趙妙妙，姜曉龍，陳建偉，黃　洋，姚曉磊，曹　霞，李鵬飛，呂麗華*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

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FSH及Wnt信號通路對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖及雌激素分泌的影響

趙妙妙1，姜曉龍1，陳建偉1，黃洋1，姚曉磊1，曹霞1，李鵬飛2，呂麗華1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

摘要：旨在研究Wnt信號通路對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖及雌激素分泌的影響，探究其是否與促卵泡素(Follicular stimulating hormone，F(xiàn)SH)有關(guān)。在添加有FSH以及不同濃度Wnt信號通路抑制劑IWR-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞168 h，利用Guava ViaCount?Reagent測定細(xì)胞數(shù)目的變化，利用綿羊ELISA試劑盒檢測雌激素濃度的變化，利用qRT-PCR檢測FSH靶基因CYP19和CCND2的相對表達(dá)量差異。結(jié)果表明，無論有無FSH，抑制劑IWR-1使顆粒細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)；當(dāng)有FSH時，抑制劑IWR-1的添加導(dǎo)致雌激素濃度顯著降低(P<0.05)。IWR-1的濃度為1.0 μmol·L-1時，對顆粒細(xì)胞的抑制效果最明顯。IWR-1還導(dǎo)致CYP19和CCND2 mRNA的表達(dá)量降低。綜上表明，Wnt信號通路對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的生物學(xué)功能具有促進(jìn)作用，并且這種促進(jìn)作用可能與FSH有關(guān)。

關(guān)鍵詞：綿羊；卵泡顆粒細(xì)胞；Wnt信號通路；IWR-1；細(xì)胞培養(yǎng)

1982年R.Nusse等[1]在研究小鼠乳腺癌時首次發(fā)現(xiàn)了Wnt基因。Wnt信號通路可調(diào)控多種發(fā)生過程如細(xì)胞程序性死亡、增殖、分化和凋亡等[2]。Wnt家族的成員主要有3條不同的信號通路[3-7]：(l)經(jīng)典的Wnt/β-catenin(CTNNB1)信號通路，可調(diào)節(jié)核內(nèi)目的基因的表達(dá)；(2)平面的細(xì)胞極性通路(Planar cell polarity pathway)，參與組織極性調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞骨架的重排；(3)Wnt/Ca2+通路，能刺激細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放，并且對經(jīng)典Wnt信號通路有一定阻礙作用。當(dāng)細(xì)胞未受到刺激時，軸蛋白(AXIN2)結(jié)合到CTNNB1/糖原合酶激酶(CSK3)/結(jié)腸癌抑制因子(APC)復(fù)合體當(dāng)中，導(dǎo)致CTNNB1迅速降解，信號傳導(dǎo)通路關(guān)閉；而當(dāng)Wnt/β-catenin信號通路被激活時，Wnt配體與受體卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)ZD)以及LDL受體相關(guān)蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)結(jié)合形成三聚體，從而激活蓬亂蛋白(Dishevelled1，Dsh1/DVL1)，使DVL1與AXIN2相結(jié)合，導(dǎo)致AXIN2/CSK3/APC/CTNNB1的復(fù)合體被破壞，致使CTNNB1無法被降解，故CTNNB1可進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，并對基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控[8]。IWR-1是Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑[9-10]，通過改變AXIN2對CTNNB1的結(jié)合力從而改變多蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性，使CTNNB1被降解，最終起到抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的作用[11]。

哺乳動物中Wnt/β-catenin信號通路的研究最初局限于人和鼠，S.Vainio等[12]發(fā)現(xiàn)：Wnt/β-catenin信號通路對胚胎期小鼠卵巢發(fā)育上具有重要作用。D.Boerboom等[13]研究表明：Wnt/β-catenin信號通路的錯誤調(diào)控將引發(fā)卵巢顆粒細(xì)胞腫瘤。可見，Wnt/β-catenin信號通路對哺乳動物卵巢及卵巢顆粒細(xì)胞具有一定的作用。FSH作為一種重要的促性腺激素，與卵巢顆粒細(xì)胞也存在密切聯(lián)系，高慶華等[14]研究表明：FSH能誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞增殖及提高其雌激素合成能力，顆粒細(xì)胞雌激素的合成能力與生理濃度的FSH存在劑量依賴關(guān)系。P.S.Gupta等[11]研究發(fā)現(xiàn)：Wnt信號通路可增強(qiáng)FSH在牛優(yōu)勢卵泡選擇中的活動。因此，在哺乳動物的繁殖調(diào)控過程中，Wnt/β-catenin信號通路與FSH之間可能存在一些影響。

