吳龍龍 申鳳俊

NOX4與肝纖維化關系的研究進展

吳龍龍 申鳳俊

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)是一種由多種蛋白質亞基組成的復合體，其能生成消除病原微生物的活性氧簇(ROS)?，F已證實NOX介導的氧化應激反應與肝纖維化的發(fā)生密切相關，而NOX的亞基NOX4則起到了關鍵作用，它對引起肝纖維化的主要細胞——肝星狀細胞(HSC)具有顯著的活化效應，并可通過介導多種細胞內外的信號轉導通路，參與HSC的持續(xù)激活以及肝細胞的增殖、凋亡等過程，最終導致肝纖維化的發(fā)生。

NADPH氧化酶4；氧化應激；細胞凋亡；肝纖維化

肝纖維化是由多種病因引起的急慢性肝臟損傷導致細胞外基質在肝組織間質過度沉積、降解減少而引起的一種病理改變。近年來的研究表明，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)通過產生活性氧簇(ROS)介導的氧化應激反應在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用?，F已證實NOX的多種亞基如NOX1、NOX2及NOX4等在實驗性肝纖維化大鼠中表達增加，參與了肝纖維化過程[1]，而NOX4可能在其中起著更為重要的作用，其在活化的肝星狀細胞(HSC)中表達較前兩者更為豐富，并且可通過介導多條細胞信號通路，誘導HSC的持續(xù)激活[2-3]。此外，NOX4還可通過參與肝細胞的增殖、凋亡以及肌成纖維細胞的遷移等過程，促進纖維化的發(fā)展，這提示NOX4可能將成為肝纖維化新的治療靶點。本文就NOX4在肝纖維化中作用的研究進展作一綜述。

1 NOX家族與肝纖維化

NADPH氧化酶是一種由多種蛋白質亞基組成的復合體，已證實在多種組織細胞中都存在NOX的表達。生理情況下，NOX處于低度表達、低活性狀態(tài)，其生成ROS的水平較低，并且主要是作為第二信使參與細胞增殖、分化等生物調節(jié)[4]。而肝臟在受到病毒等損傷因素刺激時，包括肝細胞及HSC在內的NOX活化產生大量ROS，導致氧化應激的發(fā)生。近年來的研究發(fā)現，NOX激活產生ROS介導的氧化應激反應在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Bataller等[5]首先證實，HSC表面存在NOX1、NOX4等亞基以及p47phox等組件的表達，在HSC由靜止轉為活化時，它們的mRNA表達上調。在肝纖維化始動階段，NOX可調節(jié)HSC的激活及細胞凋亡，并參與調控HSC向肌成纖維細胞的轉化，以及血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、血小板生成素和轉化生長因子-β(TGF-β)等促纖維化因子作用下細胞的活化[6-7]。

NOX4作為NADPH氧化酶家族的重要成員，相較于其他NOX的同工酶有其獨特的特點，研究發(fā)現，NOX4可能在肝臟損傷及之后的纖維化過程中起著更為廣泛的作用。NOX4在肝細胞和HSC中高度表達，并且在活化的HSC中表達明顯增加。而在HCV感染者中，NOX4的上調比NOX2更為顯著，卻未能發(fā)現NOX1表達上的任何變化[8]。婁安妮等[9]發(fā)現在膽管結扎大鼠肝組織內，NOX4蛋白表達明顯升高，并與膽管結扎時間呈正相關，當手術解除膽管結扎后，NOX4蛋白的升高趨勢受到抑制。此外，Lan等[2]通過對比觀察長期的NOX1和NOX4缺乏對肝纖維化進程的影響，發(fā)現兩者通過促進脂質過氧化、HSC增殖等在肝纖維化中扮演重要角色，并且NOX4顯示了更強的促HSC活化作用，而NOX1和NOX4的共同抑制劑GKT137831則可減弱上述效應[10]。以上結果表明，NOX4介導的氧化應激參與了肝臟的損傷和纖維化等病理過程。

2 NOX4通過TGF-β/Smad通路介導肝纖維化

TGF-β是肝纖維化重要的始動因子，可通過TGF-β/Smad信號通路激活HSC，刺激包括Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型膠原蛋白等的合成與沉積。大量研究表明，NOX4的促纖維化反應受TGF-β的介導，其在TGF-β誘導的纖維化反應中具有促進膠原蛋白產生等重要作用[11-12]。有實驗對NOX4缺乏的HSC進行研究，發(fā)現TGF-β1介導的HSC的活化需要依賴NOX4產生ROS[13]。而Lee等[14]發(fā)現，保肝藥物三白草酮可通過抑制自噬作用及NOX4介導的氧化應激作用，減弱TGF-β/Smad3通路誘導的纖維化及HSC的活化。

