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      納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)γ-聚谷氨酸液體發(fā)酵中試研究

      2016-03-01 03:38:20陳衛(wèi)鋒劉成更李文孝
      農(nóng)產(chǎn)品加工 2016年24期
      關(guān)鍵詞:酵母粉發(fā)酵罐溶氧

      陳衛(wèi)鋒,秦 濤,劉成更,李文孝,馬 齊

      (1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所,陜西西安 710600;2.西北生物農(nóng)業(yè)中心,陜西西安 710043)

      納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)γ-聚谷氨酸液體發(fā)酵中試研究

      陳衛(wèi)鋒1,秦 濤1,劉成更1,李文孝1,馬 齊2

      (1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所,陜西西安 710600;2.西北生物農(nóng)業(yè)中心,陜西西安 710043)

      以納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)HSF1410為發(fā)酵菌株,在前期發(fā)酵條件基礎(chǔ)上,利用10 L發(fā)酵罐優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和供氧條件,再進(jìn)行500 L發(fā)酵罐中試試驗(yàn),中試γ-聚谷氨酸最高產(chǎn)量達(dá)32.4 g/L。

      γ-聚谷氨酸;發(fā)酵;中試生產(chǎn)

      γ-聚谷氨酸(Poly γ-glutamic acid,γ-PGA)是由D-谷氨酸和L-谷氨酸單體以酰胺鍵形式縮合而成的一種氨基酸聚合物。γ-PGA具有可降解性、成膜性、保濕性、可食性等特點(diǎn),在醫(yī)藥、環(huán)保、食品、化妝品及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。

      γ-PGA可以通過化學(xué)合成[4]、天然產(chǎn)物提取以及微生物發(fā)酵而得,微生物發(fā)酵法[5]與前2種方法相比,不僅生產(chǎn)成本低,而且生產(chǎn)過程污染小,適合大規(guī)模生產(chǎn),因此采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)聚谷氨酸成為目前研究方向的主流,現(xiàn)在絕大多數(shù)γ-PGA產(chǎn)品由利用芽孢桿菌[6]發(fā)酵、提取分離得到。

      試驗(yàn)以納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)HSF1410為生產(chǎn)菌株,在搖瓶發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件及10 L發(fā)酵罐小試的基礎(chǔ)上,進(jìn)行500 L發(fā)酵罐中試研究,確定其最適發(fā)酵工藝參數(shù)。

      1 試驗(yàn)材料和方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)HSF1410,由陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院提供;葡萄糖、酵母粉、K2HPO4,NH4Cl,MgSO4,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

      GRJB-10D型10 L發(fā)酵罐,鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司產(chǎn)品;500 L發(fā)酵罐,陜西美樂設(shè)備有限公司產(chǎn)品;UV-2802SH型紫外可見分光光度計(jì),上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品;NDJ-5型黏度測(cè)定儀,北京東西器材有限公司產(chǎn)品;S1100型高效液相色譜儀,美國Agilent公司產(chǎn)品。

      (1)液體種子培養(yǎng)基。液體LB培養(yǎng)基,pH值7.0,于121℃條件下蒸汽滅菌20 min。

      (2)原發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖30 g/L,NH4Cl 4 g/L,L-谷氨酸鈉15 g/L,酵母粉1 g/L,K2HPO43 g/L,MgSO40.2 g/L,無水 CaCl20.2 g/L,pH值 7.0,于121℃下蒸汽滅菌20 min。

      (3)優(yōu)化培養(yǎng)基。用玉米淀粉經(jīng)液化和糖化部分替代原發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖,用玉米漿部分替代酵母粉,滅菌同原發(fā)酵培養(yǎng)基。

      1.2 試驗(yàn)方法

      1.2.1 10 L發(fā)酵罐液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

      (1)滅菌。采用高壓蒸汽滅菌,滅菌溫度121℃,滅菌時(shí)間20 min。

      (2)接種。用氨水調(diào)節(jié)pH值至6.8左右,接入菌種,再調(diào)節(jié)pH值至7.0,接種量約為1%。

      (3)培養(yǎng)。發(fā)酵溫度28℃,風(fēng)量1∶0.5,壓強(qiáng)0.05 MPa,pH值7.0,發(fā)酵時(shí)間2 h,光密度0.35~0.50,可轉(zhuǎn)入發(fā)酵。

