～65(52.15±5.12)歲，新發(fā)T2DM患者(T2DM組)76例，其中男36例，女40例，年齡46～66(54.67±4.29)歲，IGT及T2DM組符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標準[7]。T2DM患者均為首次診斷患者，彼此間無親緣關系，T2DM組及IGT組無明顯的慢性肝臟疾病及其他內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)疾病，無其他炎癥疾病，無糖尿病酮癥，排除使用胰島素、糖皮質(zhì)激素類藥物的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床及生化檢查：受試者均空腹過夜，次日晨采集前臂肘靜脈血測定空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、胰島素(insnlin，Ins)濃度。所有受試者行75 g葡萄糖耐量試驗，服糖后2 h再取血測血糖。采用日立7600全自動生化分析儀測定，血漿Ins濃度采用放射免疫法測定。胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=[FBG(mmol/L)×Ins(mU/L)]/22.5。測量受試者的身高和體重，計算體重指數(shù)(body mass index，BMI)：體重(kg)/[身高(m)]2。同時測量收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，測量腰圍、臀圍以計算腰臀比(waist/hip ratio，WHR)。

1.2.2 MCP-1基因型檢測：基因變異的鑒定使用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法分析。(1)引物的序列[5]，上游引物為5′-CCG AGA TGT TCC CAG CAC AG-3′，下游引物為5′-CTG CTT TGC TTG TGC CTC TT-3′(北京三博遠志生物公司合成)。(2)DNA提取：所有受試者均空腹過夜，次日晨采集前臂靜脈血2 ml，加入乙二銨四乙酸二鈉抗凝，用全血基因組DNA小量快速提取試劑盒(北京三博遠志生物公司)提取DNA，提取方法按照試劑盒中的說明進行。(3)擴增：PCR體系：25 μl PCR反應體系中，基因組DNA(200 ng) 1 μl，脫氧核苷三磷酸(dNTP)1 μl，DNA聚合酶0.25 μl，10×PCR緩沖液3 μl，MgCl21 μl，雙蒸水17.75 μl，上下游引物各0.5 μl。PCR反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性45 s，52℃退火30 s，72℃延伸 45 s，共35個循環(huán)，最后72℃進一步延伸5 s。(4)酶切：20 μl體系：雙蒸水7 μl，10×緩沖液2 μl，Pvu Ⅱ(美國Fergmentas)1 μl，PCR產(chǎn)物10 μl。加樣后離心，置37℃溫箱中酶切3 h，取出后立即-20℃保存。(5)電泳：取酶切產(chǎn)物10 μl進行1.7%瓊脂糖凝膠電泳(Agarose，上海根生生物公司Biowest原裝)，瓊脂糖凝膠中包括終濃度為0.5 mg/L溴化乙啶(用于染色)。在水平電泳槽中，70 V電泳約30 min，以DNA片段長度標準物(100 bp梯標記)為參考，紫外燈下觀察結果。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組t檢驗，三組間比較采用方差分析，非正態(tài)分布或方差不齊時采用秩和檢驗；影響因素的分析采用logistic回歸分析。遺傳平衡吻合度檢驗群體基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MCP-1 A-2518G基因型的等位基因頻率分布比較 本研究對IGT和T2DM組及NC組進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗，NC組χ2=2.673，P=0.080，IGT組χ2=5.101，P=0.126，DM組χ2=1.495，P=0.104，總體人群χ2=4.147，P=0.110，符合Hardy-Weinberg平衡定律，表示樣本來自遺傳平衡的總體，具有群體代表性。NC組AA、AG、GG基因頻率分別為27%、39%、34%，A、G等位基因頻率分別為48%、52%。IGT及T2DM組AA、AG、GG基因頻率分別為30%、42%、28%，A、G等位基因頻率分別為51%、49%。兩組基因型及等位基因的構成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 NC組與IGT及T2DM組MCP-1 A-2518G基因型和等位基因頻率分布(n，%)

