沈斐斐　陸倫根

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膽汁淤積中多耐藥相關(guān)蛋白作用

沈斐斐陸倫根

膽汁主要由肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其形成機(jī)制十分復(fù)雜。在整個機(jī)制中最為關(guān)鍵的步驟就是頂端或毛細(xì)膽管膜上將膽鹽、有機(jī)物質(zhì)等大量溶質(zhì)排入毛細(xì)膽管形成原始膽汁流的過程。這一步驟主要由具有ATP結(jié)合域的盒式跨膜轉(zhuǎn)運蛋白(ABC轉(zhuǎn)運蛋白)介導(dǎo)，毛細(xì)膽管膽汁酸鹽輸出泵(BSEP)和多耐藥相關(guān)蛋白(MRP2)均屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族，其中BSEP負(fù)責(zé)膽汁鹽排出，通過水解ATP，跨膜轉(zhuǎn)運結(jié)合膽汁酸鹽，形成毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁酸依賴性膽汁流；MRP2負(fù)責(zé)介導(dǎo)其他有機(jī)陰離子(包括膽紅素)進(jìn)入膽汁，參與肝細(xì)胞的多種毒性復(fù)合物的轉(zhuǎn)運，是非膽汁依賴性膽汁流形成的重要因素。在轉(zhuǎn)運過程中，毛細(xì)膽管膜上膽汁酸鹽和其他有機(jī)離子等大量溶質(zhì)的排入使得毛細(xì)膽管內(nèi)滲透壓升高，從而形成膽汁流?；谀懼鞯男纬蓹C(jī)制，以及膽汁流中的主要溶質(zhì)-膽汁酸鹽具有高度的細(xì)胞毒性，肝細(xì)胞中膽汁的排出過程需要精細(xì)調(diào)節(jié)。但在(梗阻性)膽汁淤積情況下，上述過程調(diào)節(jié)的缺失會使膽汁鹽積聚，繼而引起肝細(xì)胞內(nèi)壓力增高、細(xì)胞裂解，從而導(dǎo)致了嚴(yán)重的肝臟損傷。

一、生理與膽汁淤積條件下MRP2的分布與定位

膽汁淤積是指肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞水平上的膽汁生成障礙、膽汁分泌障礙和/或流動障礙導(dǎo)致膽汁無法正常流入十二指腸，從而反流進(jìn)入血液循環(huán)中。其發(fā)生與多種因素相關(guān)，毛細(xì)膽管膜中轉(zhuǎn)運蛋白活性的下降和基底外側(cè)細(xì)胞膜中其他轉(zhuǎn)運蛋白活性的增加是目前公認(rèn)的引起膽汁淤積發(fā)生的機(jī)制之一。肝竇基底外側(cè)膜和毛細(xì)膽管膜的這種改變有助于阻止毛細(xì)膽管內(nèi)的滲透壓過高、降低肝臟損傷的發(fā)生以及防止膽汁反流進(jìn)入血液中。多耐藥相關(guān)蛋白亞家族最初發(fā)現(xiàn)于1992年，目前已知的成員有9個，分別為MRP1-7、ABCC11-12[1]。MRP2是第二個被發(fā)現(xiàn)的亞家族成員，可定位于肝細(xì)胞的毛細(xì)膽管膜側(cè)面、腎近端小管細(xì)胞管腔膜側(cè)、小腸的黏膜上皮側(cè)、以及膽囊上皮細(xì)胞等極性細(xì)胞的頂膜。主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運其他有機(jī)陰離子(包括膽紅素)進(jìn)入膽汁，并參與肝細(xì)胞的多種毒性復(fù)合物的轉(zhuǎn)運，保護(hù)機(jī)體和肝細(xì)胞避免毒性物質(zhì)的損傷。MRP2介導(dǎo)很多陰離子的毛細(xì)膽管排泄，這些陰離子大都是二價的兩性分子，且隨著肝(實質(zhì))細(xì)胞Ⅱ相結(jié)合中產(chǎn)生的谷胱甘肽、葡萄糖醛酸和硫酸鹽的變化而變化(如膽紅素二葡萄糖苷酸)。GSH的毛細(xì)膽管排泄也由MRP2介導(dǎo)。帶有兩個負(fù)電荷的二價膽汁酸鹽如?；撬猁}和葡萄糖石膽酸鹽是由MRP2介導(dǎo)的，然而MRP2卻對一價膽汁酸鹽無作用。不過，個別氨基酸的突變會使MRP2具有轉(zhuǎn)運一價膽汁酸鹽的能力。其他MRP的異構(gòu)形式如MRP1和MRP3存在于基質(zhì)膜，MRP2功能損壞發(fā)生膽汁淤積時，它們可起代償作用。小鼠的MRP2基因位于染色體19D2上，19D2與膽石癥易感性相關(guān)。人類MRP2基因位于染色體10q24上，MRP2基因突變會導(dǎo)致Dubin-Johnson綜合征，這種綜合征以內(nèi)源性和外源性兩性化合物的毛細(xì)膽管排泄障礙為特征。這種在大鼠模型及人類基因的突變可導(dǎo)致多種有機(jī)陰離子的排泄缺陷，包括二價膽汁酸、結(jié)合膽紅素、糞卟啉異構(gòu)體、白三烯及許多其他化合物，如BSP、吲哚青綠、口服膽囊造影劑、抗生素如氨芐青霉素和頭孢曲松以及重金屬。當(dāng)Dubin-Johnson綜合征中一些MRP2突變基因在HepG2細(xì)胞中表達(dá)時，突變產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不能夠做為頂膜的靶向，而是潴留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，隨后降解于蛋白體中。在健康人群的肝臟中，BSEP、MRP2以及多耐藥糖蛋白I(MDRI)P-糖蛋白均定位在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上，但在患有膽汁淤積性疾病患者的肝臟中，大部分相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白均定位在頂端下囊泡中，因此阻斷了大部分毛細(xì)膽管的分泌過程[2,3]。然而導(dǎo)致這種重定位發(fā)生的機(jī)制至今尚未完全明確。2002年研究發(fā)現(xiàn)在生理情況下，MRP2的定位依賴于其與根蛋白在細(xì)胞骨架中的交互作用[4]。隨后，Kojima等[5,6]研究發(fā)現(xiàn)在患有膽汁淤積性疾病的患者及小鼠模型的肝臟中根蛋白和MRP2的共區(qū)域化作用受到干擾。

