李淑珍 武飛 陳月林 楊穎

【摘要】目的：對沙棘葉總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化。方法：采用溶劑浸提法提取沙棘葉總黃酮，利用分光光度法測定總黃酮的含量，正交試驗進行優(yōu)化。結果：取7月份沙棘葉粉碎物，過35目篩，經正交實驗優(yōu)化后的提供工藝為：用60%的乙醇作溶劑，固液比為1∶20，在80℃提取30min，用此方法100g葉粉碎物經提取可得8.71g粗制品，總黃酮提取率達0.14%。結論：上述工藝操作簡單、方法可靠，產品得率高，提取性能較好，適合于沙棘總黃酮大規(guī)模提取。

【關鍵詞】沙棘葉；總黃酮；提取工藝；正交試驗

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）01-0014-03

沙棘（Hippophe rhamnoids L.）屬胡頹子科沙棘屬植物，又名醋柳，被國際醫(yī)藥學家和營養(yǎng)學家譽為人類21世紀最具發(fā)展前途的醫(yī)藥及營養(yǎng)保健植物。其根、莖、葉、果實等都含有維生素、黃酮類化合物和豐富的礦物質元素等，為藥食同源植物，并廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多個領域[1]。沙棘1977年收載于《中華人民共和國藥典》，所含的黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、降血糖、保護心血管等多種生物活性[2-3]。內蒙古沙棘資源具有分布廣、種植面積大、果實質量高等特點，對沙棘產業(yè)的發(fā)展十分有利。且沙棘作為防護林發(fā)揮著巨大作用，種植面積也逐年增加。而沙棘果實黃酮的開發(fā)已經報道很多[4-5]，從葉中提取黃酮類化合物也具有原料來源廣泛、成本低廉的優(yōu)勢[6]。研究從沙棘葉提取黃酮，旨在篩選適合沙棘葉黃酮的提取工藝，獲取高含量的總黃酮，促進沙棘資源的綜合利用。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 722可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；RE-52旋轉真空蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；101-2型數顯電熱鼓風恒溫干燥箱（上海陽光實驗儀器有限公司）。

1.2 材料 沙棘葉采于內蒙古烏蘭察布市（集寧區(qū)）卓資縣郊野，經楊鴻飛教授鑒定沙棘（Hippophe rhamnoids L.）的葉。并將其充分粉碎，過35目篩，置于干燥器中備用。蘆丁對照品（批號：100080-201407，中國藥品生物制品檢定所）。其他試劑均為分析純。

2 方法及結果

2.1 沙棘葉總黃酮含量的測定

2.1.1 標準曲線的制作 準確稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標準品20mg，用70%的乙醇溶解并定容至100ml，使其濃度為200μg/ml。分別取10、15、20、25、30、35、40、45ml，用70%的乙醇定容50ml，即為40、60、80、100、120、140、160、180μg/ml的蘆丁溶液。各取1ml于試管中，加70%的乙醇1ml，加入0.5ml 5%的NaNO2，混勻后放置6min；然后加入0.5ml 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6min；最后再加入6ml 4%NaOH，放置15min，在510nm處測定不同濃度標準品的吸光值（亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法）。以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。得回歸方程：Y=477.38X-2.261（R=0.9979），結果表明蘆丁在0～120μg/ml濃度范圍內呈良好線性關系。

2.1.2 樣品中黃酮含量的測定 取一定量的沙棘葉黃酮樣品，配制成樣液。再取一定量總黃酮樣液，定容至某一體積。各取1ml于試管中，采用“2.1.1”項比色法測定吸光值，計算總黃酮含量。

X=Y×V×n×100%/m。

式中，X為樣品中總黃酮含量，Y為樣液中總黃酮濃度（mg/mL），由回歸方程可算得；V為樣液體積（mL）；n為稀釋倍數；m為樣品量（mg）[7]。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 取8份過35目篩的6月份沙棘葉粉碎物各1g，分別加入甲醇、乙醇、水、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇10ml，在70℃水浴加熱提取10min，過濾。用70%乙醇統一定容到50ml，各取1ml于試管中，采用2.1.1項比色法測定吸光值，計算提取率。同樣方法做3次平行試驗，確定提取的最佳溶劑，結果見圖1。

由圖1可知，沙棘總黃酮在甲醇、乙醇、水等極性溶劑中溶解度大，提取率高；在氯仿、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等溶劑中溶解度小，提取率低。在所測溶劑中，甲醇最好，但甲醇有毒，給操作帶來不便。由于乙醇具有、無異味、無殘留、安全性好等優(yōu)點，且容易回收，故選用乙醇為提取溶劑。

2.2.2 提取原材料的選擇 取5份過35目篩的5～9月份沙棘的葉粉碎樣品各10g，加入50%乙醇150ml，在70℃水浴加熱提取30min，過濾，蒸發(fā)乙醇，用50%乙醇定容到100ml，稀釋取5ml定容到50ml的容量瓶中，取1ml于試管中，測定吸光值，計算總黃酮含量，選擇最佳提取原材料。

