葡萄糖基氟蟲腈處理下蓖麻內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

毛根林, 解　云, 趙俊龍, 陳　炎, 徐漢虹, 林　菲

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510642)

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葡萄糖基氟蟲腈處理下蓖麻內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

毛根林, 解云, 趙俊龍, 陳炎, 徐漢虹, 林菲

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】篩選葡萄糖基氟蟲腈(GTF)及溶劑二甲基亞砜(DMSO)處理下蓖麻Ricinuscommunis穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為研究GTF的韌皮部裝載機(jī)制提供參考?！痉椒ā窟x取Actin，ARC，ef1a，SamDC，TUA6為內(nèi)參基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因表達(dá)量并利用geNorm，NormFinder，BestKeeper，Delta CT軟件及RefFinder在線分析工具綜合比較不同時(shí)間和不同濃度的GTF與DMSO處理后，5個(gè)候選內(nèi)參基因在蓖麻幼苗子葉中表達(dá)的穩(wěn)定性?！窘Y(jié)果】各軟件分析得出的內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名依次為geNorm：Actin=ef1a>SamDC>ARC>TUA6；NormFinder：SamDC>ARC>Actin>ef1a>TUA6;BestKeeper：Actin>ef1a>SamDC>ARC>TUA6；Delta CT：SamDC>Actin>ARC>ef1a>TUA6; RefFinder：Actin>SamDC>ef1a>ARC>TUA6，而單獨(dú)分析DMSO處理時(shí)，穩(wěn)定性排名則為：ef1a>SamDC>Actin>TUA6>ARC?！窘Y(jié)論】綜合分析GTF和DMSO處理，Actin的表達(dá)最穩(wěn)定；在DMSO處理下，則ef1a最為穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：蓖麻； 葡萄糖基氟蟲腈； 二甲基亞砜； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR； 內(nèi)參基因； 穩(wěn)定性

農(nóng)藥施用減量增效要求在減少農(nóng)藥施用量的同時(shí)提高農(nóng)藥的使用效率，降低農(nóng)藥殘留，保證食品安全，這也是當(dāng)前農(nóng)藥研究者共同努力的方向。徐漢虹等[1]提出的“導(dǎo)向農(nóng)藥”理念完美契合農(nóng)藥減量增效的目的，對(duì)保障食品安全具有非常重要的意義。導(dǎo)向農(nóng)藥能夠在植物內(nèi)源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下定向積累至病蟲為害部位，它的作用方式可以分為2種：一是當(dāng)植物受到危害時(shí)，導(dǎo)向農(nóng)藥分子能夠被植物應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的酶消解并釋放出農(nóng)藥母體分子作用于靶標(biāo)；二是具有農(nóng)藥活性的導(dǎo)向分子直接作用于靶標(biāo)從而達(dá)到防治病蟲害的目的。植物內(nèi)源糖從源葉合成，在糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)下源源不斷地通過韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)至植物庫組織[2]；基于導(dǎo)向農(nóng)藥的理念，Yang等[3]合成了葡萄糖基氟蟲腈耦合物，并發(fā)現(xiàn)其有可能是通過蓖麻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)進(jìn)入蓖麻韌皮部[4]。充分利用植物對(duì)內(nèi)外源化合物的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制對(duì)于提高農(nóng)作物產(chǎn)量，探索病蟲害防治新策略具有非常重要的意義。

利用植物對(duì)內(nèi)外源糖物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行修飾從而提高作物產(chǎn)量；合成能夠被植物轉(zhuǎn)運(yùn)載體介導(dǎo)的新型農(nóng)藥分子，實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥分子在植物體內(nèi)的主動(dòng)運(yùn)輸和定向積累，對(duì)于病蟲害防治能起到事半功倍的效果。研究發(fā)現(xiàn)草甘膦、百草枯、葡萄糖基氟蟲腈、部分農(nóng)藥分子與氨基酸的耦合物L(fēng)-lysine-2,4-D等雖然能被磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、聚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所介導(dǎo)[4-7]，但卻無法明確具體的轉(zhuǎn)運(yùn)子，無法明確化合物與轉(zhuǎn)運(yùn)載體之間的構(gòu)效關(guān)系，大大降低了這類農(nóng)藥的開發(fā)效率。

