劉高米洋，朱 慧，何 潔，劉菊芬，阮光萍，李自安，潘興華

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力影響初探

劉高米洋，朱 慧，何 潔，劉菊芬，阮光萍，李自安，潘興華

目的觀察人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUCMSC）對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87轉(zhuǎn)移、侵襲能力的影響。方法建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系，CCK8法、transwell法和Matrigel法分別檢測(cè) HUCMSC與U87非接觸共培養(yǎng)后，U87增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲能力變化。結(jié)果體外細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，HUCMSC共培養(yǎng)U87組（實(shí)驗(yàn)組）比U87單獨(dú)培養(yǎng)組（對(duì)照組）轉(zhuǎn)移和侵襲能力都有顯著提高（P＜0.05），HUCMSC共培養(yǎng)對(duì)U87有促增殖作用。結(jié)論在體外共培養(yǎng)體系中，HUCMSC可能通過促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)化而提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲潛能。因此，在HUCMSC的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用中，應(yīng)該考慮其可能的促腫瘤作用。

臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；膠質(zhì)瘤；轉(zhuǎn)移；侵襲

由于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫原性較低、易取材、容易擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種潛在的組織修復(fù)、抗衰老的新型生物治療手段。近年研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠定向遷移到某些特定的腫瘤部位，一部分研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但也有學(xué)者報(bào)道，遷移到腫瘤部位的間充質(zhì)干細(xì)胞有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。本實(shí)驗(yàn)以惡性程度較高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87為研究對(duì)象，旨在研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)U87細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響及其可能機(jī)制，為臍帶干細(xì)胞的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供資料，進(jìn)一步明確臍帶干細(xì)胞應(yīng)用的安全性和適用性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材 DMEM/F12培養(yǎng)基 （美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（美國(guó)BI公司），雙抗（美國(guó)BI公司），Trizol（美國(guó)Invitrigen公司），GoTag qPCR Master Mix（美國(guó)Promega公司），Anti-Ki67 antibody、Anti-E-cadherin antibody、Anti-N-cadherin antibody、anti-GAPDH antibody（美國(guó)abcam公司），兔抗鼠IgG H&L（HRP），羊抗兔IgG H&L（HRP），qPCR引物由Thermo公司設(shè)計(jì)合成；百萬層級(jí)層流超凈工作臺(tái)（SW-CL-2F型，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)37℃、CO2孵箱（美國(guó)Thermo公司），電泳槽（Bio-rad公司），Matrigel Invasion Chamber（BD公司），Transwell Chamber（美國(guó)Costar公司）。

1.2 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 U87細(xì)胞株購(gòu)于中科院昆明動(dòng)物所，人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUCMSC）來自本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的剖腹產(chǎn)臍帶3～5代間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng) 在產(chǎn)婦及其家屬知情同意下，取本院足月剖腹產(chǎn)新生兒臍帶，經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)婦無傳染性疾病，胎兒無先天性疾病和畸形。無菌條件下，將采集的臍帶用生理鹽水反復(fù)沖洗，去掉殘留血液。將臍帶剪碎后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，用含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日補(bǔ)液，3 d后換液，7 d后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，達(dá)到80%融合后傳代培養(yǎng)。

1.4 增殖能力檢測(cè) 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸液貼壁輕柔加入96孔板中，實(shí)驗(yàn)組采用50%MSC培養(yǎng)上清加50%DMEM/F12完全培養(yǎng)基，對(duì)照組采用DMEM/F12完全培養(yǎng)基。6 h后為檢測(cè)起始點(diǎn)，此后每隔24 h檢測(cè)1次。CCK8法記錄細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 轉(zhuǎn)移侵襲能力檢測(cè) Transwell實(shí)驗(yàn)：消化第5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUCMSC，在24孔板中分別種入0、1.0×104、2.0×104、3.0×104個(gè) HUCMSC；12 h后在8 μm Transwell Chamber中種入無血清培養(yǎng)的1.5× 104個(gè)U87細(xì)胞，將小室輕輕放入已種入HUCMSC的24孔板中。24 h后取出小室風(fēng)干片刻，4%甲醛固定30 min，去除甲醛，結(jié)晶紫染色30 min。拍照計(jì)數(shù)細(xì)胞。

Matrigel實(shí)驗(yàn)：消化第5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUCMSC，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，在24孔板中分別種入0、1.0×104、2.0× 104、3.0×104個(gè) HUCMSC，無血清培養(yǎng)；12 h后在8 μm Matrigel Chamber中種入無血清培養(yǎng)的1.5× 104個(gè)U87細(xì)胞，將小室輕輕放入已種入HUCMSC的24孔板中。24 h后4%甲醛固定30 min，去除甲醛，結(jié)晶紫染色30 min。拍照計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUCMSC的分離培養(yǎng) 將新鮮臍帶剪碎后，采用無酶直接貼壁法將組織塊直接放入培養(yǎng)瓶中，采用20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿傳代后，換用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，大約次日即可看見少許細(xì)胞貼壁（圖1a），約3 d后可見細(xì)胞爬出（圖1b），傳代后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)呈纖維樣（圖1c），稠密呈漩渦狀生長(zhǎng)（圖1d）。

圖1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)

