張海靜　王　哲　武　瑩　張鶴

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽　110847）

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耳聾左慈丸對老年性耳聾模型小鼠血清SOD、MDA、PKC的影響※

張海靜王哲*武瑩張鶴

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽110847）

摘要：目的研究耳聾左慈丸對老年性耳聾模型小鼠血清SOD、MDA、PKC含量的影響，探討治療老年性耳聾的機制。

方法將100只健康雄性SPF級昆明小鼠隨機分為2組，對照組（CG）15只和造模組85只，造模組采用腹腔注射D-半乳糖（150 mg/kg.d），對照組腹腔注射等劑量0.9%生理鹽水，每日1次，連續(xù)2個月。造模成功后，將75只小鼠隨機分為5組，模型組（MG）、VitC組(VCG)、中藥低劑量組(LDG)、中藥中劑量組(MDG)、中藥高劑量組(HDG)，每組15只。VCG灌胃VitC注射液（150 mg/kg.d），中藥治療組灌胃不同濃度耳聾左慈丸溶液，分別是LDG(0.3 g/ml)、MDG（0.6 g/ml)、HDG(1.2 g/ml），CG和MG灌胃等劑量的0.9%NaCl，每日1次，連續(xù)14天。采用聽性腦干反應(yīng)（ABR）檢測聽力水平，用比色法測定血清的SOD活性、MDA含量的變化，用雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附( ABC- ELISA)法檢測血清中PKC的含量。結(jié)果與對照組相比，模型組小鼠的一般情況均減退，且各頻率ABR值顯著增高（P＜0.01或P＜0.05），血清SOD活性降低、血清MDA含量增高（P＜0.01）、血清PKC的含量升高(P＜0.01)。與模型組相比，中藥組小鼠的一般情況均得到改善，且各頻率ABR值降低（P＜0.01），依次是HDG＜MDG＜LDG，血清SOD活性升高，依次是HDG>MDG>LDG，血清MDA含量逐漸降低，依次是LDG>MDG>HDG，，減輕了氧自由基引起的病理損傷；VCG小鼠血清的SOD活性、MDA含量與LDG相近。中藥各組顯著降低血清PKC的含量(P＜0.01)。結(jié)論耳聾左慈丸可以減輕老年性耳聾模型小鼠的病理損害，對氧自由基的損傷有一定的保護作用；降低PKC濃度，從而對cAMP/PKC信號通路起調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：耳聾左慈丸；SOD、MDA、PKC；老年性耳聾；實驗研究；小鼠

耳聾左慈丸是治療耳聾耳鳴的經(jīng)典方，是在六味地黃丸的基礎(chǔ)上增加了柴胡和磁石變更而來，臨床觀察和現(xiàn)代的實驗研究均證實，耳聾左慈丸對藥物性耳聾、突發(fā)性耳聾及老年性耳聾等均有確切的療效，但具體的作用機制還不清楚，制約了耳聾左慈丸的臨床應(yīng)用發(fā)展[1]。老年性耳聾是一類伴隨衰老而出現(xiàn)的聽覺減退的疾病，它的發(fā)生與自由基損傷、線粒體DNA突變、微循環(huán)障礙、糖原蓄積以及細(xì)胞凋亡等有關(guān)[2]。大量研究[3]發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳氧化或抗氧化失衡在老年性耳聾過程中扮演了重要的角色。另外，有研究[4]證實了過氧化物陰離子在老年性耳蝸損害中的重要作用。正常生命活動中，機體會產(chǎn)生氧自由基維持能量代謝、清除機體內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)機體內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路等，發(fā)揮著重要的作用[5]。自由基的增加或減少都會對身體造成傷害，但機體內(nèi)有抗氧化的系統(tǒng)來調(diào)節(jié)氧化與抗氧化的平衡。其中研究比較多的也是非常重要的酶就是超氧化物歧化酶（SOD）。研究發(fā)現(xiàn)[6]SOD對耳蝸神經(jīng)元與耳蝸血管紋有重要的保護作用。有研究推測[7]PKC活化后可以減輕自由基對組織的損傷，從而對小鼠耳蝸產(chǎn)生保護作用。本實驗通過對老年性耳聾模型小鼠SOD、MDA、PKC的檢測，來探討耳聾左慈丸對老年性耳聾模型小鼠的氧化保護作用，為進(jìn)一步的實驗研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物雄性清潔級昆明小鼠，4周齡，體質(zhì)量（20±2）g，耳廓反射靈敏，共100只。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2主要藥物與試劑耳聾左慈丸（蘭州佛慈制藥股份有限公司），維生素C注射液20 ml/2.5 g（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）；D-半乳糖；0.9%NaCl溶液，500 ml；10%戊巴比妥鈉；冰醋酸；無水乙醇；SOD試劑盒（測總）、丙二醛（MDA），100T/96樣，南京建成生物工程研究所。1.1.3主要儀器電子稱，聽覺生理工作站（Intelligent Hearing Systems），SMART ASSR OAE VRASmart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)：美國智聽公司；分光光度計，低溫高速離心機。