蓖麻Ricinuscommunis是用來研究?jī)?nèi)外源化合物韌皮部輸導(dǎo)性的模式植物，隨著其基因組數(shù)據(jù)庫的釋放，蓖麻中的各類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族將會(huì)被鑒定，利用RT-qPCR技術(shù)分析并克隆能被載體介導(dǎo)的化合物處理前后差異表達(dá)的基因，是鑒定參與化合物韌皮部裝載的相關(guān)載體蛋白的重要手段。RT-qPCR自1995年由美國PE公司成功開發(fā)以來，便以其操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、分子診斷學(xué)、農(nóng)學(xué)與醫(yī)學(xué)、食品微生物學(xué)等領(lǐng)域[8]。在基因表達(dá)分析過程中，RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量、不同組織或細(xì)胞間反轉(zhuǎn)錄效率的差異等因素均有可能影響到目的基因表達(dá)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[9]。為了獲取準(zhǔn)確的結(jié)果，除了提高RNA質(zhì)量，選擇合適的內(nèi)參基因來校正和標(biāo)準(zhǔn)化mRNA是最首要的方式[10]。理想的內(nèi)參基因的表達(dá)不受試驗(yàn)因素的影響而恒定表達(dá)在各種類型的組織或細(xì)胞中[11]。常用的內(nèi)參基因是構(gòu)成細(xì)胞器骨架的基本組分或是參與生物體的基本生化代謝過程的基因[12-14]。同一個(gè)內(nèi)參基因在不同的試驗(yàn)條件下表達(dá)的穩(wěn)定性是不一樣的，如玉米根螢葉甲DiabroticavirgiferavirgiferaLeconte在不同的試驗(yàn)條件下β-Actin在其整個(gè)生命周期內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，RPS9則在dsRNA處理后的玉米根螢葉甲中表達(dá)穩(wěn)定性最好，而BT處理后，EF-1在不同的組織中表達(dá)最為穩(wěn)定[15]；在荔枝果實(shí)不同發(fā)育階段用外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理后β-Actin比GAPDH、18SrRNA、UBQ、eEF和25S rRNA的穩(wěn)定性更好[16-17]，由此可見篩選出化合物處理前后都能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是RT-qPCR技術(shù)分析并克隆能被載體介導(dǎo)的化合物處理后差異表達(dá)的基因的基礎(chǔ)。

本研究以蓖麻幼苗子葉為材料，選取常用的內(nèi)參基因Actin、ARC、SamDC、ef1a、TUA6作為候選基因，用RT-qPCR方法檢測(cè)上述常用內(nèi)參基因在不同濃度及不同時(shí)間的GTF及其溶劑DMSO處理下的表達(dá)量，分別采用常用的內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)軟件geNorm[10]、NormFinder[18]、BestKeeper[19]、Delta CT[20]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最后用RefFinder[21]在線工具對(duì)上述4種軟件的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為研究GTF相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)分析研究篩選出最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

1材料與方法

1.1材料

蓖麻種子由淄博市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。成熟蓖麻種子在濕脫脂棉上于27 ℃下催芽48 h后，選出發(fā)芽的種子，播入蛭石中，置于人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度為27 ℃，相對(duì)濕度為75%～85%，光照度260～350 lx，每天光照14 h,連續(xù)培養(yǎng)6 d的蓖麻幼苗作為供試材料。

1.2方法

1.2.1蓖麻幼苗的藥物處理將蓖麻幼苗小心剝?nèi)ヅ呷?，用手輕輕擦洗子葉表面，切勿折疊或弄破子葉。用子葉培養(yǎng)緩沖液(20 mmol·L-1MES, 0.25 mmol·L-1MgCl2, 0.5 mmol·L-1CaCl2, 2 mmol·L-1EDTA, pH 5.0)配制相應(yīng)濃度的GTF或者DMSO后，將蓖麻子葉浸泡于相應(yīng)含藥緩沖液中，同時(shí)將蓖麻根部置于根部培養(yǎng)緩沖液(0.5 mmol·L-1CaCl2, 1 mmol·L-1MES)中。濃度梯度試驗(yàn)設(shè)定7個(gè)GTF和DMSO濃度梯度，分別為10、25、50、100、200、500、1 000 μmol·L-1，于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后收集樣品；時(shí)間梯度試驗(yàn)設(shè)置為以100 μmol·L-1的GTF或DMSO處理蓖麻幼苗，分別于0、3、6、9、12 h后收集子葉。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不含GTF及DMSO的緩沖液為對(duì)照組，完成相應(yīng)的處理后在蓖麻幼苗胚柄處剪斷，將子葉裝入錫紙袋，用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2蓖麻子葉總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成使用Omega植物RNA提取試劑盒提取經(jīng)過處理的蓖麻子葉總RNA，并用核酸蛋白定量?jī)x(ND1000，Eppendorf)檢測(cè)RNA樣品的D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm值，確定RNA的濃度和純度，同時(shí)用含甲醛(w=12.5%)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。隨后RNA用RQ1 RNase-free DNase處理，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bio-Rad)進(jìn)行第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄完成后以合成的cDNA為模板克隆內(nèi)參基因片段以進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)。