2.2 HUCMSC培養(yǎng)上清對(duì)U87增值能力的影響CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力，結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組有更強(qiáng)的增殖能力（P＜0.05，圖2）。

圖2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUCMSC對(duì)U87細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 非接觸共培養(yǎng)HUCMSC對(duì)U87轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響 穿梭實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U87在HUCMSC非接觸共培養(yǎng)條件下顯示，隨共培養(yǎng)HUCMSC數(shù)目增加，U87轉(zhuǎn)移能力遞增（圖3）。顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過小室的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示有顯著差異（P＜0.05）。侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U87在HUCMSC非接觸式共培養(yǎng)條件下其侵襲能力的變化，見圖4，共培養(yǎng)組較對(duì)照組顯示出較強(qiáng)的侵襲能力（P＜0.05）。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)非接觸共培養(yǎng)下MSC對(duì)U87細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

圖4 Matrigels實(shí)驗(yàn)檢測(cè)非接觸共培養(yǎng)下MSC對(duì)U87細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)控、造血支持、連續(xù)傳代和凍存后仍有自我修復(fù)和多向分化潛能等特點(diǎn)，在特定條件下，可分化為多種組織細(xì)胞，可作為種子細(xì)胞用于組織器官損傷修復(fù)和抗衰老[1]。HUCMSCs較其他來源間充質(zhì)干細(xì)胞有增殖能力強(qiáng)、取材方便的優(yōu)勢(shì)，因此，其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景廣泛，但安全性是間充質(zhì)干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前必須明確的重要問題。近年研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞能特異的向腫瘤部位遷移；部分研究顯示，遷移到腫瘤部位的間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[2]；而另一部分研究顯示，遷移到腫瘤部位的間充質(zhì)干細(xì)胞能抑制腫瘤的生長(zhǎng)[3-5]。

膠質(zhì)瘤是一種最為常見的原發(fā)性腦腫瘤，同時(shí)也是一個(gè)全球性重大疾病問題，在美國(guó)每年有超過12 000人罹患膠質(zhì)瘤[6]。惡性膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較差，半數(shù)生存時(shí)間為15個(gè)月[7]，手術(shù)和放化療治療效果都不理想，患者復(fù)發(fā)率極高。有文獻(xiàn)報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向腫瘤部位遷移，這為腫瘤治療提供了一種理想的藥物載體[8]。本課題擬選用臨床上最常見的腦部腫瘤膠質(zhì)瘤為切入點(diǎn)，選擇膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87為研究對(duì)象，試圖探究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。

本研究采用CCK8法檢測(cè)了HUCMSC培養(yǎng)上清對(duì)U87的增殖能力的影響，結(jié)果提示，HUCMSC培養(yǎng)上清能夠促進(jìn)U87增殖；非接觸式培養(yǎng)，提示HUCMSC可能促進(jìn)U87細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果提示，HUCMSC對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響不可一概而論，需要進(jìn)一步明確其促增殖的作用機(jī)制。

EMT轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要理論之一，目前研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)不一定需要發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，但發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力更強(qiáng)[9]。本研究中Transwell和Matrigel實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，非接觸培養(yǎng)條件下，HUCMSC能夠明顯促進(jìn)U87細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，并且隨著共培養(yǎng)的HUCMSC數(shù)量越多，其促轉(zhuǎn)移侵襲作用越明顯，提示HUCMSC可能通過分泌某些成分促進(jìn)U87細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。還有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌一種直徑為20～100 nm的分泌小泡，又稱外泌體 （exosome），外泌體中包含miRNA、lncRNA和多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子[10]。間充質(zhì)干細(xì)胞可能通過分泌外泌體釋放相關(guān)蛋白，促進(jìn)U87的轉(zhuǎn)移侵襲能力，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，HUCMSC作為一種潛在腫瘤藥物載體，其與腫瘤尤其是難治性腫瘤的相互影響是其臨床前應(yīng)用的需要解決的基本問題。本研究結(jié)果表明，HUCMSC在非接觸式培養(yǎng)方式下，能促進(jìn)U87細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力，但具體機(jī)制不甚明確，需進(jìn)一步探求。

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Preliminary study on impacts of UC-MSCs on metastasis and invasion of GCs

Liugao Miyang,Zhu Hui,He Jie,Liu Jufen,Ruan Guangping,Li Zi'an,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;Yunnan Stem Cell Engineering Laboratory,Kunming, Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Kunming,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the impacts of human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUC-MSCs)on the metastasis and invasion of glioma cell(GC)line U87.MethodsA cell co-culture system was established.The changes in the proliferation, metastasis and invasion of U87 after the non-contact co-culture with HUC-MSCs were detected by CCK8 method,transwell method and Matrigel method.ResultsThe metastasis and invasion of U87 co-cultured with HUC-MSCs(in the experiment group)were much better than those of U87 separately cultured (the control group).ConclusionIn the co-culture system in vitro,HUC-MSCs may improve the proliferation,metastasis and invasion of glioma cell line U87 by promoting EMT transformation.Therefore,the potential tumor promoting effects of HUC-MSCs should be considered in the clinical transformation application.

HUC;MSC;glioma;metastasis;invasion

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1398-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.013

2016-06-28）

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BI01B0）；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB5181060）；云南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com