楊云松　方慧敏

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樹突狀細胞疫苗與Ewing肉瘤

楊云松方慧敏

430030，華中科技大學同濟醫(yī)學院

摘要樹突狀細胞是目前已知的抗原提呈能力最強的細胞，可激活T細胞來攻擊腫瘤細胞。樹突狀細胞疫苗能在體內(nèi)誘導特異性免疫應(yīng)答，可用于腫瘤治療。目前樹突狀細胞疫苗在臨床已逐漸開始使用，然而在治療Ewing肉瘤中的應(yīng)用卻鮮有報道。該文就樹突狀細胞疫苗及其在治療Ewing肉瘤中的應(yīng)用作一綜述。

關(guān)鍵詞樹突狀細胞；腫瘤疫苗；Ewing肉瘤

樹突狀細胞(DC)是體內(nèi)重要的抗原提呈細胞，可通過激活T細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)以及直接殺傷作用來攻擊腫瘤細胞。DC疫苗正是基于DC強大的抗腫瘤作用而設(shè)計的一種腫瘤疫苗，它能產(chǎn)生針對腫瘤抗原的特異性T細胞來殺傷腫瘤細胞。Ewing肉瘤是在青少年中發(fā)病率僅次于骨肉瘤的原發(fā)性骨惡性腫瘤，其最常見的遠處轉(zhuǎn)移部位是肺，且預(yù)后極差。有研究[1-2]報道，18歲以上無轉(zhuǎn)移的Ewing肉瘤患者4年總生存率為60%，而發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者4年總生存率僅為20%。由于現(xiàn)有治療方法對發(fā)生轉(zhuǎn)移的Ewing肉瘤療效較差，因此迫切需要探索新的治療方法。本文就DC疫苗及其在治療Ewing肉瘤中的應(yīng)用作一綜述。

1DC疫苗種類

腫瘤抗原肽負載的DC疫苗是體外使用腫瘤特異性抗原(TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(TAA)刺激DC，使之表達腫瘤抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ復(fù)合物，再回輸?shù)襟w內(nèi)，誘導機體抗腫瘤免疫反應(yīng)。由于腫瘤抗原的異質(zhì)性，可采用多抗原肽負載的方法來避免腫瘤逃逸。實驗研究[3]證實，多抗原肽負載的DC疫苗細胞毒性效應(yīng)顯著高于單抗原肽負載的DC疫苗。

腫瘤細胞融合的DC疫苗是將全腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物與DC融合，其優(yōu)點是無需確定TAA或TSA，而缺點是腫瘤細胞也表達自身抗原，故可能會誘導自身免疫性疾病發(fā)生，但目前尚無相關(guān)報道。有研究報道，異體來源的DC較自體來源的DC有更強的抗腫瘤效應(yīng)。Koido等[4]的實驗發(fā)現(xiàn)，來自健康者的DC與胰腺癌細胞融合的DC疫苗能在體外更好地誘導較高水平的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和干擾素(IFN)-γ產(chǎn)生。Kondoh等[5]研究發(fā)現(xiàn)，同種異基因DC與鼠惡性黑色素瘤細胞融合的DC疫苗較同基因和異種異基因DC疫苗有更強的抗腫瘤效應(yīng)，且同種異基因DC疫苗在小鼠體內(nèi)存活時間較長，因此推斷這是其殺傷效應(yīng)更為顯著的原因。

基因轉(zhuǎn)染的DC疫苗則是借助分子生物學手段，將TAA或TSA基因轉(zhuǎn)染至DC，使DC自身能持續(xù)表達腫瘤抗原。轉(zhuǎn)染DC的基因可以是DNA、mRNA及腫瘤總RNA。RNA轉(zhuǎn)染方式主要有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、裸RNA轉(zhuǎn)染法及電穿孔法，無需以病毒為載體即可獲得較好的效應(yīng)。而DNA轉(zhuǎn)染則需以病毒為載體，且外源性DNA有可能插入基因組而誘發(fā)突變或癌變。電穿孔法轉(zhuǎn)染mRNA優(yōu)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和裸RNA轉(zhuǎn)染法，有更好的轉(zhuǎn)染率和誘導特異性CTL免疫應(yīng)答的能力[6]。一項臨床試驗[7]應(yīng)用電穿孔法將編碼黑色素瘤全部TAA的mRNA轉(zhuǎn)染自體DC后再回輸給患者，結(jié)果在患者血液及發(fā)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)的組織中檢測出效應(yīng)性CD4+T細胞和CD8+T細胞，且發(fā)現(xiàn)各類人類白細胞抗原(HLA)均可識別疫苗表面的抗原。因此，基因轉(zhuǎn)染的DC疫苗優(yōu)勢之一是無須了解患者HLA表型，此類DC疫苗可能在臨床上有更廣泛的應(yīng)用前景。