二、ERM蛋白與MRP2的作用

ERM蛋白家族成員埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(radixin)以及膜突蛋白(moesin)屬于同源蛋白，是連接質(zhì)膜與細(xì)胞骨架的橋梁分子?？蓞⑴c形成細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞正常形態(tài)，參與細(xì)胞生長、遷移的調(diào)控以及膜運輸。大多數(shù)細(xì)胞中存在著不止一種ERM蛋白，根蛋白是肝細(xì)胞中主要的ERM蛋白。根蛋白和埃茲蛋白主要定位于上皮細(xì)胞頂側(cè)膜，膜突蛋白主要定位于內(nèi)皮細(xì)胞中。ERM蛋白可在其特定位點發(fā)揮錨定作用，特別是對轉(zhuǎn)運蛋白的定位具有重要意義。目前已有研究表明，轉(zhuǎn)運蛋白可與一個或者多個ERM蛋白家族成員在相應(yīng)區(qū)域通過PDZ蛋白(突觸后密度蛋白95(PSD-95)/果蠅discs large蛋白(Drosophila discs large)/胞質(zhì)緊密粘連蛋白1(ZO-1))發(fā)生交互作用，然后使其準(zhǔn)確的定位在特定膜域。生理情況下，MRP2錨定于肝細(xì)胞頂端毛細(xì)膽管膜上。在膽汁淤積情況下，MRP2也可以由膽管膜上撤回到頂端下囊泡中。滲透壓過高、受到病理因素影響如：細(xì)胞因子、內(nèi)毒素或應(yīng)激等情況，均可導(dǎo)致MRP2從肝細(xì)胞膽管膜上撤回到頂端下囊泡內(nèi)，從而使MRP2在肝細(xì)胞膽管膜上的表達(dá)減少。有研究表明Radixin-/-小鼠患有新生兒高膽紅素血癥與毛細(xì)膽管膜中MRP2的膽紅素分泌泵的大量缺失相關(guān)[4]。另有多項研究表明[5-7]，在膽道梗阻、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、藥物性肝損等多種原因引起的膽汁淤積條件下，均可發(fā)現(xiàn)存在根蛋白位置分布異?；虮磉_(dá)下降，并推測MRP2在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜錨定失敗、撤回到頂端下囊泡內(nèi)可能與此相關(guān)。由此我們可以推斷，根蛋白是MRP2在毛細(xì)膽管膜中進(jìn)行準(zhǔn)確定位，和/或是維持MRP2在相應(yīng)位點活性的重要蛋白。值得注意的是，在這樣的定位體系中MRP2并不是唯一的ABC轉(zhuǎn)運蛋白。囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)是一種重要的氯離子通道，也是ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員之一，同樣依賴于ERM蛋白在各類上皮細(xì)胞頂端細(xì)胞膜中進(jìn)行錨定和定位。據(jù)此可以發(fā)現(xiàn)在患有膽汁淤積性疾病的肝細(xì)胞中根蛋白與MRP2不再具有共區(qū)域化作用，其交互作用也相應(yīng)喪失[5,6]。ERM蛋白并不是靜態(tài)粘附蛋白，事實上它們存在兩種形式：(1)未激活的休眠狀態(tài)，ERM結(jié)合域與其特定的PDZ域發(fā)生交互作用，從而阻止了ERM蛋白與其他PDZ包含蛋白如MRP2等的交互作用；(2)激活狀態(tài)，通過第567位點(哺乳類動物埃茲蛋白的T567)的蘇氨酸殘基磷酸化后，ERM蛋白內(nèi)在交互作用喪失，此時ERM蛋白可與其他錨定蛋白的PDZ域相結(jié)合[8]。