Boudreau等[15]采用丙型肝炎病毒(HCV)感染肝細胞，發(fā)現結構性的HCV核心蛋白誘導了NOX4的高水平表達以及NOX4依賴的ROS的產生，這個效應可以被TGF-β中和性抗體或占據優(yōu)勢的TGF-β負性受體弱化，表明HCV以自分泌的TGF-β所依賴的方式調控了NOX4的表達。蔡雙明[16]發(fā)現，Ang(1～7)能夠抑制AngⅡ對HSC-T6細胞的NOX4及抗氧化因子Nrf2、GCLC的誘導作用，該研究還表明AngⅡ可以誘導由NOX4介導的氧化應激，激活Smad3通路，促進HSC活化及膠原蛋白合成，因此認為Smad3與NOX4是上下游信號的關系。以往研究證實，在腎和肺的肌成纖維細胞中，NOX4是Smad3的下游因子[17]。而有研究發(fā)現，應用針對NOX4表達/活化的藥理性抑制劑可以阻止纖維化進程，但并不抑制TGF-β介導的其他有利效應[8]，如可通過抑制上皮細胞的生長而阻止腫瘤的始動階段等，因此NOX4同樣是TGF-β/Smad通路的一個重要的下游因子[18-19]。而且NOX4可以反饋形式調節(jié)TGF-β/Smad信號的促纖維化效應[20]。NOX4介導ROS的產生與TGF-β/Smad信號通路相關聯，是一條關鍵的促纖維化通路。

3 NOX4誘導細胞凋亡與肝纖維化

肝纖維化涉及多種細胞機制，NOX4除了介導HSC的活化，還可以通過誘導肝細胞凋亡發(fā)揮促纖維化作用。在肝臟中，除了AngⅡ等受體激動劑可以激活NOX外，肝細胞死亡后形成的凋亡小體被HSC吞噬后不僅可以刺激巨噬細胞生成TGF-β，還可以促進HSC的活化，導致Ⅰ型膠原蛋白表達上調[21]。Jiang等[18]發(fā)現，NOX4在死亡配體誘導的肝細胞凋亡中具有十分關鍵的作用，而敲除NOX4基因的肝細胞對FasL或腫瘤壞死因子-α/放線菌素D誘導的細胞凋亡更具有抵抗力。Tanaka等[22]通過觀察肝內微循環(huán)障礙引起缺氧導致的肝細胞凋亡帶，發(fā)現大部分凋亡肝細胞與NOX4共定位，并且凋亡帶中NOX4介導的氧化應激水平的增加可能促進了肝細胞凋亡的連續(xù)發(fā)生。同樣的，用TGF-β刺激敲除NOX4基因的肝細胞，可發(fā)現NOX的活化、細胞凋亡蛋白酶的激活均被減弱，表明NOX4介導了TGF-β誘導的細胞凋亡。以上研究表明，NOX4介導細胞凋亡促進了纖維化的發(fā)展，而抑制凋亡則減弱了肝臟的促纖維化應答。顏鳳[23]在對血管平滑肌細胞(HUVEC)的研究中發(fā)現，用TGF-β刺激HUVEC可以增加NOX4 mRNA的表達并上調NOX4蛋白的表達水平，而將腺病毒過表達NOX4后轉染內皮細胞，不僅抑制了內皮細胞的基礎凋亡反應，而且抑制了血清饑餓引起的內皮細胞凋亡。此外，內皮細胞中過表達NOX4后，再給予TGF-β刺激，并不能引起明顯的凋亡反應，這一結果提示過表達外源性NOX4可能具有抗內皮細胞凋亡的作用。

4 NOX4介導的其他促纖維化途徑

近期研究發(fā)現，NOX4誘導產生的ROS介導了內質網應激的發(fā)生，這種應激反應在體外或體內都可以提高HSC對凋亡的敏感性[24-25]。Kim等[26]發(fā)現，水飛薊賓可通過介導NOX4的產生，誘發(fā)線粒體ROS依賴的細胞凋亡，這一過程與Ca2+穩(wěn)態(tài)的破壞及伴發(fā)的內質網應激反應相關聯。在對心臟和腎的研究中發(fā)現，NOX4還可能通過介導內皮型一氧化氮合酶(eNOS)解偶聯，促進纖維化的發(fā)生。Lee等[27]的研究采用AngⅡ刺激腎小球系膜細胞，發(fā)現NOX4是過氧亞硝酸鹽依賴的eNOS解偶聯作用以及由此導致的一氧化氮(NO)生物利用度下降的重要中介，NOX4和線粒體ROS不僅是AngⅡ誘導的氧化應激反應的重要介質，而且導致了eNOS的功能障礙和系膜細胞的纖維化損傷。在對心臟的研究中也證實了eNOS 的脫偶聯可引起心肌肥厚和纖維化。關于eNOS解偶聯作用在肝纖維化過程中的作用尚需要進一步研究。