      將納豆芽孢桿菌HSF1410接種于液體LB搖瓶種子培養(yǎng)基中,以轉(zhuǎn)速160 r/min,溫度37℃搖床培養(yǎng)18 h,即為種子液。按照2%的接種量接種至10 L發(fā)酵罐中,發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為55%,通氣量為2 vvm,對(duì)發(fā)酵過程中的溫度、轉(zhuǎn)速及補(bǔ)料方式進(jìn)行優(yōu)化。整個(gè)發(fā)酵過程中,每4 h取1次樣,檢測(cè)發(fā)酵液中菌體生物量、聚谷氨酸合成酶活力、γ-PGA含量,以此確定最優(yōu)的10 L罐發(fā)酵工藝。

      1.2.2 500 L發(fā)酵罐液體發(fā)酵方法

      (1)滅菌。采用高壓蒸汽滅菌,滅菌溫度121℃,滅菌時(shí)間20 min。

      (2)接種。用氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0左右,接種量約為2%。

      (3)培養(yǎng)。發(fā)酵溫度37℃,通風(fēng)量、罐壓和攪拌轉(zhuǎn)速根據(jù)溶氧的要求調(diào)節(jié)溶氧水平。補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí),當(dāng)殘?zhí)呛康陀?0 g/L時(shí)補(bǔ)充糖液,以維持殘?zhí)呛繛?0~20 g/L,發(fā)酵過程中每隔4 h取樣進(jìn)行各種參數(shù)測(cè)定。

      1.2.3 分析方法

      (1)細(xì)胞生長測(cè)定。采用比濁法,以發(fā)酵培養(yǎng)基作為參比溶液,于波長600 nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光度(OD600)。

      (2)發(fā)酵液中γ-PGA含量的檢測(cè)[7]。按照γ-PGA的凝膠滲透色譜(GPC)檢測(cè)方法分析各編號(hào)菌株發(fā)酵液中產(chǎn)物的濃度;采用GPC法,將發(fā)酵液稀釋25倍后過0.22 μm濾膜去除菌體,用1100Series型高效液相色譜儀進(jìn)行分析;TSK-gelG5000PWxl-CP型色譜柱,10 μm,7.8 mm×30 mm(TOSOH,日本);流動(dòng)相:0.015 mol/L Na2HPO4-KH2PO4,0.15 mol/L NaCl溶液,pH值7.0;流速0.4 mL/min;檢測(cè)波長220 nm;γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品(Vedan,中國臺(tái)灣)。

      (3)殘?zhí)菧y(cè)定。采用改良裴林氏法[8]。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

      2.1.1 玉米淀粉添加量的優(yōu)化

      在前期搖瓶液化發(fā)酵得出發(fā)酵培養(yǎng)基配方確定葡萄糖濃度25 g/L,試驗(yàn)采用玉米淀粉部分替代葡萄糖進(jìn)行10 L發(fā)酵罐試驗(yàn)。玉米淀粉按液化酶和糖化酶的使用說明經(jīng)過酶水解,玉米淀粉與葡萄糖質(zhì)量總計(jì)為20 g/L,玉米淀粉與葡萄糖按一定比例添加,按照接種量2%,發(fā)酵溫度37℃,發(fā)酵pH值7.0,通過分批次調(diào)節(jié)通風(fēng)量、罐壓和攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧控制在20%~25%,發(fā)酵52~54 h,測(cè)殘?zhí)呛亢挺?PGA產(chǎn)量。

      玉米淀粉添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖1。

      圖1 玉米淀粉添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

      由圖1可知,隨著玉米淀粉添加量的增大,γ-PGA產(chǎn)量明顯減少。在玉米淀粉與葡萄糖添加比例在0.25時(shí),γ-PGA產(chǎn)量降低不明顯,說明此發(fā)酵可以部分利用玉米淀粉水解的糖作為碳源。

