何 潔，趙 晶，龐榮清，阮光萍，蔡學(xué)敏，朱向情，潘興華

UC-MSC治療兒童造血干細(xì)胞移植后GVHD的療效觀察

何 潔，趙 晶，龐榮清，阮光萍，蔡學(xué)敏，朱向情，潘興華

目的觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSC）治療兒童造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主?。℅VHD）的療效。方法對(duì)1例造血干細(xì)胞移植后發(fā)生GVHD的患兒行UC-MSC治療，共治療7次，每次4×107個(gè)細(xì)胞（20 ml）。結(jié)果患兒在接受UCMSC治療后獲得部分緩解（PR）。 結(jié)論 UC-MSC對(duì)治療兒童造血干細(xì)胞移植后的GVHD具有一定的療效。

臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；兒童；移植物抗宿主?。化熜?/p>

隨著移植技術(shù)的進(jìn)步，異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)目前已成為治療白血病的有效方法，移植后成功率增高，死亡率顯著降低，但是與移植相關(guān)的并發(fā)癥、尤其是移植物抗宿主病 (graft-versushost disease，GVHD)的發(fā)生會(huì)嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。目前，慢性GVHD（cGVHD）除了應(yīng)用免疫抑制劑外，仍無(wú)有效應(yīng)對(duì)方法[1]。cGVHD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，幾乎影響到所有組織器官，臨床表現(xiàn)多樣化，其特征類似于自身免疫疾病及其他免疫疾病，如硬皮病、干燥綜合征、免疫性血細(xì)胞減少癥等。因此，尋求一種cGVHD的有效治療方法是臨床亟待解決的問(wèn)題。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)免疫原性低，幾乎可以影響免疫系統(tǒng)所有的細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制作用，可有效的治療GVDH[2]。Ringden等[3]報(bào)道，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能有效控制常規(guī)免疫抑制療法無(wú)效的嚴(yán)重急性GVHD。隨后臍帶MSC也用于治療成人GVHD[4]。本研究用臍帶MSC治療1例造血干細(xì)胞移植后發(fā)生GVHD的患兒，取得了較好的療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 患兒出生6個(gè)月時(shí)，因貧血在廣州某大型醫(yī)院行地貧基因檢查確診為“β-地中海貧血”，主要給予輸注紅細(xì)胞懸液以及不規(guī)則去鐵治療?；純?歲時(shí)于2006年9月住我院血液科行臍血干細(xì)胞移植治療，細(xì)胞植入后，患兒恢復(fù)自身造血。3個(gè)月后病情反復(fù)，治療上主要給予輸注紅細(xì)胞懸液、去鐵治療。2012年7月患兒在我院血液科行allo-HSCT，供體為其胞弟。移植后1個(gè)月，患兒并發(fā)急性肝臟GVHD，給予甲潑尼松龍、環(huán)孢素等治療后，膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶明顯下降；同年9月常規(guī)胸部CT檢查提示肺部感染，考慮肺部真菌感染，給予伏立康銼抗感染治療。2015年2月患兒常規(guī)檢查提示膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶升高，考慮肝臟GVHD反復(fù)，給予甲潑尼松龍治療后，轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素等逐漸減量，但是仍然存在皮膚及肝臟慢性GVHD。常規(guī)檢查示轉(zhuǎn)氨酶(ALT)278.4 U/L，總膽紅素(TBIL)117.6 mmol/L，轉(zhuǎn)肽酶(GGTL)2124 mmol/L，出現(xiàn)頸部、腹部皮膚色素沉積和脫屑。經(jīng)院內(nèi)會(huì)診，經(jīng)家屬簽字同意后，決定給予UC-MSC治療，擬定UC-MSC治療方案。

1.2 UC-MSC體外培養(yǎng)擴(kuò)增 取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，以PBS充分沖洗血塊后，用剪刀分割為直徑約1～2 mm大小的組織塊，移入1.5 ml EP管內(nèi)，用眼科組織剪剪成糊狀后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于含有5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%匯合后，以0.2%的胰酶/EDTA消化，并按1∶3的比例傳代。收集第3代細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型并確定為UC-MSC。

1.3 UC-MSC移植治療 收集第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照1×106個(gè)細(xì)胞/kg體重劑量，每次治療劑量UC-MSC懸液終體積為20 ml，細(xì)胞數(shù)量為4×107個(gè)。輸注前檢測(cè)細(xì)胞活性≥85%。采用靜脈輸注方式輸入患兒體內(nèi)，輸注時(shí)間≤20 min，24 h內(nèi)嚴(yán)密觀察患兒生命體征。