蛋白激酶C(PKC)信號通路對細(xì)胞活化、凋亡、遷移和細(xì)胞毒效應(yīng)等多種生理功能具有調(diào)節(jié)作用，是一條重要的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞通道。眾所周知膽汁淤積是PKC的激活劑。根據(jù)Ito等[9]研究，PKC信號通道可能激活MRP2的轉(zhuǎn)運。Chai等[10]就上述問題進(jìn)行研究的結(jié)果表明，在膽汁淤積小鼠模型中，活化的埃茲蛋白與MRP2可發(fā)生交互作用，這和蛋白在細(xì)胞內(nèi)囊泡中發(fā)生重定位有關(guān)。通過免疫沉淀反應(yīng)可以發(fā)現(xiàn)在患有膽汁淤積性疾病患者的肝臟中，MRP2并不與根蛋白發(fā)生交互作用，取而代之的是與可通過第567位點蘇氨酸殘基磷酸化激活的埃茲蛋白發(fā)生交互作用。同時研究還表明埃茲蛋白在保守的C端蘇氨酸殘基的磷酸化由蛋白激酶C(a、d和e)介導(dǎo)。而之前MRP2可在細(xì)胞內(nèi)囊泡中進(jìn)行的泛素化-蛋白酶體降解途徑也會相應(yīng)消失。在非膽汁淤積性的肝臟模型中，MRP2與根蛋白存在交互作用。因此推測在正常生理情況下MRP2與根蛋白交互作用，使其定位和(或)維持在毛細(xì)膽管膜上某一位點上的活性。但在膽汁淤積的情況下，MRP2與根蛋白交互作用喪失，磷酸化的埃茲蛋白取而代之與MRP2相結(jié)合，并使其直接定位在細(xì)胞內(nèi)。上述結(jié)果部分解釋了毛細(xì)膽管漿膜中MRP2對解除膽汁淤積的復(fù)雜信號通路。

三、存在的問題

盡管如此，仍然存在許多問題。首先，在膽汁淤積的條件下，其他毛細(xì)膽管ABC轉(zhuǎn)運蛋白如BSEP和P-糖蛋白在毛細(xì)膽管漿膜中也發(fā)生了重定位，但是這些蛋白與ERM蛋白是否發(fā)生交互作用目前尚未明確。并且P-糖蛋白的重定位以及BESP對Radixin-/-的小鼠影響甚微。Ortiz等[11]研究表明BSEP(和P-糖蛋白)的轉(zhuǎn)運依賴于HAX-1。因此，在膽汁淤積的情況下極有可能存在其他機(jī)制在毛細(xì)膽管膜中維持這些蛋白的活性以及使其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重定位。其次，埃茲蛋白和根蛋白的功能無特定的細(xì)胞類型，如埃茲蛋白可與MRP2發(fā)生交互作用，使其在腸道細(xì)胞頂端定位[12]。此外，在正常情況下磷酸化的埃茲蛋白可與MRP2發(fā)生交互作用，將其定位在腸道細(xì)胞中的頂端，在膽汁淤積情況下，磷酸化的埃茲蛋白還與肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜中MRP2的撤回密切相關(guān)[13]。顯而易見，我們還需要進(jìn)行大量的研究工作，才能明確上皮細(xì)胞頂端膜中ABC轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運機(jī)制。

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(本文編輯：張苗)

2016-02-01)

200080上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科