不同月齡高原型藏綿羊睪丸組織中蛋白基因產(chǎn)物9.5和神經(jīng)肽Y的分布比較

袁莉剛，曲亞玲，魯玉榮，李　聰

( 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070 )

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不同月齡高原型藏綿羊睪丸組織中蛋白基因產(chǎn)物9.5和神經(jīng)肽Y的分布比較

袁莉剛*，曲亞玲，魯玉榮，李聰

( 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070 )

摘要：旨在比較蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5) 和神經(jīng)肽Y(NPY) 在不同發(fā)育時期藏綿羊睪丸的組織分布特征，探索其對藏綿羊睪丸發(fā)育及生殖機能調(diào)節(jié)的相關(guān)作用。 采用睪丸摘除手術(shù)收集0.5、2、5、8、12及18月齡藏綿羊睪丸，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法及IPP圖像分析技術(shù)研究PGP9.5和NPY的分布特征。PGP9.5和NPY在0.5月齡藏綿羊睪丸組織表達量較低，生殖母細胞中基本無表達，但2月齡時，PGP9.5表達量增加極顯著(P<0.01)，且同年齡段PGP9.5表達量均極顯著高于NPY(P<0.01)，至18月齡時，PGP9.5和NPY表達量明顯升高，且與0.5月齡相比差異極顯著(P<0.01)，二者在12月齡及以后初級精母細胞中表達均為陰性。PGP9.5在Sertoli細胞陽性信號隨睪丸發(fā)育隨年齡增加逐漸降低，至18月齡時基本無表達，其在各年齡段Leydig細胞及其周圍血管壁呈陽性表達。NPY在Leydig細胞的陽性信號較弱，2月齡及以后各發(fā)育階段睪丸Sertoli細胞中均為陽性表達，在血管壁的表達亦隨年齡增加而增強。高原缺氧環(huán)境中，不同月齡高原型藏綿羊睪丸組織中PGP9.5和NPY的表達差異與Sertoli細胞發(fā)育及精子發(fā)生調(diào)控關(guān)系密切；PGP9.5在Leydig細胞強陽性，表明其與激素合成分泌相關(guān)，NPY表達隨著月齡而增強，有利于加強睪丸血管舒縮以適應(yīng)對低氧的調(diào)節(jié)，或在局部血液循環(huán)與Sertoli細胞之間物質(zhì)傳遞發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：蛋白基因產(chǎn)物9.5；神經(jīng)肽Y；藏綿羊；睪丸；免疫組織化學(xué)；年齡

睪丸神經(jīng)分布特征在不同動物或人隨年齡不同具有明顯差異，對睪丸發(fā)育及功能具有重要調(diào)控作用。蛋白基因產(chǎn)物9.5(Protein gene product 9.5，PGP9.5)和神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y，NPY)是參與調(diào)控下丘腦-促性腺激素釋放激素的脈沖式釋放和垂體促性腺激素釋放的兩種重要的神經(jīng)肽，在人和多種哺乳動物的睪丸組織內(nèi)均有顯著分布，影響睪丸雄性激素生成和精子發(fā)生[1-3]。龔永光等[2]應(yīng)用免疫組織化學(xué)分析表明，青年人睪丸神經(jīng)活動主要由肽能神經(jīng)調(diào)控；K.H.Wrobel等[4]發(fā)現(xiàn)，3～5周齡小豬睪丸分布有豐富的以NPY為主的肽能神經(jīng)，在7～10周齡時神經(jīng)支配顯示不同程度降低，而成年公豬睪丸內(nèi)則相對缺乏。目前國內(nèi)外關(guān)于雄性生殖機能的研究廣泛而深入，但是對于高原環(huán)境中哺乳動物睪丸神經(jīng)調(diào)控的報道較少。研究表明，PGP9.5及NPY在青年牦牛睪丸組織顯著分布，且NPY在老齡牦牛睪丸血管分布顯著降低，二者在牦牛睪丸的分布與年齡有明顯關(guān)系[5]。同一種屬的動物隨生長環(huán)境不同，神經(jīng)肽的分布具有一定差異，NPY在平原黃牛及高原黃牛主要分布均在睪丸各級動脈血管周圍或血管壁內(nèi)，PGP9.5在高原黃牛Sertoli 細胞的分布明顯較平原黃牛弱[6-7]；可見高海拔對牦牛等高原動物睪丸神經(jīng)肽分布的影響不容忽視。藏綿羊是中國3大原始綿羊品種之一，能夠很好的適應(yīng)高原低氧環(huán)境。本組前期研究表明，成年藏綿羊睪丸精索及實質(zhì)血管形成特殊的微形態(tài)結(jié)構(gòu)，有利于維持其高原適應(yīng)性生殖機能[8-9]，這些對于研究藏綿羊睪丸神經(jīng)分布提供了基礎(chǔ)。為此，本研究采用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)對PGP9.5和NPY在不同發(fā)育時期藏綿羊睪丸的分布特點進行比較分析，為進一步研究其睪丸神經(jīng)分布及適應(yīng)性調(diào)節(jié)提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物采集自甘肅天祝藏族自治縣祁連鄉(xiāng)養(yǎng)殖戶，在同一群藏綿羊分不同組，從產(chǎn)羔后不同月齡分別經(jīng)睪丸摘除手術(shù)收集樣本，0.5月齡藏綿羊睪丸4對，2、5月齡睪丸各6對，8、12及18月齡藏綿羊睪丸各7對。1.1.2主要藥品試劑NPY兔抗鼠多克隆抗體(bs-0071R)、PGP9.5兔抗鼠多克隆抗體(bs-3806R)、免疫組化染色試劑盒(SP-0023，美國ZYMED公司)，DAB顯色試劑盒(c-0010)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，APES防脫玻片(ZLI-9502，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1樣品固定和切片制備迅速將睪丸從陰囊中取出，睪丸實質(zhì)組織切塊，多聚甲醛固定20 h，流水沖洗24 h，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、制備切片。

