宿靖偉，滕　蔓，羅　俊，*，遲佳琦，余祖華，禹樂樂，胡　博，張改平*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；3.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，動物疫病與公共安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽 471003)

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馬立克病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒的混合感染及在傳代過程中的重組

宿靖偉1，2，滕蔓1，羅俊1，3*，遲佳琦1，余祖華3，禹樂樂1，胡博1，張改平1，2*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；3.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，動物疫病與公共安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽 471003)

摘要：旨在了解國內(nèi)雞群馬立克病病毒(MDV)和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(REV)的混合感染及自然重組狀況，探討兩種病原的基因重組對MDV病原學(xué)特性的潛在影響及危害。利用PCR擴(kuò)增、序列測定及間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)，對來自河南商品蛋雞群的17個MDV分離株進(jìn)行研究。結(jié)果表明，其中兩個毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因組中存在REV—LTR的重組插入。進(jìn)一步的IFA結(jié)果顯示，HNGS206和HNXZ103并非MDV與REV的自然重組流行毒株，這兩個毒株基因組中LTR的插入發(fā)生于臨床病例雞混合感染后的病毒分離及傳代培養(yǎng)過程中。結(jié)果提示，雖然目前國內(nèi)雞群中MDV和REV的混合感染較為普遍，但MDV與REV自然重組毒株的流行狀況仍需要進(jìn)一步的流行病學(xué)監(jiān)測。

關(guān)鍵詞：馬立克病病毒；禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒；流行病學(xué)；混合感染；病毒傳代；基因重組

此前研究發(fā)現(xiàn)，REV基因組RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA中間產(chǎn)物(即前病毒)可以整合到宿主細(xì)胞的DNA中。由于REV前病毒的整合靶標(biāo)為雙鏈DNA，除宿主細(xì)胞DNA外，它還可以整合到細(xì)胞內(nèi)共存的其他禽皰疹病毒基因組中，如MDV[8-10]。1992年，這種現(xiàn)象首次報(bào)道于MDV和REV共感染細(xì)胞的傳代培養(yǎng)過程中[8]，之后美國[11]、波蘭[12]及我國學(xué)者[13]都先后報(bào)道了關(guān)于MDV和REV重組相關(guān)的研究。值得一提的是，REV的部分基因組片段如長末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)重組進(jìn)入MDV基因組可改變其重組位點(diǎn)附近基因的表達(dá)[14-15]。無論是經(jīng)過共培養(yǎng)或是細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)技術(shù)構(gòu)建的含REV-LTR插入的MDV毒株，在細(xì)胞中的增殖明顯增強(qiáng)，并且對宿主的致病力也發(fā)生了一定改變[15-16]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，REV-LTR的插入可增強(qiáng)MDV的水平傳播能力[17-18]。上述研究表明，MDV基因組中整合REV前病毒基因序列可能影響其病原生物學(xué)特性及致病性。因此，系統(tǒng)研究雞群中自然發(fā)生的MDV重組毒株的流行病學(xué)，對MD的有效防控具有重要意義。

在實(shí)際生產(chǎn)中，盡管小雞出孵當(dāng)天即進(jìn)行MDV疫苗免疫接種，MD病例在我國仍時有暴發(fā)或零星散發(fā)。2005年，MDV與REV重組毒株在我國的流行及病毒分離首次報(bào)道于廣西省雞群[13]，但這種重組病毒對國內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)的潛在影響目前尚不清楚。近年來，河南全省范圍內(nèi)多個地區(qū)小規(guī)模蛋雞場暴發(fā)了MD[19-20]，作者從這些發(fā)病雞群中成功分離到17個MDV流行毒株[21]，并且基于Meq、gB和gE基因系統(tǒng)發(fā)生樹分析發(fā)現(xiàn)與美國、澳大利亞、日本以及印度的MDV分離株相比，河南分離株與國內(nèi)其他分離株一起單獨(dú)形成一個較大的進(jìn)化分支，并且強(qiáng)毒株具有一定的區(qū)域流行特征[20-21]。為了解國內(nèi)雞群流行毒株中MDV和REV的自然重組狀況，本研究對這些分離株中REV的共感染及重組情況進(jìn)行了進(jìn)一步追蹤研究。