1.2方法

1.2.1分組將100只雄性昆明小鼠，常溫常規(guī)安靜狀態(tài)下喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)9天。按照隨機數(shù)字表法隨機分組，標(biāo)記稱重后，分為2組，對照組15只和造模組85只，將造模成功后的小鼠隨機分為模型組、VitC組、高劑量組、中劑量組和低劑量組。

1.2.2造模根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)，各組的給藥方式和劑量如下：造模[8-11]采用腹腔注射D-半乳糖（150 mg/kg·d），每日1次，連續(xù)2個月。

1.2.3給藥造模成功后，VCG組[12、13]灌胃VitC注射液（150 mg/kg·d），中藥組[14-16]同時灌胃，每日1次，連續(xù)14天?？瞻讓φ战M腹腔注射等劑量的0.9 %NaCl，每日1次，連續(xù)2個月后，灌胃等劑量的0.9 %NaCl。低、中、高劑量組按照人-鼠等效量[17、18]的1、2、4倍給藥，分別是0.3 g/ml、0.6 g/ml、1.2 g/ml，每日1次，連續(xù)14天。根據(jù)耳聾左慈丸的使用說明書，可知每8丸相當(dāng)于原生藥3 g，根據(jù)所需濃度，在乳缽內(nèi)研磨后，用生理鹽水稀釋到所需濃度用生理鹽水溶解所需的丸藥數(shù)。

1.3指標(biāo)檢測

1.3.1聽力水平測定采用聽性腦干反應(yīng)（ABR）檢測聽力，在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行操作。用1 %戊巴比妥鈉0.1 g/ kg麻醉后，將小鼠放在恒溫電熱毯上，溫度控制在37°C左右。分別將金屬電極的正極置于顱頂正中皮下，負(fù)極置于給聲側(cè)耳廓后皮下，接地電價置于對側(cè)耳廓后皮下。應(yīng)用聽覺誘發(fā)點位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音（tone burst）刺激，依次為8 kHz、12 kHz和24 kHz，帶通濾波100～1500 Hz，掃描時間為15 ms，強度從100 dB SPL開始，以5 dB逐次遞減，閾值為至少重復(fù)出現(xiàn)兩次的ABR波的強度。

1.3.2血清SOD活性、MDA、PKC含量的測定用摘除眼球取血法取血，靜置離心后取血清，分別嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定。

1.3.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用（x±s），采用單因素方差分析，P＜0.01表示差異有非常顯著性意義。

2　結(jié)果

2.1小鼠一般狀況的觀察造模過程中有小鼠死亡，死亡原因為雄性小鼠之間的撕咬，解決辦法是換大的飼養(yǎng)籠。正常對照組的小鼠皮毛光亮，活動能力正常，體重增加，飲食水及大小便正常；模型組注射D-半乳糖后，隨著時間的延長，小鼠逐漸表現(xiàn)出活動能力下降，脊椎隆起，體型消瘦，皮膚松弛，毛發(fā)稀疏，沒有光澤，易脫落，易抓取，體重增加緩慢，精神萎靡，飲食減少，尿量增多。灌胃耳聾左慈丸后的各組，一般狀況得到明顯的改善。