1.2.2免疫組化染色免疫組化SP法染色，免疫組化染色時，一抗分別為NPY-IgG和PGP9.5-IgG (稀釋度1∶400)。陰性對照用0.01 mol·L-1的PBS，代替一抗(NPY和PGP9.5)進行染色。

1.3統(tǒng)計分析

2結(jié)果

2.1PGP9.5在藏綿羊睪丸組織中的分布

光鏡下，0.5月齡藏綿羊睪丸生精上皮主要由Sertoli 細胞構(gòu)成，生殖母細胞偶見，無明顯管腔。PGP9.5在Sertoli 細胞為中等陽性表達，生殖母細胞為陰性表達；間質(zhì)血管稀少，Leydig細胞陽性表達(圖1a)。PGP9.5在2、5月齡藏綿羊睪丸管腔內(nèi)生殖母細胞數(shù)量有所增加，免疫組織化學(xué)表達明顯增強，分布位置與0.5月齡時基本相同，Sertoli 細胞及Leydig 細胞均為陽性表達，但是PGP9.5在生殖母細胞為中等強度陽性表達(圖1b～f)。8月齡睪丸生精上皮不同程度發(fā)育，個別管腔生精上皮為1～2層，部分上皮已經(jīng)發(fā)育為3～4層，管腔部分出現(xiàn)。生精上皮Sertoli 及生精細胞PGP9.5陽性信號明顯，生精小管管周Leydig 細胞數(shù)量明顯增加，觀察到豐富的PGP9.5陽性信號分布(圖1g，h)；間質(zhì)血管壁及淋巴管內(nèi)PGP9.5亦有中等陽性表達(圖1h)。12月齡時生精小管橫切面管腔明顯，生精上皮為4～6層，發(fā)育程度不一致，個別管腔有明顯成熟精子，PGP9.5在生精小管固有膜肌樣細胞，除初級精母細胞外的各級生精細胞及Leydig 細胞為陽性表達，Sertoli 細胞弱陽性表達，間質(zhì)血管為陽性表達(圖1i，j)。18月齡以后，生精上皮發(fā)育成熟，基本為4～7層，腔面有大量成熟精子。初級精母細胞及Sertoli 細胞基本無表達，但Leydig 細胞及間質(zhì)血管為陽性表達(圖1k，l)。

2.2NPY在藏綿羊睪丸組織中的分布

NPY在0.5月齡藏綿羊睪丸生精上皮基本無表達，Leydig細胞均為弱陽性表達，血管壁無表達(圖2a)；2、5月齡時，NPY在藏綿羊睪丸管腔內(nèi)Sertoli 細胞及生殖母細胞均為陽性表達(圖2b，c，d)，在Leydig細胞和毛細血管為陽性表達而在小動脈管壁無表達(圖2e，f)。8月齡時在藏綿羊睪丸組織中分布有豐富的NPY陽性信號，絕大多數(shù)NPY陽性細胞定位在生精小管周圍(圖2g，h)。管周肌樣細胞為弱陽性表達(圖2h)，生精上皮各級生精細胞及Sertoli 細胞均為中等陽性(圖2g，h)。12月齡藏綿羊睪丸Leydig細胞中NPY為弱陽性表達；初級精母細胞及各級血管和生精小管周圍的肌樣細胞表達均為陰性(圖2i，j)。18月齡時NPY在生精小管內(nèi)Sertoli 細胞、精原細胞、次級精母細胞和精子細胞為強陽性表達，在Leydig細胞表達較弱而在間質(zhì)小血管為強陽性(圖2k，l)。