1材料與方法

1.1毒株

MDV河南分離株17個，包括HNGS101(p5)、HNGS201(p4)、HNGS206(p2、p3、p4、p6)、HNXZ101(p5)、HNXZ103(p3、p4、p9、p11)、HNXZ106(p5)、HNLC107(p4)、HNLC202(p4)、HNLC203(p4)、HNLC401(p5)、HNLC502(p4)、HNLC503(p4)、HNLH302(p5)、HNLH303(p7)、HNLH304(p5)、HNLH305(p4)和HNSC105(p11)，均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存[21]。MDV超強(qiáng)毒株GX0101(病毒基因組中整合有REV-LTR序列)[13，17，22]和REV分離株HA9901[23]，均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院崔治中教授饋贈。

1.2試劑

Premix ExTaqTM、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、pMD19-T載體連接試劑盒和JM109感受態(tài)細(xì)胞，均購自TaKaRa公司。TRIzol購自Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清購自Hyclone公司。 REV gE蛋白單抗(11B118)和MDV gB蛋白單抗(BA4)，均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院崔治中教授饋贈。熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Abbkine公司。

城鄉(xiāng)學(xué)生運(yùn)動素質(zhì)指標(biāo)比較（表3）調(diào)查顯示，除握力外，城市和農(nóng)村男生50m跑、立定跳遠(yuǎn)、耐力跑、肌力、坐位體前屈差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），除肌力外，城市和農(nóng)村女生的50m跑、立定跳遠(yuǎn)、耐力跑、肌力、坐位體前屈差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

1.3病毒培養(yǎng)及DNA提取

取7～9日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細(xì)胞(chicken embryo fibroblast，CEF)用于MDV GX0101超強(qiáng)毒株、HNGS101等河南分離株及REV分離株HA9901的病毒接種及擴(kuò)大培養(yǎng)[21]，觀察細(xì)胞病變并收集病毒感染細(xì)胞，各MDV毒株及陰性對照細(xì)胞DNA的提取按此前文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行[21]，-30 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4RNA提取

取1.3所述MDV、REV各毒株感染的CEF細(xì)胞及CEF陰性細(xì)胞，用TRIzol法常規(guī)提取總RNA，用NanoDrop ND1000分光光度計(jì)測定RNA濃度，并用甲醛變性膠電泳進(jìn)行分析，檢測提取的RNA完整性，-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已報(bào)道的MDV參考毒株Md5病毒基因組序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)MDVgE基因特異性引物1對(表1)。同時，根據(jù)已報(bào)道的REV代表性毒株基因序列，分別設(shè)計(jì)針對REV-LTR、pol及gag基因的特異性引物各1對(表1)。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1MDV和REV基因擴(kuò)增引物

Table 1 Primers specific for the viral genes of MDV or REV

1.6PCR及基因克隆測序

取“1.3”所提取的DNA作為模板，以GX0101感染細(xì)胞DNA和CEF陰性細(xì)胞DNA分別作為陽性及陰性對照，用 MDVgE基因及REV-LTR基因的特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL的PCR體系包括：ExTaqDNA聚合酶10 μL，20 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，200 ng·μL-1的DNA模板各1 μL，ddH2O 8 μL。MDVgE基因的PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、58 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。 REV-LTR基因的PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、58 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。對各PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因克隆[20-21]，最后送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.7RT-PCR

取“1.4”所述RNA樣品各2 μg，以REV HA9901感染細(xì)胞RNA和CEF陰性細(xì)胞RNA樣品分別作為陽性及陰性對照，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒按照試劑盒操作說明書去除基因組DNA，然后用REVpol、gag基因下游引物(表1)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，各取cDNA 1 μL用于PCR擴(kuò)增。20 μL的PCR體系包括：ExTaqDNA聚合酶10 μL，20 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，cDNA模板各1 μL，ddH2O 8 μL。REVgag基因的PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s、55 ℃復(fù)性45 s、72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。REVpol基因的PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s、60 ℃復(fù)性45 s、72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。各取4 μL PCR產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.8間接免疫熒光試驗(yàn)