本研究在有或無最適濃度FSH以及不同濃度Wnt信號通路抑制劑IWR-1的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞，觀察其對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖及雌激素分泌的影響。明確Wnt信號通路對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步研究Wnt信號通路的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料及主要試劑

本試驗選用山西省晉中市清徐縣綿羊屠宰場性成熟綿羊的健康卵巢。

MEMα基礎(chǔ)培養(yǎng)液、非必需氨基酸(NEAA)、促卵泡素(FSH)、兩性霉素B(Invitrogen，美國)、DMSO、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清蛋白(BSA)、亞硒酸鈉(Na2SeO3)、雄激素、碳酸氫鈉(NaHCO3)、胰蛋白酶(Sigma，美國)、臺盼藍(lán)、氨芐青霉素、鏈霉素(上海生物工程公司)、IWR-1(上海藍(lán)木化工有限公司)、Guava ViaCount?Reagent(Millipore，美國)、Sheep Estradiol Elisa(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的收集：將采集的健康卵巢快速帶回實驗室，認(rèn)真分離并選取大小適中(3 mm<卵泡直徑<5 mm)的卵泡，用無菌的杜氏磷酸緩沖液(DPBS)漂洗兩次。在超凈臺內(nèi)，剪開卵泡并放入盛有培養(yǎng)液的小表面皿中，用刮刀輕輕刮動卵泡內(nèi)壁。收集帶有顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)液，500 r·min-1離心后棄底部雜質(zhì)，然后1 400 r·min-1離心，棄上清，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。

1.2.1.2活細(xì)胞密度檢測：取少量顆粒細(xì)胞懸液與等體積0.4%的臺盼藍(lán)混合，染色1 min，利用血細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下觀察并計算活細(xì)胞濃度，算出每個培養(yǎng)孔中的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.1.3顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)：根據(jù)上述計算結(jié)果稀釋細(xì)胞懸液，并將其接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔的活細(xì)胞數(shù)約為2萬個。細(xì)胞被分為A、B兩大組進(jìn)行培養(yǎng)，1組未添加FSH(添加與FSH等量的培養(yǎng)液)，第2組添加最適濃度(5 ng·mL-1)的FSH[24]。每組內(nèi)再繼續(xù)分為對照組(A1/B1)以及添加不同濃度(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)的Wnt信號通路抑制劑IWR-1的試驗組(A2、A3、A4/B2、B3、B4)。每個濃度的培養(yǎng)孔做3個重復(fù)。

1.2.1.4細(xì)胞液的收集：細(xì)胞培養(yǎng)168 h后，將細(xì)胞上清液移入無菌EP管內(nèi)，-20 ℃儲存，測雌激素濃度備用。

1.2.1.5細(xì)胞活率檢測：向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入37 ℃的胰酶100 μL消化處理5～10 min，然后加入100 μL 10% FBS終止消化。移出細(xì)胞懸液50 μL，并加入Guava ViaCount· Reagent工作液450 μL，靜置10 min(避光)，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行活率檢測。收集其余細(xì)胞懸液，-80 ℃儲存。

1.2.1.6雌激素測定[15]：雌激素的測定是利用綿羊ELISA試劑盒，按照說明書進(jìn)行正規(guī)操作，最后利用酶標(biāo)儀讀取OD值，并計算雌激素濃度。

1.2.2FSH靶基因表達(dá)量檢測

1.2.2.1總RNA的提?。簩?.2.1.5 -80 ℃儲存的懸液從冰箱取出，用Trizol法提取總RNA[16]。

1.2.2.2cDNA合成：按照PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明，加入1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，2 μL RNA，RNase Free定容到10 μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min，4 ℃ 5 min。加入1 μL RT Primer Mix，4 μL 5×PrimeScript?Buffer 2，1 μL PrimeScript?RT Enzyme Mix I，RNase Free定容到20 μL。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，檢測產(chǎn)物純度及濃度，于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2.3引物設(shè)計與合成：根據(jù)NCBI上綿羊的預(yù)測序列，利用Primer 3和Oligo 6軟件設(shè)計目的基因的引物；以綿羊β-Actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1熒光定量PCR引物序列

Table 1Primers sequence of quantitative PCR

1.2.2.4qRT-PCR反應(yīng)：以之前細(xì)胞培養(yǎng)試驗中的A1、A3、B1、B3的cDNA為模板，構(gòu)建20 μL qRT-PCR 反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)10 μL， Rox Reference Dye(50×)0.4 μL，PCR 上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，45個循環(huán)。擴(kuò)增完成后軟件自動生成擴(kuò)增曲線、熔解曲線，利用其CT值分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS(Statistic Package for Social Science 18.0)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和顯著性檢驗的方法。qRT-PCR 相對表達(dá)量結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)”表示，采用△△CT的計算方法，相對表達(dá)量= 2-△△CT。各基因表達(dá)量均經(jīng)內(nèi)參β-Actin校正。