此外，還可將編碼DC表面細胞分子的基因轉(zhuǎn)染至DC來增強免疫應(yīng)答效應(yīng)。Bonehill等[8]應(yīng)用電穿孔法將編碼CD40-L、組成性活化TLR4和CD70的mRNA共轉(zhuǎn)染DC，并稱之為TriMix-DC。近來有學者[9]應(yīng)用電穿孔法將TriMix mRNA分別與4種編碼黑色素瘤TAA的 mRNA共轉(zhuǎn)染至DC，制成4種TriMix-DC-MEL疫苗對患者進行皮下注射，結(jié)果顯示經(jīng)TriMix-DC-MEL刺激產(chǎn)生的抗原特異性CTL可通過血循環(huán)到達全身各處(包括皮膚組織)，這樣有利于減少腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生。進一步研究[10]發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)內(nèi)注射TriMix-DC不僅能使DC高表達CD40、CD70、CD80、CD86 和MHCⅡ，而且可使淋巴結(jié)中促炎因子和顆粒酶B表達大幅度增加。細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子(SOCS)1是酪氨酸激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號轉(zhuǎn)導通路中負性調(diào)節(jié)分子的細胞內(nèi)蛋白家族，抑制SOCS1可促進DC成熟及增強抗腫瘤作用[11]。將沉默SOCS1基因的siRNA與新型陽離子脂質(zhì)體YSK12-C4裝入多功能信封式納米載體(MEND)來轉(zhuǎn)染DC，結(jié)果轉(zhuǎn)染率為90%，明顯高于其他方法[12]。有學者以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米顆粒為載體，同時將沉默SOCS1基因的siRNA與卵清蛋白(OVA)導入DC內(nèi)，結(jié)果顯示可抑制SOCS1基因表達并促進DC分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6及IL-12，且可產(chǎn)生針對OVA的特異性CD8+T細胞[13]。如何增強DC疫苗的效應(yīng)是未來研究重點，而增加DC表面某些細胞分子表達或抑制負性調(diào)控基因為這一研究提供了新思路。

2DC疫苗在Ewing肉瘤免疫治療中的應(yīng)用

初診時發(fā)生轉(zhuǎn)移的Ewing肉瘤往往預(yù)后較差，可能是由于Ewing肉瘤的腫瘤抗原不能有效刺激T細胞產(chǎn)生針對該抗原的CTL[14]。因此，將DC疫苗應(yīng)用在Ewing肉瘤的治療中可能會促進腫瘤抗原提呈，并誘導CTL產(chǎn)生，從而提升療效。

2.1腫瘤抗原肽負載的DC疫苗

研究[15]表明，90%以上的Ewing肉瘤存在位于22號和11號染色體上的EWS、FLI-1基因重排，形成的融合基因EWS/FLI-1是目前診斷該疾病重要的標志物，因此EWS/FLI-1基因編碼產(chǎn)生的抗原肽是目前研究熱點。Peng等[16]將EWS/FLI-1抗原肽與DC負載并注射到表達EWS/FLI-1的Ewing肉瘤大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示該疫苗能明顯減緩Ewing肉瘤生長且對自體淋巴細胞無殺傷作用，并可顯著延長大鼠生存周期，實驗組第60天生存率為50%，而對照組第40天全部死亡；該疫苗可促進IFN-γ分泌，增強Th1細胞免疫功能。在一項關(guān)于DC疫苗對轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的Ewing肉瘤和腺泡狀橫紋肌肉瘤療效前瞻性臨床試驗[17]中，將DC與EWS/FLI-1抗原肽負載后注射到患者體內(nèi)，結(jié)果患者5年生存率從小于25%上升至43%，雖然有血小板減少、中性粒細胞減少、腹瀉、腹痛、總膽紅素升高及皮疹等不良反應(yīng)發(fā)生，但大部分患者(77%)對治療耐受并完成了全部療程；大劑量化療后淋巴細胞減少患者在輸注自體淋巴細胞后對流感疫苗產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，因此認為化療后的免疫功能不全并不會影響DC疫苗療效。Suminoe等[18]報道1例復(fù)發(fā)的Ewing肉瘤患兒，經(jīng)化療、自體干細胞移植及DC疫苗綜合治療達到完全緩解且隨訪至第77個月仍生存。EWS/FLI-1抗原肽負載的DC疫苗對于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的Ewing肉瘤患者有療效但并不夠顯著，可作為手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療的輔助治療手段，此外需進一步研究增強該疫苗療效的方法。