常規(guī)方法制備CEF，至細(xì)胞形成單層后即可接種病毒[21]。用含1%胎牛血清的DMEM重懸MDV河南分離株、GX0101及REV分離株HA9901的病毒液，MDV按每孔10 PFU·100 μL-1、REV按每孔103TCID50·100 μL-1的劑量各接種3孔，同時設(shè)3孔未接毒細(xì)胞作為陰性對照，于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，當(dāng)出現(xiàn)明顯病毒蝕斑或細(xì)胞病變時，用REV單抗11B118和MDV單抗BA4分別進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescent assay，IFA)[18]，檢測兩種病毒共感染情況。

2結(jié)果

2.1MDV分離株gE基因及REV-LTR的PCR

對GX0101和HNGS101等河南分離株最高代次病毒感染的CEF細(xì)胞DNA進(jìn)行g(shù)E基因的PCR擴(kuò)增，電泳分析結(jié)果顯示，17個分離株樣品及GX0101陽性對照中均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的特異性PCR產(chǎn)物，而CEF陰性對照樣品未擴(kuò)增出任何產(chǎn)物(圖1A)，表明成功進(jìn)行病毒分離株的復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)。而對REV-LTR基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，MDV河南分離株中，僅有HNGS206(p6)和HNXZ103(p11)的DNA中擴(kuò)增出了與預(yù)期大小相符的PCR產(chǎn)物，與陽性對照GX0101的擴(kuò)增結(jié)果一致(圖1B)，表明這兩個MDV分離株基因組中可能存在REV-LTR的重組。

2.2MDV分離株REV-LTR的PCR產(chǎn)物測序

將從HNGS206和HNXZ103分離株DNA樣品中擴(kuò)增的REV-LTR PCR產(chǎn)物割膠回收并克隆測序，分析結(jié)果顯示，兩個PCR產(chǎn)物的序列長度均為367 nt，與預(yù)期產(chǎn)物長度完全一致。用MegAlign軟件進(jìn)行比對分析顯示，二者僅第48和第289位核苷酸不同。Blast分析結(jié)果顯示，與GenBank中已發(fā)表的REV多個毒株的LTR序列相比，兩個擴(kuò)增片段的核苷酸序列相似性均達(dá)到99%。上述結(jié)果表明，MDV分離株HNGS206(p6)和HNXZ103(p11)病毒基因組中確實(shí)存在REV-LTR的重組。

2.3MDV分離株中REVgag和pol基因的RT-PCR

為探討這兩個MDV分離株病毒基因組中REV-LTR重組是自然攜帶的還是共感染培養(yǎng)引起的，對HNGS101等MDV河南分離株最高代次病毒感染的CEF細(xì)胞RNA分別進(jìn)行REVgag和pol基因的RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示僅有分離株HNGS206(p6)、HNXZ103(p11)和陽性對照HA9901中擴(kuò)增出了與預(yù)期大小相符的RT-PCR產(chǎn)物(圖1C和1D)，表明這兩個MDV河南分離株中可能存在REV。

2.4MDV分離株中REV的IFA檢測

為了進(jìn)一步確證MDV河南分離株中是否混合感染了REV，分別用HNGS101等河南分離株的最高代次病毒接種CEF細(xì)胞并進(jìn)行IFA檢測。結(jié)果顯示，MDV河南分離株感染的CEF細(xì)胞全部呈現(xiàn)MDV gB蛋白單抗BA4的特異性病毒蝕斑熒光染色，僅有兩個分離株HNGS206(p6)和HNXZ103(p11)感染的CEF細(xì)胞呈現(xiàn)REV gE蛋白單抗11B118特異性熒光染色，未接毒CEF細(xì)胞對照均為陰性(圖2)。上述結(jié)果表明，在17個MDV河南分離株中，HNGS206和HNXZ103中確實(shí)存在REV的共感染。