2.2 NC、IGT及T2DM三組間臨床指標比較 IGT及T2DM組年齡較NC組大(P<0.05)，提示IGT及T2DM發(fā)病與年齡可能有關。IGT組及T2DM組的FPG、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白高于NC組(P<0.05)。與NC組比較，IGT及T2DM組有較高的BMI、WHR、TC、TG、LDL-C、SBP及HOMA-IR水平(P<0.05)，而3組的DBP、HDL-C的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 NC、IGT及T2DM三組臨床指標的比較(x±s)

續(xù)表2

注：與對照組比較，*P<0.05，與IGT組比較，#P<0.05。

2.3 logistic分析 進一步分別以IGT或T2DM作為因變量Y，將性別、年齡、BMI、WHR、FPG、餐后2 h血糖、TC、HDL-C、TG、LDL-C、SBP、DBP、HOMA-IR、糖化血紅蛋白、MCP-1各基因型作為自變量X，進行l(wèi)ogistics回歸分析，只有WHR、HOMA-IR、MCP-1 AA基因型分別進入IGT及T2DM的回歸方程，說明三者是IGT及T2DM發(fā)病的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 Logistic多因素分析

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明系統(tǒng)慢性炎癥反應與胰島素抵抗的免疫不平衡有關[8]，而趨化因子在此環(huán)節(jié)中起重要作用。MCP-1作為一種重要的前炎癥細胞因子，它在體內(nèi)可引起單核/巨噬細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞等的激活和聚集，參與機體炎癥反應及免疫調(diào)節(jié)等多種機能活動。研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1參與調(diào)節(jié)脂肪組織功能、抑制脂肪細胞胰島素刺激的葡萄糖攝取[4]及促進肥胖患者脂肪組織巨噬細胞堆積[8]。高血糖可以加速單核細胞及血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生MCP-1[9-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)在NC組中G等位基因頻率高于A等位基因頻率，這與其他學者的研究結果[11-12]相似。后者發(fā)現(xiàn)MCP-1 -2518G等位基因為亞洲人、墨西哥人、韓國人及中國人常見頻率，與高加索人群以A等位基因為常見頻率[5]正好相反，這反映了不同種族之間基因變異的不同，這種基因變異的不同可能影響疾病的進程以及患者對感染或藥物治療的反應。而在IGT及新發(fā)T2DM組的A等位基因頻率高于對照組，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與Zietz等[13]的研究結果相似，后者發(fā)現(xiàn)糖尿病患者AA基因攜帶頻率高于對照組，但兩組之間差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而與Simeoni等[5]的結果有異，提示該基因多態(tài)性存在種族異質(zhì)性。進一步logistic分析提示MCP-1-2518 AA攜帶、WHR及HOMA-IR是IGT及T2DM的獨立危險因素，說明MCP-1 A-2518G基因多態(tài)性參與IGT及T2DM發(fā)病機制。近年來，炎癥在T2DM發(fā)病機制中的作用備受關注，而MCP-1基因遠端調(diào)控區(qū)A2518G多態(tài)性與胰島素抵抗和T2DM的關系也逐漸受到重視。Simeoni等[5]通過對803例胰島素抵抗者、635例T2DM患者及1869例健康對照人群MCP-1的A2518G等位基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，血漿MCP-1水平升高與胰島素抵抗及糖尿病相關，結果與我們既往的研究結果相似[14]；而且MCP-1 AA基因攜帶的糖尿病患者MCP-1的血漿水平升高[5]。有學者研究發(fā)現(xiàn)在飲食誘導的肥胖大鼠中MCP-1 mRNA的表達是正常大鼠的7.2倍，而且血漿MCP-1水平也明顯升高，并與體重呈正相關[15]。Tateya等[16]的研究結果顯示，循環(huán)MCP-1水平急性升高可以誘導胰島素抵抗，當MCP-1及其受體CCR2的信號被抑制時，胰島素抵抗得以改善，提示循環(huán)MCP-1水平升高可以獨立于脂肪組織炎癥而足以誘導系統(tǒng)的胰島素抵抗。高血糖可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB[17]而刺激MCP-1的表達[18]以及氧化應激活性氧簇的生成[19]。然而，最近的研究表明，棕櫚酸，但非油酸或高血糖，是通過激活胰腺的β細胞和非β細胞的NF-kB誘導趨化因子和細胞因子的表達(包括CCL2)，從而化學性地誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起細胞因子的表達[20]。因此，MCP-1參與葡萄糖代謝調(diào)節(jié)的機制尚不明確。