1.2.3候選內(nèi)參基因的處理根據(jù)水稻內(nèi)參基因的氨基酸序列[20], 在NCBI上獲得對(duì)應(yīng)的蓖麻內(nèi)參基因登錄號(hào)和基因序列，并通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由北京六合華大基因科技有限公司合成。選取的內(nèi)參基因引物序列見表1。

表1　RT-qPCR候選內(nèi)參基因的引物序列

以含候選基因片段的質(zhì)粒為模板構(gòu)建其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用cDNA為模板獲得候選內(nèi)參基因片段。通過20 g·L-1凝膠電泳檢測(cè)并用 DNA凝膠純化試劑盒回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接pMD20-T載體上，藍(lán)白斑篩選陽性克隆并測(cè)序。經(jīng)驗(yàn)證正確的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，用質(zhì)粒小提試劑盒(Omega)提取質(zhì)粒。取500 ng質(zhì)粒用Dilution Buffer(Takara)稀釋, 每個(gè)梯度稀釋10倍，依次稀釋5～8個(gè)梯度，則濃度分別為50、 5、 1/2、1/20、 1/200和1/2 000、1/20 000、1/200 000 ng·μL-1。以稀釋后的質(zhì)粒為模板進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，PCR儀自帶的計(jì)算軟件CFX Manager TM Software自動(dòng)計(jì)算獲得熔解曲線，并根據(jù)所得Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率(k)和線性相關(guān)系數(shù)(R)。根據(jù)公式E= 5-1/k-1，計(jì)算得出擴(kuò)增效率(E)。候選內(nèi)參基因引物特異性則通過RT-qPCR的熔解曲線的峰形圖來評(píng)價(jià)。

1.2.4RT-qPCR 分析RT-qPCR反應(yīng)用Bio-Rad CFX-96 Real-Time PCR System完成。反應(yīng)體系按照IQTMSYBR? Green Supermix說明書進(jìn)行配制，反應(yīng)總體積為20 μL；反應(yīng)條件如下：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行65～95 ℃熔解曲線分析。每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Bio-Rad CFX-96 Real-Time PCR System獲得的各樣品的Ct值，采用geNorm，NormFinder，BestKeeper,Delta CT 4種算法對(duì)各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行比較，同時(shí)參考RefFinder的計(jì)算結(jié)果，篩選出在GTF及DMSO處理下穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因。

2結(jié)果與分析

2.1候選內(nèi)參基因引物特異性及擴(kuò)增效率

以反轉(zhuǎn)獲得的cDNA為模板擴(kuò)增候選內(nèi)參基因片段，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示所得目的條帶大小與理論值一致, 且沒有發(fā)現(xiàn)其他條帶，擴(kuò)增特異性好(圖1)。

M: DNA Marker DL 2 000；1:Actin；2:ARC；3:ef1a; 4:SamDC; 5:TUA6。

圖1候選內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

Fig.1Detection of PCR amplification products of five candidate reference genes

RT-PCR的結(jié)果表明，各候選內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)(R)≥ 0.996, 引物的擴(kuò)增效率為95.0%～107.7%，均符合RT-qPCR對(duì)擴(kuò)增效率的要求(表2)；進(jìn)一步分析熔解曲線，發(fā)現(xiàn)各候選內(nèi)參基因都只產(chǎn)生單一的熔解峰。上述結(jié)果說明所設(shè)計(jì)的引物特異性良好，RT-qPCR反應(yīng)的專一性高，準(zhǔn)確性好。