2.5MDV分離株中REV共感染及LTR重組的溯源分析

為了追溯HNGS206和HNXZ103中REV的共感染及LTR重組的來源，對這兩個毒株不同代次病毒均進(jìn)行了REV的gag和pol基因的RT-PCR擴(kuò)增以及IFA檢測。RT-PCR產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果顯示，分離株HNGS206的p2～p3代病毒RT-PCR均為陰性、但p4～p6代病毒均為陽性，而分離株HNXZ103的p3～p11代病毒RT-PCR均為陽性(圖3A和3B)，與上述對HNGS206或HNXZ103各不同代次病毒進(jìn)行的REV IFA結(jié)果一致。對用于MDV分離傳代培養(yǎng)的各批次CEF陰性細(xì)胞進(jìn)行的同步檢測結(jié)果表明，gag和pol基因的RT-PCR及REV IFA結(jié)果均為陰性，因此排除了在病毒傳代培養(yǎng)過程中人為污染REV的可能性。上述分析結(jié)果表明，MDV分離株HNGS206和HNXZ103中的REV來源于臨床病例雞的兩種病毒的混合感染。進(jìn)一步對這兩個MDV分離株的不同代次病毒DNA進(jìn)行REV-LTR PCR擴(kuò)增的結(jié)果顯示，HNGS206的p4～p6代和HNXZ103的p3～p11代LTR均為陽性(圖3C)，表明在MDV分離后傳代培養(yǎng)至第3～4代，MDV和REV即發(fā)生了基因重組。

3討論

近年來，MDV流行毒株的毒力不斷增強(qiáng)，目前國外已分離鑒定了多株超超強(qiáng)的MDV毒株(very virulent plus MDV，vv+MDV)，促使MDV毒力不斷增強(qiáng)的最主要因素可能與MDV疫苗的廣泛使用及免疫壓力有關(guān)。MDV與REV的混合感染是導(dǎo)致免疫失敗的重要因素之一[24]。已有研究證實(shí)，MDV和REV的體外共培養(yǎng)可導(dǎo)致兩種病毒的基因重組[8-10]，國內(nèi)學(xué)者崔治中等研究發(fā)現(xiàn)，MDV—REV的重組野毒株GX0101在病毒基因組重組插入LTR片段后，其致病性雖然有所降低，但其水平傳播力卻有所增強(qiáng)[13，17-18]。國外多項(xiàng)研究也表明，基于REV-LTR整合位點(diǎn)的不同，其引起MDV的致病性、復(fù)制力、水平傳播能力等病原學(xué)特性也有差異[8-10，14-16]。因此，進(jìn)一步深入研究MDV和REV的體外重組及流行病學(xué)情況，對于今后有效防控MD具有重要意義。

為了解國內(nèi)雞群中MDV—REV共感染及重組毒株的流行情況，本研究對此前分離自河南不同地區(qū)雞群的17個MDV野毒流行株進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這17個MDV分離株中有2個毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因組中存在REV-LTR的重組。對HNGS206和HNXZ103各不同代次培養(yǎng)病毒進(jìn)一步的溯源研究發(fā)現(xiàn)，這種基因重組最初極有可能是因?yàn)樵谂R床病例雞體內(nèi)就已經(jīng)發(fā)生MDV和REV的混合感染。作者進(jìn)一步研究的結(jié)果證實(shí)，隨著后續(xù)病毒分離培養(yǎng)及傳代3～4代，兩種病毒進(jìn)而發(fā)生了LTR的基因重組，這種體外重組與國外相關(guān)學(xué)者的研究基本一致[8，11-12]。稍顯遺憾的是，在最初病毒分離時，本研究未能同步保存病例雞的血樣或臟器樣本。若能對原始病料的病理組織切片進(jìn)行MDV和REV混合共感染IFA或PCR檢測，將更有助于兩種病毒基因重組的溯源分析，這是后續(xù)相關(guān)研究需要進(jìn)一步改善的。