各年齡組睪丸組織陰性對照無表達(圖3)。

2.3PGP9.5和NPY在藏綿羊睪丸的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果對比分析

免疫組織化學(xué)圖像分析結(jié)果顯示，PGP9.5和NPY在0.5月齡藏綿羊睪丸組織表達量較低，與之相比較，其余各年齡段藏綿羊睪丸組織中PGP9.5和NPY的分布有一定統(tǒng)計學(xué)差異；PGP9.5自2～12月齡后各組間統(tǒng)計學(xué)差異不明顯，但是均顯著高于同年齡段NPY的表達量；各年齡組NPY表達的平均吸光度在性成熟之前不具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異，性成熟后藏綿羊睪丸組織NPY表達量顯著增加；PGP9.5和NPY在18月齡藏綿羊睪丸組織的表達不存在統(tǒng)計學(xué)差異(圖4)。

3討論

哺乳動物睪丸受豐富的神經(jīng)支配，在性成熟前后神經(jīng)內(nèi)分泌與局部因子相互之間存在很多潛在的調(diào)節(jié)機制。研究表明，哺乳動物睪丸神經(jīng)中大約一半是具有Y—免疫反應(yīng)的神經(jīng)肽[4]。K.H.Wrobel等[3]對不同年齡牛睪丸免疫組織化學(xué)研究表明，從犢?！赡旯?，睪丸自主神經(jīng)分布以肽能神經(jīng)為主，隨著年齡增加，PGP9.5和NPY陽性神經(jīng)分布的差別會越來越小；研究報道，NPY及PGP9.5在35日齡之前大鼠睪丸分布較少，隨著年齡增加睪丸逐漸發(fā)育分布也增多，發(fā)揮主要的調(diào)控作用[10]。青藏高原盛草期短，高寒缺氧、晝夜溫差大，制約羔羊生長速度，高原型藏綿羊1歲左右性成熟，1歲半～2歲開始配種。本研究中PGP9.5和NPY在0.5月齡藏綿羊睪丸組織表達量較低，二者之間無明顯差異，但2月齡時，PGP9.5表達量顯著增加，且同年齡段PGP9.5表達量均顯著高于NPY，提示在藏綿羊性成熟前參與睪丸調(diào)節(jié)的肽能神經(jīng)以PGP9.5發(fā)揮主要的調(diào)控作用；18月齡時，PGP9.5和NPY表達量明顯升高，且與0.5月齡相比差異顯著，這與二者在人及牦牛的免疫組織化學(xué)分布特點相一致，表明隨著睪丸發(fā)育至性成熟期前后，肽能神經(jīng)的調(diào)控作用大大增強[2，5]。研究表明，NPY在青春期前后的大鼠前列腺副神經(jīng)節(jié)的免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性表達差異顯著，且具有與雄激素水平增加相依賴的特性[11]；而在硬骨魚類，NPY作為促生長激素和促卵泡激素釋放調(diào)節(jié)因子，與性激素水平及性別分化密切相關(guān)[12]。本研究中藏綿羊睪丸組織NPY表達量在18與12月齡相比增加極顯著，其與有機體生長性成熟發(fā)育及性激素水平增加的相關(guān)性有待于進一步分析。

睪丸肽能神經(jīng)對雄性動物性腺功能發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明，PGP9.5和NPY在幼齡牦牛睪丸生殖母細胞均為陽性表達，青年牦牛睪丸初級精母細胞為陰性，二者在幼齡及青年牦牛睪丸生精細胞的分化過程中發(fā)揮一定作用[5]。近年來，在睪丸精原干細胞體外培養(yǎng)研究中，通過免疫組織化學(xué)法檢測PGP9.5或NPY在動物或人睪丸組織的分布，可將其作為識別生精細胞及其分化狀態(tài)的分子標記；1月齡山羊生殖母細胞對PGP9.5為陽性反應(yīng)，而在隨后進一步發(fā)育中的生殖母細胞則為陰性；因此體外研究中利用這一特性培養(yǎng)1月齡山羊睪丸細胞進而有效分離A型精原干細胞[13-14]；W.Y.Lee等免疫組織化學(xué)研究表明，PGP9.5在2、3月齡犬的生精母細胞表達為陽性，并由此在體外通過篩選PGP9.5陽性克隆來培養(yǎng)生精細胞[15]。研究發(fā)現(xiàn)PGP9.5在性成熟前仔豬生殖母細胞及青春期豬睪丸精原細胞的表達逐漸降低，用于表達PGP9.5的胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄因子1基因可作為青春期前篩選精原細胞的潛在標志物[16]。本研究中0.5月齡時，PGP9.5和NPY在藏綿羊睪丸生殖母細胞中基本無表達，之后在各年齡段生精細胞中的表達逐漸增強，而二者在12月齡初級精母細胞中表達均為陰性。因此，PGP9.5和NPY在性成熟前后藏綿羊生精細胞的表達差異，可為進一步研究PGP9.5或NPY作為分子標記進行生精細胞分離培養(yǎng)研究提供參考。