      玉米淀粉添加量對(duì)底物轉(zhuǎn)化率的影響見表1。

      表1 玉米淀粉添加量對(duì)底物轉(zhuǎn)化率的影響

      玉米淀粉水解后,在發(fā)酵液中也是葡萄糖,底物轉(zhuǎn)化率是指γ-PGA的合成量與玉米淀粉和葡萄糖之合的比值。由表1可知,隨著玉米淀粉添加比例提高,糖的底物轉(zhuǎn)化率也隨之下降,但是在玉米淀粉添加量為0.25 g時(shí)轉(zhuǎn)化率下降不明顯。更進(jìn)一步證明,玉米淀粉可以部分替代葡萄糖作為碳源。

      2.1.2 玉米漿添加量的確定

      搖瓶發(fā)酵得出發(fā)酵培養(yǎng)基配方確定酵母粉2 g/L,試驗(yàn)采用玉米漿部分替代酵母粉進(jìn)行10 L發(fā)酵罐試驗(yàn)。玉米漿與酵母粉按一定比例添加,接種量2%,發(fā)酵溫度37℃,發(fā)酵pH值7.0,通過分批次調(diào)節(jié)通風(fēng)量、罐壓和攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧控制在20%~25%,發(fā)酵52~54 h,測(cè)γ-PGA產(chǎn)量。

      玉米漿添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖2。

      圖2 玉米漿添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

      由圖2可知,隨著玉米漿添加量的增大,γ-PGA產(chǎn)量明顯減少。在玉米漿與酵母粉添加比例為0.5時(shí),γ-PGA產(chǎn)量降低不明顯,說明此發(fā)酵可以部分利用玉米漿替代酵母粉。

      2.2 分批控制溶氧10 L罐小試

      在已經(jīng)確定的各項(xiàng)發(fā)酵參數(shù)條件下,在10 L發(fā)酵罐上進(jìn)行溶氧控制的研究,分別調(diào)節(jié)通氣量、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速,分階段控制溶氧參數(shù)。在延滯期(0~6 h)控制20%溶氧,在對(duì)數(shù)生長期(6~20 h)控制45%溶氧,進(jìn)入穩(wěn)定期(20 h以后) 控制20%溶氧。

      分段控制溶氧與恒定溶氧對(duì)生物量的影響見圖3。

      圖3 分段控制溶氧與恒定溶氧對(duì)生物量的影響

      由圖3可知,分段控制溶氧明顯能提升發(fā)酵液生物量,菌種生長總體水平有較大幅度提高。

      2.3 500 L發(fā)酵中試

      分段控制溶氧與恒定溶氧對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖4。

      圖4 分段控制溶氧與恒定溶氧對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響

      由圖4可知,分段控制溶氧提高了γ-PGA的產(chǎn)量。

      2.3 500 L罐中試放大

      為了評(píng)價(jià)10 L罐發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性和可行性,在500 L罐中對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行放大試驗(yàn)。

      500 L中試發(fā)酵試驗(yàn)見表2。

      500 L罐中試產(chǎn)量在49~51 h達(dá)到最大,分別32.4,30.6,29.6 g/L,第3批次相對(duì)前2批次在接種時(shí)間上稍推遲,使得菌齡增長,但是仍未出對(duì)數(shù)生長期,導(dǎo)致菌種的生物量也相對(duì)前2批次增高,但

      表2 500 L中試發(fā)酵試驗(yàn)

      [1]Bhatt R,De Vries P,Tulinsky J,et al.Synthesis and in vivo antitumor activity of poly(L-glutamic acid) conjugates of 20S-camptothecin[J].Journal of Medicinal Chemistry,2003,46(1):190-193.

      [2]Sun M H,Park C,Kim C J,et al.Natural and ediblebiopolymer poly γ-glutamic acid:synthesis,production,and applications[J].The Chemical Record,2005(6):352-366.