表2　5個(gè)候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

2.2候選內(nèi)參基因的表達(dá)譜分析

在RT-qPCR試驗(yàn)中，Ct值與基因的表達(dá)量成反比。本研究結(jié)果表明同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差很小，Ct值非常接近，說明擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)性好，能準(zhǔn)確反映基因的轉(zhuǎn)錄水平；5個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值均位于17～24，同時(shí)都處于相應(yīng)候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct跨距之內(nèi)；同一個(gè)基因，濃度處理對(duì)其表達(dá)量影響較大；其中對(duì)ef1a的表達(dá)量最大(17～21)，SamDC及ARC的表達(dá)量相對(duì)較小(18～24)；在所有的樣品中，ef1a的Ct值變化范圍最小，△Ct為2.77，其次是Actin，SamDC的Ct值變化最大，△Ct為4.23。同一個(gè)基因在不同的樣品中表達(dá)量的差異說明有必要對(duì)這些常用內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，以選擇合適的內(nèi)參基因或組合來進(jìn)行接下來的定量試驗(yàn)。

2.3不同處理候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.14種軟件分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性將RT-qPCR試驗(yàn)所獲得的Ct值處理后導(dǎo)入geNorm(V3.5)計(jì)算出各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值(M值)，M值越大，表示穩(wěn)定性越差。計(jì)算結(jié)果(圖2a)表明，5個(gè)候選內(nèi)參基因均相對(duì)較穩(wěn)定(M<1.5)，Actin和ef1a的M值最低，穩(wěn)定性最好；ARC的M值最高，穩(wěn)定性最差；這5個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性從高到低依次為：Actin=ef1a>SamDC>ARC>TUA6，即在geNorm的算法中，Actin與ef1a的穩(wěn)定性最好。

按NormFinder軟件要求，將處理好的數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件進(jìn)行計(jì)算，得出各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值M，M值越大，說明基因的穩(wěn)定性越差；反之則說明基因的表達(dá)穩(wěn)定性越好。經(jīng)計(jì)算獲得5個(gè)候選內(nèi)參基因的M值，按穩(wěn)定性由高到低依次為：SamDC>ARC>Actin>ef1a>TUA6(圖2b)，即在NormFinder算法中，SamDC的穩(wěn)定性最好。

將RT-qPCR反應(yīng)獲得的Ct值導(dǎo)入BestKeeper軟件，根據(jù)各候選基因標(biāo)準(zhǔn)偏差值(SD)來確定候選基因的相對(duì)穩(wěn)定性，SD值越小，穩(wěn)定性越好。在本次試驗(yàn)中，所有基因的SD值均小于1，其SD大小順序依次為：Actin>ef1a>SamDC>ARC>TUA6(圖2c)，即在BestKeeper軟件的算法中Actin的穩(wěn)定性最好。

利用Delta CT軟件計(jì)算5個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD),SD越小，表明基因穩(wěn)定性越高。將計(jì)算結(jié)果按穩(wěn)定性由高到低進(jìn)行排序，依次為：SamDC>Actin>ARC>ef1a>TUA6(圖2d)，即在Delta CT軟件的算法中SamDC的穩(wěn)定性最好。

圖2　不同軟件分析5種候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性

Fig.2Expression stability of five candidate reference genes calculated by geNorm，NormFinder software，BestKeeper software and Delta CT software

2.3.2RefFinder綜合分析由以上分析可知，geNorm，NormFinder，Delta CT和BestKeeper 4種軟件由于不同的算法分析出來的結(jié)果也存在差異。此時(shí)可以利用RefFinder在線分析工具來進(jìn)行綜合分析從而選出表達(dá)相對(duì)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。RefFinder可以根據(jù)各種算法所得的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定表型排名的幾何平均數(shù)作為綜合排名，從而篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?；蚓C合穩(wěn)定參數(shù)與基因表達(dá)穩(wěn)定性成反比。根據(jù)計(jì)算結(jié)果可知GTF及DMSO處理下，候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為：Actin>SamDC>ef1a>ARC>TUA6(圖4)。

圖3　RefFinder綜合分析比較候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

Fig.3Expression stability of five candidate reference genes analyzed by RefFinder software