睪丸Sertoli細胞是決定精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)分化命運的關(guān)鍵細胞，動物性成熟前后，Sertoli細胞不同信號通路的激活控制著SSC增殖和分化因子的表達[17]。性成熟前Sertoli細胞處于不斷發(fā)育變化過程中，不同發(fā)育時期其分泌細胞因子也不同。早期研究認為PGP9.5是檢測睪丸Sertoli 細胞活性的神經(jīng)標記，在蛋白降解變化時發(fā)揮重要作用，后來研究發(fā)現(xiàn)PGP9.5在大鼠睪丸組織的特異表達與其早期發(fā)育過程中異常的精子發(fā)生及缺陷修復(fù)密切相關(guān)[18-19]；免疫組織化學(xué)研究表明，PGP9.5在2歲齡雙峰駝睪丸及隱睪Sertoli 細胞中有表達[20]；小鼠睪丸8和16日齡時僅陽性表達于精原細胞，而在30日齡及以后不僅在精原細胞表達，在Sertoli細胞也有表達[18]。本研究中PGP9.5在Sertoli陽性信號隨藏綿羊睪丸發(fā)育表達強度逐漸降低，至18月齡時基本無表達，這與W.Y.Lee等在豬睪丸組織研究相一致，從5日齡～青春期前PGP9.5表達逐漸降低，性成熟后無表達[16]。因此，18月齡前后PGP9.5在藏綿羊睪丸Sertoli細胞的分布差異可能與Sertoli細胞發(fā)育及精子發(fā)生調(diào)控關(guān)系密切。M.Kanzaki等[21]研究報道，NPY基因在Sertoli細胞表達可誘導(dǎo)促性腺激素或細胞因子在睪丸內(nèi)的作用，同時Sertoli細胞分泌因子影響NPY基因的表達。因此，NPY在Sertoli的高表達提示其可能與Sertoli細胞分泌功能密切相關(guān)。研究表明，缺氧對雄性生育能力的抑制不可忽視，睪丸局部血液循環(huán)中氧含量較低，可導(dǎo)致各種酶及蛋白降解能力降低，精子生成數(shù)量減少[22]；本研究中，NPY在2月齡及以后各發(fā)育階段藏綿羊Sertoli細胞中均為陽性表達，且血管壁內(nèi)由弱陽性表達逐漸隨年齡增加而增強，在血管周圍為高密度陽性信號分布，這與NPY在犢牛期及青年期牦牛睪丸分布特點相一致，在高原缺氧環(huán)境中，NPY表達隨著月齡增加而增強，有可能加強睪丸血管舒縮的調(diào)節(jié)以適應(yīng)對低氧的適應(yīng)[5]，也可能在高原型藏綿羊睪丸局部血液循環(huán)與Sertoli細胞之間的物質(zhì)傳遞發(fā)揮一定作用。