2結(jié)果

2.1FSH和IWR-1處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞168 h后生長狀況

由圖1可見，在A、B組中，對照組(A1/B1)與試驗組(A2、A3、A4/B2、B3、B4)相比，生長狀況相對較好，細(xì)胞數(shù)目較多，聚團(tuán)現(xiàn)象明顯；長勢最佳的是添加有FSH但無IWR-1的(B1)組，細(xì)胞數(shù)目最多，聚團(tuán)最明顯?？梢姡隗w外培養(yǎng)的條件下，F(xiàn)SH可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的生長，而Wnt信號通路抑制劑IWR-1可抑制顆粒細(xì)胞的生長。

2.2FSH和IWR-1處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞168 h后細(xì)胞數(shù)目的變化

由圖2可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中無IWR-1但添加有最適濃度5 ng·mL-1的FSH時，顆粒細(xì)胞數(shù)目最多，顯著高于其他組別(P<0.05)；無論是否有外源FSH存在，IWR-1的添加使顆粒細(xì)胞數(shù)目下降，但是當(dāng)IWR-1濃度到達(dá)一定濃度后，細(xì)胞數(shù)目反而有所上升。未添加FSH的試驗組中，IWR-1濃度為0.1和1.0 μmol·L-1時細(xì)胞數(shù)目最少；添加有FSH的試驗組中，IWR-1濃度為1.0 μmol·L-1時，細(xì)胞數(shù)目顯著少于其他組(P<0.05)。FSH可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，而IWR-1可以抑制顆粒細(xì)胞的增殖。

2.3FSH和IWR-1處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞168 h后雌二醇濃度變化

由圖3可看出，當(dāng)培養(yǎng)基中只添加有5 ng·mL-1的FSH時，雌激素濃度最大，顯著高于其他組(P<0.05)；無FSH的試驗組中，IWR-1的添加對雌激素的分泌無顯著影響，有FSH的試驗組中，IWR-1的添加使雌激素濃度降低，當(dāng)IWR-1濃度為0.1和1.0 μmol·L-1時，雌激素濃度顯著小于其他組(P<0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)SH可促進(jìn)顆粒細(xì)胞雌激素的分泌，IWR-1可以抑制顆粒細(xì)胞雌激素的分泌，且IWR-1的抑制作用可能與FSH 有關(guān)。

2.4FSH和IWR-1處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞168 h后FSH靶基因的表達(dá)差異

由圖4可看出，在培養(yǎng)基中添加最適濃度的FSH，促使基因CYP19和CCND2表達(dá)量升高，而IWR-1的作用又會降低CYP19 mRNA和CCND2 mRNA的表達(dá)量。表明，IWR-1可降低FSH對顆粒細(xì)胞的促進(jìn)作用。

3討論

FSH是一種重要的促性腺激素，可調(diào)控哺乳動物卵泡的發(fā)生；能夠結(jié)合顆粒細(xì)胞中的FSH受體，激活cAMP通路，從而調(diào)節(jié)芳香化酶的活性[17]，進(jìn)而促使哺乳動物卵泡顆粒細(xì)胞的數(shù)目增多，顆粒細(xì)胞的雌激素濃度增大[18-22]。顆粒細(xì)胞的增殖以及雌激素的合成都與體外添加的FSH濃度有關(guān)[23]。李鵬飛等[24]研究綿羊卵泡顆粒細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FSH濃度為5 ng·mL-1時，細(xì)胞生長狀態(tài)最佳。

有研究證實，Wnt信號通路對卵巢中類固醇生成有重要的調(diào)控作用[25]。本試驗探究Wnt信號通路對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的調(diào)控是通過使用通路抑制劑IWR-1來研究的。抑制劑IWR-1可破壞細(xì)胞質(zhì)AXIN2依賴的復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而阻礙對CTNNB1的降解作用，最終阻礙Wnt/β-catenin信號通路[9-11]。