      [3]鞠蕾,馬霞.γ-聚谷氨酸的應(yīng)用進(jìn)展 [J].中國釀造,2011(9):1-4.

      [4]曹名鋒,金映虹,解慧,等.聚谷氨酸的微生物合成、相關(guān)基因及應(yīng)用展望 [J].微生物學(xué)通報(bào),2011,38(3):388-395.

      [5]Yokoigawa K,Sato M,Soda K.Simple improvement in是在同樣的發(fā)酵條件下,最終γ-PGA產(chǎn)量減少,這說明菌種過度生長會(huì)對(duì)代謝產(chǎn)物累積量有影響。

      500 L中試放大,γ-PGA累積量3批次平均值為30.5 g/L,相對(duì)于10 L罐γ-PGA平均產(chǎn)量25.8 g/L提高了18.2%,這可能是由于擴(kuò)大發(fā)酵體積提高了發(fā)酵液的傳質(zhì)效率,從而改善了微生物的生長環(huán)境,使得代謝物累積量增設(shè)。

      3 結(jié)論

      (1)在發(fā)酵過程中,用葡萄糖質(zhì)量25%的玉米淀粉可以部分替代葡萄糖,用酵母粉質(zhì)量50%的玉米漿可以部分替代酵母粉,這樣產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)可以相對(duì)控制成本。

      (2)在發(fā)酵過程中采用分段控氧的供氧工藝,即通過分別調(diào)節(jié)通氣量、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速,分階段控制溶氧參數(shù),在延滯期(0~6 h) 控制為20%溶氧,在對(duì)數(shù)生長期(6~20 h)控制為45%溶氧,進(jìn)入穩(wěn)定期(20 h以后)控制為20%溶氧,可以有效地提高γ-PGA發(fā)酵累積量。

      (3)將10 L罐發(fā)酵工藝放大到500 L罐,發(fā)酵結(jié)果代謝產(chǎn)物量明顯提升,證明了發(fā)酵工藝穩(wěn)定可行,為γ-PGA的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。目前,尚無報(bào)道中試或產(chǎn)業(yè)化為γ-PGA發(fā)酵工藝,試驗(yàn)的發(fā)酵水平達(dá)到了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)水平,具有良好的工業(yè)化前景。

      freeze-tolerance of bakers'yeast with poly γ-glutamate[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2006(3):215-219.

      [6]程艷玲,趙玉娥,王海玉.生物降解型聚谷氨酸的研究進(jìn)展 [J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008(2):45-49.

      [7]呂瑩,郝紫徽,李虹.γ-聚谷氨酸的分離提純 [J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(2):133-134.

      [8]梁金鐘,王風(fēng)青.微生物發(fā)酵法合成高分子聚合物 γ-PGA的研究 [J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,29(1):24-29.◇

      Pilot Scale Fermentation of γ-Poly Glutamic Acidby Bacillus Subtilis Natto HSF1410

      CHEN Weifeng1,QIN Tao1,LIU Chenggeng1,LI Wenxiao1,MA Qi2
      (1.Enzyme Engineering Research Institute of Shaanxi Academy of Sciences,Xi'an,Shaanxi 710600,China;
      2.Nerthwest Bio-agriculture Ceuter,Xi'an,Shaanxi 710043,China)

      Bacillus subtilis natto HSF1410 is taken as start strains for fermentation,on the basis of the early stage of the fermentation conditions,10 L fermentation tank is used to optimize the fermentation culture medium and oxygen supply conditions,then pilot production of poly γ-glutamic acid is carried out use 500 L fermentation tank,pilot γ-PGA maximum yield of 32.4 g/L.

      γ-PGA;fermentation;pilot production

      TQ922.1

      A

      10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2016.12.031

      1671-9646(2016)12b-0018-03

      2016-10-12

      陜西省科學(xué)院基礎(chǔ)應(yīng)用項(xiàng)目支持(2011K-13);陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目支持(2011K02-03)。

      陳衛(wèi)鋒(1971— ),男,本科,助理研究員,研究方向?yàn)槲⑸锞N選育及發(fā)酵工程。

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