上述研究均證實了NOX4在肝纖維化中扮演著重要的角色，基于此，許多研究致力于探索新型的NOX4抑制劑，以期用于臨床上改善纖維化。有研究認為，TGF-β具有抑制生長和誘導凋亡的能力，是一種上皮細胞腫瘤抑制因素[28]。Crosas-Molist等[29]發(fā)現，NOX4可能對肝細胞癌的發(fā)生起保護作用，因為TGF-β誘導的腫瘤細胞的衰老是NOX4依賴性的。他們通過沉默肝癌細胞株中的NOX4基因，發(fā)現可以促進肝癌細胞的增殖，提示NOX4可能在肝臟中具有抑制腫瘤的功能，其主要證據如下：(1)在實驗大鼠模型中肝臟腫瘤的發(fā)生與NOX4的下調相關聯；(2)在人類肝癌細胞株中發(fā)現NOX4的表達處于低水平。

5 小結與展望

綜上所述，NOX4可通過多種途徑參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。它不僅可介導TGF-β/Smad信號通路，誘導HSC的持續(xù)活化，而且參與了TGF-β或凋亡配體誘導的肝細胞凋亡。此外，還需要關注NOX4可能在肝臟中起著抑制腫瘤的作用。肝纖維化往往會進展為肝硬化，而肝硬化是一種癌前狀態(tài)，有較大概率會發(fā)展為肝細胞癌，這種長期持續(xù)性的NOX4抑制是否會產生不利的后果仍需要更多的研究進行驗證，但也不能因此而否認NOX4作為新型抗纖維化治療靶點的重要意義。對NOX介導的氧化應激的調控機制作進一步的研究，將有助于臨床肝纖維化治療策略的改善。

1 Paik YH, Iwaisako K, Seki E, et al. The nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NOX) homologues NOX1 and NOX2/gp91(phox) mediate hepatic fibrosis in mice[J]. Hepatology, 2011, 53: 1730-1741.

2 Lan T, Kisseleva T, Brenner DA. Deficiency of NOX1 or NOX4 prevents liver inflammation and fibrosis in mice through inhibition of hepatic stellate cell activation[J]. PLoS One, 2015, 10: e0129743.

3 張新華, 朱萱. NOX通過ROS介導的信號通路與肝纖維化[J]. 國際消化病雜志, 2011, 31: 34-36.

4 Jha JC, Gray SP, Barit D, et al. Genetic targeting or pharmacologic inhibition of NADPH oxidase nox4 provides renoprotection in long-term diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2014, 25: 1237-1254.

5 Bataller R, Schwabe RF, Choi YH, et al. NADPH oxidase signal transduces angiotensinⅡ in hepatic stellate cells and is critical in hepatic fibrosis[J]. J Clin Invest, 2003, 112: 1383-1394.

6 Hecker L, Vittal R, Jones T, et al. NADPH oxidase-4 mediates myofibroblast activation and fibrogenic responses to lung injury[J]. Nat Med, 2009, 15: 1077-1081.

7 Liang S, Kisseleva T, Brenner DA. The role of NADPH oxidases (NOXs) in liver fibrosis and the activation of myofibroblasts[J]. Front Physiol, 2016, 7: 17.

8 Sancho P, Mainez J, Crosas-Molist E, et al. NADPH oxidase NOX4 mediates stellate cell activation and hepatocyte cell death during liver fibrosis development[J]. PLoS One, 2012, 7: e45285.

9 婁安妮, 潘春球, 李洋, 等. 膽管結扎與再通對大鼠肝內細胞表型和NOX4蛋白表達的影響[J]. 南方醫(yī)科大學學報, 2015, 35: 1457-1462.

10 Aoyama T, Paik YH, Watanabe S, et al. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase in experimental liver fibrosis: GKT137831 as a novel potential therapeutic agent[J]. Hepatology, 2012, 56: 2316-2327.

11 Tobar N, Toyos M, Urra C, et al. c-Jun N terminal kinase modulates NOX-4 derived ROS production and myofibroblasts differentiation in human breast stromal cells[J]. BMC Cancer, 2014, 14: 640.