2.2ABR檢測結(jié)果在不同頻率的刺激下，ABR閾值有明顯的變化，與正常組相比，模型組的閾值均升高，有顯著性差異（P＜0.01，表1），說明造模成功。灌胃后，在不同頻率的刺激下，與模型組相比，ABR閾值有顯著性差異（P＜0.01），隨著耳聾左慈丸給藥量的增加，ABR閾值逐漸降低，呈明顯的效量關(guān)系（P＜0.01，表2），同一組不同頻率的刺激對ABR的閾值影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　造模后小鼠ABR閾值的變化?。▁±s，dB SPL）

表2　小鼠12耳ABR閾值的比較?。▁±s，dB SPL）

2.3小鼠血清SOD活性、MDA、PKC含量變化根據(jù)表3的實驗結(jié)果，可知MG小鼠血清的SOD活性明顯降低、MDA含量明顯升高、PKC水平明顯升高，均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示造模成功。與MG相比，中藥治療組小鼠血清的SOD活性明顯升高、MDA含量明顯降低，其中SOD活性HDG>MDG>LDG，有統(tǒng)計學(xué)意義，MDA含量HDG＜MDG＜LDG，有統(tǒng)計學(xué)意義，而VCG與LDG組相近，沒有統(tǒng)計學(xué)意義；HDG的小鼠血清PKC水平明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義，而MDG、LDG、VCG小鼠血清水平相近，沒有統(tǒng)計學(xué)意義，提示沒有量效關(guān)系。

表3　小鼠血清SOD活性、MDA含量、PKC水平　(x±s，n=8)

3　討論

耳聾左慈丸是治療老年性耳聾的經(jīng)典方劑，在臨床已有廣泛的應(yīng)用，但具體的作用機制尚不明確。目前研究老年性耳聾的發(fā)生與氧化損傷、基因缺失、糖原蓄積等有關(guān)[2]。根據(jù)所得的聽力檢測結(jié)果及小鼠的外在活動表現(xiàn)可知，采用D-半乳糖腹腔注射造模老年性耳聾是可行的，大量研究亦表明[9，19]，這是目前研究造模老年性耳聾比較穩(wěn)定適合的方案，半乳糖攝入過量可使機體抗氧化能力下降，DNA氧化損傷加重，從而誘導(dǎo)內(nèi)耳感覺細(xì)胞和中樞聽覺神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并造成聽力漸進(jìn)性障礙。

耳蝸是有氧代謝非常旺盛的器官，在正常情況下，機體的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)，處于平衡的狀態(tài)，避免受到自由基的攻擊。隨著年齡的增加，機體的各方面的代謝減弱，氧化與抗氧化系統(tǒng)處于失衡的狀態(tài)，自由基產(chǎn)生多于消除，耳蝸受到自由基的損害。在抗氧化酶系統(tǒng)中，超氧化物歧化酶SOD是重要的一員，其作用是清除體內(nèi)代謝產(chǎn)生的氧自由基，產(chǎn)生大量氧自由基，易受到氧自由基和活性氧的攻擊，SOD作為抗氧化劑對耳蝸有保護作用，因此他們提出SOD內(nèi)耳基因治療來抗氧化損傷[20]。有研究表明[21]，衰老與自由基引起的生物膜的脂類過氧化，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)損傷和功能失活有密切關(guān)系，且SOD活性隨著年齡的增加而逐漸降低，而MDA隨著年齡的增加而逐漸升高。自由基損害的體現(xiàn)之一就是MDA含量的增加，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基極易侵害細(xì)胞脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸而形成脂質(zhì)自由基，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。過氧化脂質(zhì)反應(yīng)的產(chǎn)物丙二醛(MDA)又可通過蛋白質(zhì)一級氨基基團反應(yīng)與蛋白質(zhì)交聯(lián)，最終造成細(xì)胞功能的喪失和細(xì)胞體的破壞，故MDA可以作為判斷氧化損傷的指標(biāo)之一。本實驗的研究結(jié)果可以看出，與模型組相比，耳聾左慈丸治療組的小鼠聽力改善，且血清的SOD活性提高、MDA的含量降低，提示了耳聾左慈丸治療老年性耳聾的機制之一可能是抗自由基損傷。