黃酮化合物是植物生理過程中的次生代謝產物，這些物質的往往受到植物發(fā)育階段酶的調節(jié)和遺傳機制的控制。不同發(fā)育階段黃酮化合物含量不同。由圖2可知，5月份日照時間長，植物正處在生長的旺盛階段，故5月份黃酮含量高；隨后植物生長變緩，合成量減少或轉化為其他物質，故含量下降。但西北地區(qū)5月份葉子處于發(fā)芽階段，產量低，不宜選用。7月葉子已經長成，也未結果，又出現了黃酮含量的高峰，不宜用7月份葉作為實驗原材料。

2.2.3 多因素正交試驗 在單因素篩選的基礎上，設計多因素試驗表，見表1。取7月份葉粉碎樣品1g，按照下列正交試驗條件進行提取、過濾，用70%乙醇統一定容至30ml。各取1ml于試管中，測定吸光值，計算總黃酮含量，確定優(yōu)化后的提取條件。

多因素正交試驗結果見表1，直觀分析得出：葉中提取總黃酮的影響因素的順序是：C>B>A>D，即提取溫度>固液比>乙醇濃度>提取時間，優(yōu)化組合后的提取因素的選擇為A2B2C3D1。方差分析的結果見表2，影響提取沙棘總黃酮各因素均為極顯著因子（P<0.01）。綜合考慮最佳的提取條件為A2B2C3D1，即取7月份葉，用60%的乙醇作溶劑，固液比為1∶20，在80℃提取30min，提取效果較好。

2.3 沙棘總黃酮的得率和含量測定 準確稱量沙棘7月份葉粉碎物100g，按上述確定的優(yōu)化提取條件進行浸提，將浸提液在60℃減壓濃縮回收乙醇，將濃縮液在60℃的干燥箱干燥，稱量干燥粗制品的質量，得到粗黃酮產品得率。從中取1g用70%的乙醇溶液溶解，稀釋一定倍數，取1ml測定粗制品總黃酮含量，結果見表3。

由表4可知，100g葉粉碎樣品經此提取條件提取，可得到8.71g粗黃酮產品，葉粗制品黃酮含量達0.14%，并且RSD為0.68%，純化后總黃酮含量達到14.89%，表明該工藝重復性強，穩(wěn)定可靠，精密度高。

3 討論

內蒙古沙棘資源具有分布廣、種植面積大、果實質量高等特點，對沙棘產業(yè)的發(fā)展十分有利[8]。且沙棘作為防護林發(fā)揮著巨大作用，種植面積也逐年增加。有研究發(fā)現沙棘所含總黃酮為葉子（876mg/100g）>果渣（502mg/100g）>鮮果汁（365mg/100g）>鮮漿果（354mg/100g），說明從葉中提取黃酮具有重要意義[9]。對于從沙棘中提取總黃酮的方法，目前有超臨界CO2流體提取、微波法提取、超聲波法提取、有機溶劑提取、水浸提取等。超臨界CO2萃取適用于非極性化合物的分離；微波法和超聲波法提取僅限于少量提取實驗，工業(yè)化大生產不宜應用。水浸提取沙棘總黃酮提取率偏低；有機溶劑提取中甲醇和丙酮含有毒成分，因此用乙醇提取沙棘黃酮是適合工業(yè)化生產的適宜方法[10]。該方法經實驗優(yōu)化，60%乙醇作為提取溶劑，提取30min，既節(jié)約時間，且乙醇還可以重復利用，無毒害無殘留，適合工業(yè)化擴大生產。經優(yōu)化工藝提取后所得葉黃酮得率為8.71%，相對較高，但黃酮含量（0.14%）較呂敏[11]采用正交試驗法優(yōu)選提取山西沙棘Hippophe rhamnoids L.葉總黃酮含量（4.82%）較低，這可能與不同品種的沙棘黃酮含量不同有關。王亞輝等[12]對內蒙古不同產區(qū)同一品種沙棘黃酮含量研究發(fā)現：內蒙古和林格爾縣（2.5±0.07）%>內蒙古涼城縣（2.3±0.02）%>內蒙古東勝區(qū)（2.2±0.08）%>內蒙古翁牛特旗（1.8±0.01）%>內蒙古敖漢旗（1.7±0.09）%>內蒙古集寧區(qū)（1.4±0.01）%。除集寧外，5個產區(qū)的總黃酮含量均達到《中國藥典》標準（1.5%）。實驗選用沙棘品種恰好來自集寧區(qū)卓資山縣，提取原材料并非5月份含量最高季節(jié)采收，而是產量較高的7月份采收，原料只提取1次，而呂敏實驗提取三次，所以該實驗黃酮含量相對較低。與其他研究結果比較[13-15]，產品得率較高，并且該提取工藝操作簡單、乙醇無殘留可重復利用，適合于沙棘總黃酮的提取，可進行規(guī)?；a。

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（收稿日期：2015.09.23）