MCP-1 基因變異調(diào)節(jié)MCP-1基因轉(zhuǎn)錄的機制不清?；蜻h端調(diào)節(jié)區(qū)含有兩個NF-kB結合部位負責MCP-1表達的細胞誘導。-2518 A→G基因變異可能影響這個區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性，因此是影響MCP-1產(chǎn)物在個體之間不同的原因[5]。有學者認為MCP-1促進巨噬細胞在脂肪組織堆積，TNF-α在脂肪組織刺激MCP-1表達及MCP-1介導的胰島素活性拮抗物產(chǎn)生，G等位基因可能阻止這種病原的惡性循環(huán)[5]。

本研究具有探討性，需要在不同人群、不同種族的大量前瞻性研究進一步證實。如果亞臨床炎癥確實是胰島素抵抗的另一面，而MCP-1參與了胰島素抵抗、IGT和T2DM的發(fā)病機制，那么阻止MCP-1的分泌或抑制MCP-1的影響將成為治療胰島素抵抗、IGT及T2DM有用的新途徑。

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5) 當裝配出錯時，由于流水線的運轉(zhuǎn)會使得該發(fā)動機流向下一個工位。因此需要使用擋塊來阻止問題發(fā)動機流向下一個工位，由于流水線是滾筒型的，每個滾筒之間有間隙，因此采用氣缸作為擋塊，在滾筒之間安裝氣缸，氣缸伸出不會與流水線發(fā)生干涉，同時也可以很好阻擋問題發(fā)動機流向下一個工位。

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Relationship of polymorphism of monocyte chemoattractant protein-1 A-2518G gene with type 2 diabetes mellitus and impaired glucose tolerance

CHENBing1,WANGMei-ning1,HEHai-ning2,HUANGYong-qi3,JIANGJie-qiu4,TANGZhi-qing1,LIUQiao-ling1

(1DepartmentofInternalMedicine,theFirstPeople′sHospitalofNanningAffiliatedtoGuangxiMedicalUniversity,Nanning530022,China; 2GuangxiSouthernPowerGridCompanyInfirmary,Nanning530022,China;3DepartmentofBiochemistry,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530022,China;4DepartmentofClinicLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530022,China)

Objective To explore the relationship of polymorphism of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)A-2518G gene with impaired glucose tolerance(IGT) and new-onset type 2 diabetes mellitus(T2DM).Methods A total of 111 healthy individual(NC group),82 patients with IGT(IGT group) and 76 patients with new-onset T2DM(T2DM group) were enrolled.The polymorphism of MCP-1 A-2518G gene was observed using a polymorphism chain reaction(PCR) and restriction fragment length polymorphism technology,and its relationship with IGT and T2DM was analyzed.Results There were no significant differences in alleles or genotype frequencies of MCP-1 gene among NC group,IGT group and T2DM group(P>0.05).The result of logistic regression analysis showed that waist/hip ratio,insulin resistance index and MCP-1 AA were the independent risk factors for IGT and new-onset T2DM(P<0.05).Conclusion MCP-1 A-2518G polymorphism may be involved in the pathogenesis of IGT and new-onset T2DM.AA gene carriers may increase the morbidity risk of IGT and new-onset T2DM.

Type 2 diabetes mellitus,Impaired glucose tolerance,Monocyte chemoattractant protein-1,Insulin resistance,Gene polymorphism

廣西自然科學基金(桂科自0640198)

陳冰(1965～)，女，博士，主任醫(yī)師，研究方向：體外誘導人胚胎干細胞向胰島細胞分化，糖尿病慢性病并發(fā)癥的發(fā)生機制和防治。

R 587.1

A

0253-4304(2016)04-0471-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.07

2015-12-18

2016-03-12)