蛋白激酶C（PKC）是磷脂酶依賴性的Ca2+激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是cAMP/PKC信號通路的關(guān)鍵酶，細(xì)胞在靜止?fàn)顟B(tài)時PKC主要以非活性構(gòu)象存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到絲裂原等刺激時，通過G蛋白活化磷脂酶C，使胞膜上肌醇脂酶活化并水解4，5-二磷酸脂酰肌醇產(chǎn)生三磷酸肌醇和甘油二脂(DG)，引起胞膜上DG瞬時間積累，DG則通過明顯提高Ca2+的親合力而活化PKC?；罨腜KC在調(diào)節(jié)生物信號的傳遞，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖分化與凋亡等方面均起到重要的作用。有研究表明[7]活化的PKC可以減輕自由基損傷，從而來減輕細(xì)胞的損傷和凋亡。本實驗研究結(jié)果模型組小鼠血清的PKC的含量明顯高于正常組，且有統(tǒng)計學(xué)意義。耳聾左慈丸各組的小鼠血清PKC含量降低，且有統(tǒng)計學(xué)意義，提示了耳聾左慈丸能夠降低小鼠血清PKC的含量，起到了調(diào)節(jié)cAMP/PKC信號通路的作用，進(jìn)一步提示了該信號通路可能在抗自由基損傷方面，與SOD等抗氧化酶有協(xié)同作用，具體耳聾左慈丸如何通過降低小鼠血清PKC的含量起抗自由基損傷的作用，從而達(dá)到改善老年性耳聾的病情，是否可能與該信號通路相關(guān)的其他因素有關(guān)，需要本課題組后續(xù)的實驗研究。

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The Effect of Erlong Zuoci Pill on SOD, MDA and PKC in Serum of Mice with Presbycusis Model

ZHANG Haijing, WANG Zhe, WU Ying, ZHANG He
(Teaching and Research Section of Pathology, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China)

Abstract:Objective To research the effect of the Erlong Zuoci pill on SOD, MDA and PKC in serum of mice with presbycusis model and the related mechanism. Methods One hundred healthy male SPF Kunming mice were randomly divided into 2 groups: control group (CG) had fifteen mice, and molding group had eighty-five mice. The mice in CG were treated with 0.9% NaCl and the other mice were treated with ip D-galactose (150mg/kg.d) , once a day, with 2 months. After duplicating the mold, the seventy-five mice were randomly divided into 5 groups: model group (MG) , VitC group (VCG) , Chinese medicine low dose group (LDG) , Chinese medicine mid-dose group (MDG) , Chinese medicine high dose group (HDG) , with 15 mice ineach group. The mice in VCG were treated withVitC injection (150mg/kg.d) , the Chinese medicine group were treated with different density Erlong Zuoci pills, included LDG (0.3g/ml) , MDG (0.6g/ml) , HDG (1.2g/ml) once a day, with 14 days. We checked its listening ability by auditory brainstem response (ABR) , and used colorimetric method to determine the changes of the serum SOD activity and MDA content and the PKC in rats serum was detected by double antibody clip ELASA method. Results Compared with CG, the general condition of mice was subsided, the value of ABR in MG was increased markedly (P＜0.01 or P＜0.05) , the serum SOD activity decreased, and MDA content increased, PKC content increased (P＜0.01) . Compared with MG, the general condition of mice was improved, the value of ABR in the Chinese medicine group was decreased (P＜0.01 or P ＜0.05) , HDG ＜ MDG＜ LDG, the serum SOD activity was decreased, HDG >MDG > LDG, and MDA content1increased (P＜0.01) , LDG > MDG > HDG, and the SOD, MDA of LDG and VCG is similar. The PKC content of traditional medicine group were significantly decreased ( P＜0.01) . Conclusion The Erlong Zuoci pill can reduce the pathologic lesions of mice with presbycusis, protect from the damage caused by oxygen free radicals. The Erlong Zuoci pill could decrease PKC content and thus paly a regulatory role in the function of cAMP/PKC.

Keywords:Erlong Zuoci pill; SOD, MDA and PKC; presbycusis; experimental study; mice

收稿日期：（本文編輯：楊杰本文校對：王哲2015-10-13）

*通訊作者：wangzhe5655@163.com

基金項目：※遼寧省科學(xué)技術(shù)基金（No：2014020053）

doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2016.01.072

文章編號：1672-2779（2016）-01-0136-03