Leydig細胞是睪丸組織中分泌睪酮的重要體細胞，主要受下丘腦-垂體調(diào)控，多種神經(jīng)肽對Leydig細胞類固醇激素的合成進行調(diào)節(jié)，Leydig細胞的凋亡使得血清睪酮水平顯著下降，精子發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機制出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致生精上皮萎縮，生精功能受損[23]。本研究中PGP9.5在各年齡段Leydig細胞及其周圍血管壁呈陽性表達，提示其與激素合成分泌存在密切關(guān)系。研究表明，大鼠睪丸局部NPY 水平升高能夠抑制睪丸酮的分泌，免疫組織化學(xué)檢測其主要在血管壁高表達，認為NPY是通過局部微循環(huán)調(diào)節(jié)Leydig細胞分泌活動，提示NPY誘導(dǎo)的睪丸酮釋放減少，可能通過NPY對Leydig細胞的直接作用[24]。本研究中隨著睪丸發(fā)育，NPY在Leydig細胞的陽性信號較弱，而在血管壁的表達逐漸增強；另有研究表明，人睪丸組織NPY在Leydig細胞及血管壁強表達[25]，而本研究中也觀察到幼齡及青年期牦牛睪丸Leydig細胞中有豐富的PGP9.5和NPY陽性表達，二者在血管壁則為強表達[5]，研究表明，PGP9.5及NPY在單峰駝睪丸縱隔及Leydig細胞的免疫組織化學(xué)分布表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性變化[26]，牦牛為典型的季節(jié)性發(fā)情的動物，其睪丸局部調(diào)節(jié)因子具有季節(jié)性變化的特點[27]。本研究中高原型藏綿羊的繁育也嚴格受高原環(huán)境的影響，因此，NPY及PGP9.5在其睪丸組織的表達是否也受發(fā)情季節(jié)的影響有待于進一步分析。

綜上表明，高原缺氧環(huán)境中，不同月齡高原型藏綿羊睪丸組織中PGP9.5和NPY的表達差異與Sertoli細胞發(fā)育及精子發(fā)生調(diào)控關(guān)系密切；PGP9.5在Leydig細胞強陽性提示其與激素合成分泌相關(guān)，NPY表達隨著月齡而增強，有利于加強睪丸血管舒縮以適應(yīng)對低氧的調(diào)節(jié)，或在局部血液循環(huán)與Sertoli細胞之間物質(zhì)傳遞發(fā)揮作用，NPY在Leydig細胞的作用可能與發(fā)情季節(jié)有關(guān)，本研究可為深入探索不同發(fā)育時期高原動物生精機能的神經(jīng)調(diào)節(jié)提供參考。

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(編輯程金華)

Distribution of Protein Gene Product 9.5 and Neuropeptide Y in Tibetan Plateau Sheep Testis at Different Ages

YUAN Li-gang*，QU Ya-ling，LU Yu-rong，LI Cong

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

Key words:PGP9.5；NPY；Tibetan Plateau sheep；testis；immunohistochemistry；age

Abstract:This experiment was conducted to investigate the distribution of gene product 9.5 (PGP 9.5) and neuropeptide Y (NPY) in Tibetan Plateau sheep testis and in an attempt to explore their relationships with testicular spermatogenesis at different ages.Testis from 0.5-，2-，5-，8-，12-and 18-month-old Tibetan Plateau sheep were sectioned and immunostained with antisera to the NPY and PGP 9.5.Furthermore，IPP (Image-Pro Plus) statistics methods were used to compare the average absorbance of PGP9.5 and NPY expression in all of these testis.The testicular parenchyma did not show any NPY- and PGP9.5-containing immunoreactivity in 0.5-month-old sheep，and very scattered immunoreactivities were present within the gonocytes，but the expression of PGP9.5 in testis of 2-month-old sheep was significantly stronger than NPY at the same age (P<0.01)，both of the PGP9.5 and NPY were strongly present in 18-month-old sheep(P<0.01).By contrast，no expression of NPY and PGP9.5 immunoreactivities were observed within the primary spermatocytes in 18-month-old sheep.The expression of PGP9.5 in Sertoli cells underlie age-related declines，which was poorly investigated at 12-month-old and no expression at 18-month-old，but they were obviously detected in Leydig cells and vscellum at different ages.The NPY expression in Leydig cells were also poorly investigated，and were mainly expressed in Sertoli cells in 2-month-old sheep testis，and after that，the expression of NPY in vscellum with a manner of age-related enhances.The results suggest that the PGP9.5 and NPY expression was significantly difference in Tibetan Plateau sheep testis at different ages might serve as regulators for the testicular functions，also the expression of PGP9.5 in Leydig cells in the testis reflect the functional regulates of testosterone.Namely，the distribution of NPY in the wall of testis vascular significantly stronger in a manner of age-related increase may provide new indexes for the research of plateau adaptability mechanism in testicular blood regulation，and play a role in the local microcirculation and the interactions with the Sertoli cells.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.010

收稿日期：2015-06-10

基金項目：甘肅省財政廳基本科研業(yè)務(wù)項目(2012)；國家自然科學(xué)基金項目(31160488)；甘肅省自然科學(xué)研究基金(145RJZA223)

作者簡介：袁莉剛(1974-)，女，甘肅隴南人，博士，教授，主要從事動物發(fā)育生物學(xué)研究 *通信作者：袁莉剛，E-mail：yuan2918@126.com，Tel：0931-7631229

中圖分類號：S826.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0071-08