本研究表明，F(xiàn)SH促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的生長，當(dāng)培養(yǎng)液中添加最適濃度(5 ng·mL-1)的FSH時，顆粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象明顯，雌激素濃度增大。Wnt信號通路抑制劑IWR-1的作用可抑制顆粒細(xì)胞生長，當(dāng)IWR-1濃度為0.1、1.0 和10.0 μmol·L-1時，對顆粒細(xì)胞均有抑制效果，但1.0 μmol·L-1的IWR-1抑制效果最明顯，顆粒細(xì)胞數(shù)目最少，聚集生長的細(xì)胞團(tuán)最少，雌激素分泌量最少，因此1.0 μmol·L-1為抑制效果最強(qiáng)的抑制劑IWR-1濃度。此外，當(dāng)培養(yǎng)基中未添加FSH時，抑制劑濃度為0.1與1.0 μmol·L-1的試驗組之間以及對照組與10.0 μmol·L-1的試驗組之間，顆粒細(xì)胞的增殖數(shù)目無顯著差異，同樣，在無FSH時，雌激素的濃度在對照組與0.1、1.0 μmol·L-1的抑制劑組之間均無顯著差異。然而當(dāng)培養(yǎng)基中添加最適濃度的FSH時，無論是顆粒細(xì)胞的增值數(shù)目還是雌激素濃度，在各試驗組之間均出現(xiàn)顯著差異。表明，F(xiàn)SH增強(qiáng)了IWR-1對顆粒細(xì)胞的抑制效果。

CYP19基因可以編碼芳香化酶，當(dāng)雌激素合成時能夠催化雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，在雌激素的合成過程中起重要的調(diào)控作用[26-27]。CCND2基因可以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖[28]。有研究表明，CYP19和CCND2都是FSH的靶基因，F(xiàn)SH的作用會使細(xì)胞內(nèi)CYP19和CCND2 mRNA的表達(dá)量增加[29]。本試驗發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路抑制劑IWR-1降低了細(xì)胞內(nèi)由于FSH誘導(dǎo)的CYP19 mRNA的增加量，而對于CCND2 mRNA也同樣表現(xiàn)出相似的結(jié)果。這與P.S.Gupta等[11]的研究結(jié)果：Wnt信號通路可以增強(qiáng)FSH在牛優(yōu)勢卵泡選擇中的活動，具有一定程度上的一致性。

4結(jié)論

Wnt信號通路可以促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和雌激素的分泌。不同濃度的Wnt信號通路抑制劑IWR-1對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖和雌激素分泌存在不同的抑制效果，當(dāng)IWR-1的濃度為1.0 μmol·L-1時，抑制效果最明顯。此外，Wnt信號通路還可以調(diào)節(jié)FSH在顆粒細(xì)胞中的作用，綜上表明，Wnt信號通路對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的影響，可能是通過調(diào)節(jié)FSH的作用來發(fā)揮的。

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(編輯程金華)

Effects of FSH and Wnt Signaling Pathway on Proliferation and Estrogen Secretion of Sheep Granulosa Cells

ZHAO Miao-miao1，JIANG Xiao-long1，CHEN Jian-wei1，HUANG Yang1，YAO Xiao-lei1，CAO Xia1，LI Peng-fei2，Lü Li-hua1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.CollegeofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

Key words:sheep；granulosa cells；Wnt signaling pathway；IWR-1；cell culture

Abstract:This study aims to investigate the effect of Wnt signaling pathway on proliferation and estrogen secretion of sheep granulosa cells and to explore whether the effect was related to FSH(Follicular stimulating hormone，F(xiàn)SH).With or without FSH，sheep granulosa cells were cultured in medium with different concentrations of Wnt signaling pathway inhibitor IWR-1 for 168 h.Then，Guava ViaCount?Reagent was used to detect the changes of cell number and sheep ELISA kit was used to detect the changes of estrogen concentrations.The relative expression ofCYP19 andCCND2，which are the target genes of FSH，was analyzed by qRT-PCR.The results showed that IWR-1 could cause a significant(P<0.05) reduction in the number of granule cells whether FSH existed or not.With the presence of FSH，the addition of IWR-1 could significantly(P<0.05) decrease estrogen concentration.When the concentration of IWR-1 was 1.0 μmol·L-1，its inhibitory effect on granulosa cells was of most obvious.Besides，IWR-1 decreased the abundance ofCYP19 mRNA andCCND2 mRNA.In conclusion，Wnt signaling pathway can improve the biological function of sheep granulosa cells，and this function may be related to FSH.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.009

收稿日期：2015-05-06

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31172211)；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(2014-重點5)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科研管理費資助重大項目和標(biāo)志性成果培育項目(71060003)

作者簡介：趙妙妙(1989-)，女，山西大同人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：1203418618@qq.com *通信作者：呂麗華，E-mail：sxaullh@yahoo.com.cn

中圖分類號：S826.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0064-07