2.2腫瘤細胞融合的DC疫苗

腫瘤細胞融合的DC疫苗是將Ewing肉瘤細胞通過電融合或促融劑等方法與DC融合，由于負載物是全腫瘤細胞，因此可誘導產(chǎn)生針對多個腫瘤抗原的CTL。DC與Ewing肉瘤細胞A673在PEG1000、10%DMSO融合劑作用下融合率達23%，并可刺激同種淋巴細胞增殖及分泌IFN-γ，產(chǎn)生CTL并以MHC限制性方式殺傷腫瘤細胞[19]。實驗[20]顯示，腫瘤細胞融合的DC疫苗對于Ewing肉瘤細胞的殺傷及抑制生長作用無論是在體內(nèi)還是體外均優(yōu)于腫瘤細胞裂解物負載的DC疫苗及EWS/FIL-1基因轉(zhuǎn)染的DC疫苗，且該實驗應(yīng)用電穿孔法，融合率達16.32%。這可能是由于腫瘤的異質(zhì)性使得腫瘤表面有多種抗原，而腫瘤細胞融合的DC疫苗可識別多個表位的CTL，從而達到較好的殺傷效果。近來Merchant等[21]將腫瘤細胞裂解物負載的DC疫苗用于兒童轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的Ewing肉瘤及橫紋肌肉瘤輔助治療中，結(jié)果顯示初診轉(zhuǎn)移的Ewing肉瘤及橫紋肌肉瘤經(jīng)標準治療及DC疫苗治療后5年生存率上升至77%，且74%患兒達到無殘留病灶。由此可見，此療法在轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的Ewing肉瘤中有著較好的應(yīng)用前景，且無傳統(tǒng)化療所帶來的骨髓抑制等不良反應(yīng)。

2.3基因轉(zhuǎn)染的DC疫苗

王劍等[22]將Ewing肉瘤總RNA轉(zhuǎn)染DC并在體外培養(yǎng)，結(jié)果轉(zhuǎn)染的DC在體外提呈特異性腫瘤抗原能力顯著增強，CD40表達水平由32. 24%增高至72.32%，CD86表達水平由31.35%增高至87.69%，而CD14表達水平則由26.37%下降至10.46%，且采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測顯示DC疫苗可特異性表達EWS-FLI1 mRNA，因此具有較好的靶向性。利用總RNA轉(zhuǎn)染DC的優(yōu)勢在于無需明確患者HLA表型且總RNA包含多種編碼抗原信息，故可誘導廣泛的免疫應(yīng)答以減少腫瘤逃避的可能性。初步臨床研究[23]顯示，給予患者皮下注射總RNA轉(zhuǎn)染的DC后患者體內(nèi)CD8+T細胞水平明顯上升，且均未出現(xiàn)感染、發(fā)熱等不良反應(yīng)，而患者遠期生存率需進一步隨訪觀察。曲華毅等[24]的實驗成功構(gòu)建了Ewing肉瘤融合基因EWS/FIL-1重組腺病毒并轉(zhuǎn)染DC；體外實驗發(fā)現(xiàn)，EWS/FIL-1基因轉(zhuǎn)染的DC疫苗對尤文肉瘤A673細胞株殺傷率為35.18%，顯著高于對照組(P<0.05)。DNA轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢在于其轉(zhuǎn)染率較總RNA轉(zhuǎn)染高，尤其是采用腺病毒轉(zhuǎn)染方式。然而，目前對這一靶點的研究較少，且尚無體內(nèi)實驗報道，因此其效應(yīng)有待進一步考證。

3結(jié)語

隨著腫瘤學、免疫學及分子生物學的發(fā)展，腫瘤生物治療逐漸成為繼手術(shù)、化療及放療后的第四大腫瘤治療模式，其中基于免疫學的DC疫苗更是近年來研究的熱點，然而其尚存在一些亟待解決的問題，如哪種培養(yǎng)體系能獲得純度較高的DC、哪種組織來源的DC較合適、如何將免疫佐劑與疫苗聯(lián)合使用等。相信隨著基因工程學、免疫學及腫瘤生物學的發(fā)展，上述問題會在不遠的將來得到解決，DC疫苗也將在腫瘤生物治療領(lǐng)域有更好的應(yīng)用前景。

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(收稿: 2016-03-22; 修回: 2016-06-06)

(本文編輯: 盧千語)

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.04.010