患兒家屬簽署知情同意書，并且在征得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)后，在原有免疫抑制治療的基礎(chǔ)上，實(shí)施UC-MSC治療，每次1個(gè)治療劑量，每2 w治療1次，行7次治療，治療結(jié)束后評(píng)價(jià)療效。

1.4 療效評(píng)價(jià) 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：完全緩解(CR)：GVHD癥狀及體征消失；部分緩解(PR)：1個(gè)或多個(gè)受累器官臨床癥狀及相關(guān)指標(biāo)明顯改善＞50%，并且其他器官癥狀無(wú)加重；疾病穩(wěn)定(SD)：GVHD癥狀及體征無(wú)改變；疾病進(jìn)展(PD)：治療期間GVHD癥狀進(jìn)行性加重。

2 結(jié)果

患兒于2015年2月12日開始接受UC-MSC輸注，治療期間未見明顯不良反應(yīng)，6月12日常規(guī)檢查示 ALT 108 U/L，TBIL 29.5 mmol/L，GGTL＞1653 mmol/L；頸部皮膚色素減退，脫屑停止。治療總評(píng)價(jià)為PR。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是具有自我更新和多向分化潛能，能生成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和成肌細(xì)胞的非造血成體干細(xì)胞。研究證實(shí)，MSC不僅能通過(guò)分泌眾多細(xì)胞因子，改善造血微環(huán)境，促進(jìn)移植后造血功能的重建，而且具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)的特性，可以避免和減輕宿主免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)特異性免疫耐受的形成[5]。對(duì)比其他來(lái)源的MSC，臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞有增殖能力強(qiáng)、取材不受限制、無(wú)倫理問(wèn)題制約、可以大量擴(kuò)增等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為MSC治療的最佳選擇。

臨床研究結(jié)果顯示，MSC對(duì)于造血干細(xì)胞移植后重度GVHD具有預(yù)防效果[11-12]，但具體作用機(jī)制不清楚，一般認(rèn)為是通過(guò)多種途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，作用于淋巴細(xì)胞，抑制淋巴細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子分泌等[6]。但這些免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)是否適用于cGVHD，是否MSC的治療與細(xì)胞劑量有關(guān)，是否可能誘發(fā)原發(fā)病復(fù)發(fā)或進(jìn)展等尚不明確。目前對(duì)cGVHD仍沒有有效的治療方法，因此，MSC療法成為難治性GVHD可以選擇的有效措施之一。

本例在2012年7月接受allo-HSCT術(shù)后至今，一直服用免疫抑制劑，至2015年2月出現(xiàn)肝臟和皮膚cGVHD，按1×106個(gè)細(xì)胞/kg的劑量，連續(xù)7次輸注，結(jié)果表明，臨床療效未PR，表明UC-MSC治療有一定療效，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[7]。

[1] Dreger P,Schmitz N.Allogeneic transplantation of blood stem cells:coming of age[J].Ann Hematol,2001,80(3):127-136.

[2] Ringden O，Le Blanc K.Mesenchymal stem cells for treatment of acute and chronic graft-versus-host disease，tissue toxicity and hemorrhages[J].Clin Haematol，2011,1(24):65-72.

[3] Ringden O，Uzunel M，Rasmusson I，et al.Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease[J]. Transplantation，2006,81(10):1390-1397.

[4] 陳廣華，楊婷，田竤，等.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療糖皮質(zhì)激素耐藥的嚴(yán)重型急性移植物抗宿主病19例分析[J].中華血液學(xué)雜志，2012,33(4):303-306.

[5] Xu J,Wang D,Liu D,et al.Allogeneic mesenchymal stem cell treatment alleviates experimental and clinical sjogren syndrome [J].Blood,2012,120(15):3142-3151.

[6] Ringdén O,Uzunel M,Rasmusson I,et al.Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease[J]. Transplantation,2006,81(10):1390-1397.

[7] Ivanova-Todorova E,Bochev I,Dimitrov R,et al.Conditioned medium from adipose tissue-derived mesenchymal stem cells induces CD4+FOXP3+cells and increases IL-10 secretion[J]. J Biomed Biotechnol,2011,2012(10):295167.

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1369-02

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.005

2016-07-04）

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BI01B0）；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB5181060）；云南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

龐榮清,E-mail:pangrq2000@aliyun.com；潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com