2.3.3DMSO處理下內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析DMSO在蓖麻體系中的韌皮部輸導(dǎo)性研究中常被用作溶劑，有必要對(duì)其處理的樣品單獨(dú)進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析，以作參考。RefFinder分析結(jié)果(圖4)表明，在10～1 000 μmol·L-1的濃度梯度及0～12 h的時(shí)間梯度的DMSO處理下ef1a是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

圖4DMSO在不同處理濃度及不同處理時(shí)間下的內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

Fig.4Expression stability of five candidate reference genes analyzed by RefFinder in all tested samples treated with different concentrations of DMSO and different times

3結(jié)論

本研究比較了Actin、ARC、SamDC、ef1a、TUA6 基因在不同濃度及不同時(shí)間的GTF及其溶劑DMSO處理前后的表達(dá)量，并分別采用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT 4個(gè)軟件及RefFinder在線分析工具對(duì)各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行計(jì)算分析，以期獲得相對(duì)穩(wěn)定的用于校正和標(biāo)準(zhǔn)化RT-qPCR試驗(yàn)的一個(gè)或是一組內(nèi)參基因。geNorm軟件的計(jì)算結(jié)果中，Actin與ef1a為穩(wěn)定性最好的組合；在NormFinder與Delta CT的算法中，SamDC是穩(wěn)定性最好、最適合的內(nèi)參基因；而通過BestKeeper獲得的結(jié)果表明，Actin是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。由于各軟件算法的不同導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果不盡相同，難以取舍。而RefFinder在線工具可以根據(jù)以上4種算法所得的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的幾何平均數(shù)綜合排名，篩選出表達(dá)最為穩(wěn)定的基因，結(jié)果表明GTF、DMSO共同處理綜合分析時(shí)Actin的穩(wěn)定性最好。單獨(dú)對(duì)DMSO處理后的內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)ef1a是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。本文分析了5個(gè)常用內(nèi)參基因在GTF和 DMSO共同處理及DMSO單獨(dú)處理下內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，可為相關(guān)研究提供參考。

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【責(zé)任編輯霍歡】

Stability analysis of internal reference gene of Ricinus communis

treated by glucose-fipronil

MAO Genlin, XIE Yun, ZHAO Junlong, CHEN Yan, XU Hanhong, LIN Fei

(College of Agriculture, South China Agricultural University/Key Laboratory of Natural Pesticide and

Chemical Biology, Ministry of Education, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To screen reliable internal reference genes of castor，Ricinuscommunis，treated by glucose-fipronil (GTF) and the solvent dimethyl sulfoxide (DMSO)，and to provide a basis for studying the uptake mechanism of GTF. 【Method】Actin,ARC,ef1a,SamDCandTUA6 genes were selected as candidate reference genes. Specific primers for each gene were designed and real-time quantitative PCR was conducted. Five softwares，including geNorm, NormFinder, BestKeeper, Delta CT and RefFinder，were employed to analyze the gene expression stabilities in cotyledon of castor seedlings treated by GTF and DMSO with different concentration and time. 【Result】 The stabilities were variant according to different softwares. The rank orders of stability were geNorm:Actin=ef1a>SamDC>ARC>TUA6；NormFinder：SamDC>ARC>Actin>ef1a>TUA6; BestKeeper:Actin>ef1a>SamDC>ARC>TUA6；Delta CT:Actin>ef1a>SamDC>ARC>TUA6;RefFinder:Actin>SamDC>ef1a>ARC>TUA6. With a single analysis of DMSO treatment by RefFinder showed thatef1a>SamDC>Actin>TUA6>ARC.【Conclusion】Actinis the stablest reference gene under GTF and DMSO treatments, whileef1ais the stablest one under DMSO treatment.

Key words：Ricinuscommunis; GTF; DMSO; RT-qPCR; internal reference gene; stability

中圖分類號(hào)：S511；S502

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-411X(2016)01-0052-06

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31171889)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20114404110020，20134404130003)

作者簡(jiǎn)介：毛根林(1989—)，男，碩士研究生，E-mail：maogenlin@163.com；通信作者：徐漢虹(1961—)，男，教授，博士，E-mail：hhxu@scau.edu.cn；林菲(1977—)，女，副研究員，博士，E-mail：resistanc@scau.edu.cn

收稿日期：2015-04-02優(yōu)先出版時(shí)間：2015-12-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1132.020.html

毛根林, 解云, 趙俊龍，等.葡萄糖基氟蟲腈處理下蓖麻內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(1):52-57.