鑒于國內(nèi)外雞群REV與MDV混合感染的普遍性，很多研究人員正致力于研發(fā)可針對兩種病毒的二價疫苗或重組疫苗。B.Lupiani等成功將REV—LTR插入CVI988疫苗株的病毒基因組中，該重組疫苗已被證實(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)中的生長率及免疫保護(hù)力均有一定程度的提高[25]。盡管如此，由于目前MDV和REV重組的生物學(xué)意義尚不明確，此類疫苗的臨床使用，仍將存在著促進(jìn)兩種病毒體外重組及大面積流行的巨大隱患。根據(jù)本研究的結(jié)果，MDV—REV重組毒株可能只是來源于宿主體內(nèi)的混合感染及病毒分離培養(yǎng)，而非自然界存在的自然重組毒株的廣泛流行。此前研究發(fā)現(xiàn)，LTR內(nèi)的啟動子和增強(qiáng)子很可能會改變MDV基因組插入位點(diǎn)附近的基因表達(dá)[14]，REV也可能通過MDV來幫助自身的傳播，這可能帶來嚴(yán)重后果。與MDV不同，REV除水平傳播外還可以垂直傳播，REV序列的重組很可能拓寬MDV的傳播途徑，從而加速其流行并帶來難以估計(jì)的損失[26]。總之，MDV與REV的混合感染及基因重組對于MDV的病原學(xué)特性及致病性的影響仍有待進(jìn)一步的深入研究，因此繼續(xù)加強(qiáng)MDV的流行病學(xué)監(jiān)測對該病的有效防控至關(guān)重要。

4結(jié)論

從17個MDV分離株中，分析鑒定了兩個基因重組毒株HNGS206和HNXZ103，這兩株病毒基因組中均存在REV-LTR基因片段的插入。進(jìn)一步的溯源研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HNGS206和HNXZ103并非MDV與REV的自然重組毒株，REV-LTR的重組可能發(fā)生于兩種病毒共感染宿主后的病毒分離培養(yǎng)及細(xì)胞傳代過程中。國內(nèi)雞群是否存在MDV自然重組毒株的流行仍需要進(jìn)一步的流行病學(xué)監(jiān)測。

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(編輯白永平)

Co-infection of Field Marek’s Disease Virus with Reticuloendotheliosis Virus Prevalent in Vaccinated Chicken Flocks

SU Jing-wei1，2，TENG Man1，LUO Jun1，3*，CHI Jia-qi1，YU Zu-hua3，YU Le-le1，HU Bo1，ZHANG Gai-ping1，2*

(1.KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture，HenanProvincialKeyLaboratoryofAnimalImmunology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicSafety，CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China)

Key words:MDV；REV；epidemiology；co-infection；virus passage；gene recombination

Abstract:This study was performed to investigate the co-infection and natural recombination of Marek’s disease virus (MDV) and reticuloendotheliosis virus (REV) in chicken flocks in China，and evaluate the potential influences of viral recombination on MDV biology.Based on polymerase chain reaction (PCR)，DNA sequencing and indirect immunofluorescent assay (IFA)，we presently studied a total of 17 MDV field isolates obtained from the vaccinated chicken flocks in Henan province.The PCR results showed that，among the 17 Henan isolates，two isolates，HNGS206 and HNXZ103，are recombinant MDVs containing the REV-LTR inserts.Subsequent experiments showed that neither of the two isolates are natural recombinant viruses and the integrations of LTR into the viral genomes may result from the clinical co-infection and/or virus isolation procedure.Our data indicates that although a wide-spread co-infection of both MDV and REV exists in chicken flocks in China，the epidemiology of the naturally occurring recombinant MDVs needs to be further monitored.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.017

收稿日期：2015-03-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31372445)；NSFC-廣東省政府聯(lián)合基金(U1131005)；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技基金(2013YQ28)

作者簡介：宿靖偉(1989-)，女，河南商丘人，碩士生，主要從事病毒分子生物學(xué)研究，Tel：0371-65756056，E-mail：sujingwei426@163.com *通信作者：羅俊，E-mail：luojun593@aliyun.com；張改平，E-mail：zhanggaiping2003@163.com

中圖分類號：S858.315.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0128-07