12 Chan EC, Peshavariya HM, Liu GS, et al. Nox4 modulates collagen production stimulated by transforming growth factor β1invivoandinvitro[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 430: 918-925.

13 Carmona-Cuenca I, Roncero C, Sancho P, et al. Upregulation of the NADPH oxidase NOX4 by TGF-beta in hepatocytes is required for its pro-apoptotic activity[J]. J Hepatol, 2008, 49: 965-976.

14 Lee JH, Jang EJ, Seo HL, et al. Sauchinone attenuates liver fibrosis and hepatic stellate cell activation through TGF-β/Smad signaling pathway[J]. Chem Biol Interact, 2014, 224: 58-67.

15 Boudreau HE, Emerson SU, Korzeniowska A, et al. Hepatitis C virus (HCV) proteins induce NADPH oxidase 4 expression in a transforming growth factor beta-dependent manner: a new contributor to HCV-induced oxidative stress[J]. J Virol, 2009, 83: 12934-12946.

16 蔡雙明. 血管緊張素Ⅱ/血管緊張素1-7通過調節(jié)氧化/抗氧化平衡影響肝纖維化的作用及機制[D]. 廣州: 南方醫(yī)科大學, 2014.

17 Carnesecchi S, Deffert C, Donati Y, et al. A key role for NOX4 in epithelial cell death during development of lung fibrosis[J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 15: 607-619.

18 Jiang JX, Chen X, Serizawa N, et al. Liver fibrosis and hepatocyte apoptosis are attenuated by GKT137831, a novel NOX4/NOX1 inhibitorinvivo[J]. Free Radic Bio Med, 2012, 53: 289-296.

19 Samarakoon R, Overstreet JM, Higgins PJ. TGF-β signaling in tissue fibrosis: Redox controls, target genes and therapeutic opportunities[J]. Cell Signal, 2013, 25: 264-268.

20 Jiang F, Liu GS, Dusting GJ. NADPH oxidase-dependent redox signaling in TGF-β-mediated fibrotic responses[J]. Redox Biol, 2014, 2: 267-272.

21 Yu JH, Zhu BM, Riedlinger G, et al. The liver-specific tumor suppressor STAT5 controls expression of the reactive oxygen species-generating enzyme NOX4 and the proapoptotic proteins PUMA and BIM in mice[J]. Hepatology, 2012, 56: 2375-2386.

22 Tanaka M, Tanaka K, Masaki Y,et al. Intrahepatic microcirculatory disorder, parenchymal hypoxia and NOX4 upregulation result in zonal differences in hepatocyte apoptosis following lipopolysaccharide- and D-galactosamine-induced acute liver failure in rats[J]. Int J Mol Med, 2014, 33: 254-262.

23 顏鳳. Nox4型NADPH氧化酶在TGF-β調節(jié)內皮細胞凋亡和表型分化中的作用及機制[D]. 濟南: 山東大學, 2014.

24 De Minicis S, Candelaresi C, Agostinelli L, et al. Endoplasmic Reticulum stress induces hepatic stellate cell apoptosis and contributes to fibrosis resolution[J]. Liver Int, 2012, 32: 1574-1584.

25 Wang X, Shi Q, Xu K, et al. Familial CJD associated PrP mutants within transmembrane region induced CTM-PrP retention in ER and Triggered apoptosis by ER stress in SH-SY5Y cells[J]. PLoS One, 2011, 6: e14602.

26 Kim SH, Kim KY, Yu SN, et al. Silibinin induces mitochondrial NOX4-mediated endoplasmic reticulum stress response and its subsequent apoptosis[J]. BMC Cancer, 2016, 16: 452.

27 Lee DY, Wanquier F, Eid AA, et al. Nox4 NADPH oxidase mediates peroxynitrite-dependent uncoupling of endothelial nitric-oxide synthase and fibronectin expression in response to angiotensin Ⅱ: role of mitochondrial reactive oxygen species[J]. J Biol Chem, 2013, 288: 28668-28686.

28 Senturk S, Mumcuoglu M, Gursoy-Yuzugullu O, et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth[J]. Hepatology, 2010, 52: 966-974.

29 Crosas-Molist E, Bertran E, Sancho P, et al. The NADPH oxidase NOX4 inhibits hepatocyte proliferation and liver cancer progression[J]. Free Radic Biol Med, 2014, 69: 338-347.

(本文編輯：周駿)

030001 太原，山西醫(yī)科大學(吳龍龍)；030001 太原，山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院消化內科(申鳳俊)

申鳳俊，Email: 919016603@qq.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.06.003

2016-5-30)