李 沫，于 明，李尚穎，蔣丹丹，劉美辰，孫苓苓（遼寧省藥品檢驗檢測院，沈陽 110036）

HPLC法測定左卡尼汀注射液中有關(guān)物質(zhì)2（5H）-呋喃酮的含量

李 沫＊，于 明，李尚穎，蔣丹丹，劉美辰，孫苓苓#（遼寧省藥品檢驗檢測院，沈陽 110036）

目的：建立測定左卡尼汀注射液中有關(guān)物質(zhì)2（5H）-呋喃酮含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為APS-2 Hypersil，流動相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH4.7）-乙腈（35∶65，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為205 nm，柱溫為30Ⅱ，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：2（5H）-呋喃酮檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.001 974～0.987 mg/ml（r＝0.999 9）；定量限為4.0 ng，檢測限為1.2 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2%；加樣回收率為97.04%～103.36%（RSD＝0.24%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于左卡尼汀注射液中有關(guān)物質(zhì)2（5H）-呋喃酮的含量測定。

左卡尼汀注射液；有關(guān)物質(zhì)；2（5H）-呋喃酮；高效液相色譜法

左卡尼汀是哺乳動物能量代謝所必需的天然物質(zhì)，其注射液臨床上主要用于左卡尼汀缺乏引起的脂肪代謝紊亂[1]。經(jīng)查詢，全國共有10家左卡尼汀注射液生產(chǎn)企業(yè)，產(chǎn)品規(guī)格均為5 ml∶1 g；左卡尼汀注射液在《中國藥典》中沒有收載，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)共有5個，其中1個為部頒標(biāo)準(zhǔn)，4個為企業(yè)的注冊標(biāo)準(zhǔn)，而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中均沒有對有關(guān)物質(zhì)2（5H）-呋喃酮作相關(guān)要求。因此，筆者在參考《歐洲藥典》8.0版[2]中左卡尼汀原料藥有關(guān)物質(zhì)檢測方法及其他參考文獻(xiàn)[3-5]的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測定左卡尼汀注射液中有關(guān)物質(zhì)2（5H）-呋喃酮含量的方法，以期為控制該制劑的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括2489型紫外檢測器和2998型二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；XP205型百萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Orion 3-Star型酸度計（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 藥品與試劑

左卡尼汀注射液（國內(nèi)A、B、C、D 4家企業(yè)的62批樣品）；左卡尼汀對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101041-201302，純度：99.9%）；2（5H）-呋喃酮對照品（美國Alfa Aesar公司，批號：10172668，純度：98%）；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：APS-2 Hypersil（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH4.7）-乙腈（35∶65，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：205 nm；柱溫：30Ⅱ；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取2（5H）-呋喃酮對照品10.11 mg，置于200 ml量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.05 mg/ml的對照品貯備液。精密量取上述貯備液5 ml，置于50 ml量瓶中，用流動相定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為5 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品5 ml，置于100 ml量瓶中，用流動相定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為10 mg/ml的供試品溶液。2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例及制備工藝制備不含左卡尼汀的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，各相鄰成分峰的分離度＞1.5；理論板數(shù)以左卡尼汀峰計≥3 000。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.2（5H）-呋喃酮；2.左卡尼汀Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability testA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.2（5H）-Furanone；2.levocanitine

2.4 破壞性試驗

按如下方法制備各破壞溶液：（1）光破壞溶液。取樣品適量，在照度為4 500 lx的條件下照射5 h，精密量取2.5 ml，置于50 ml量瓶中，用流動相定容，搖勻，即得。（2）高溫破壞溶液。取樣品適量，置于烘箱中，于121Ⅱ加熱30 min，精密量取2.5 ml，置于50 ml量瓶中，用流動相定容，搖勻，即得。（3）酸破壞溶液。精密量取樣品2.5 ml，置于50 ml量瓶中，加2 mol/L鹽酸溶液1 ml，于60Ⅱ水浴中加熱15 min后放冷至室溫，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至中性，用流動相定容，搖勻，即得。（4）堿破壞溶液。精密量取樣品2.5 ml，置于50 ml量瓶中，加2 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，于60Ⅱ水浴中加熱15 min后放冷至室溫，用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，用流動相定容，搖勻，即得。（5）氧化破壞溶液。精密量取樣品2.5 ml，置于50 ml量瓶中，加30%過氧化氫溶液0.5 ml，于60Ⅱ水浴中加熱15 min后放冷至室溫，用流動相定容，搖勻，即得。取上述溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，樣品在光破壞條件下較穩(wěn)定，2（5H）有關(guān)物質(zhì)-呋喃酮的含量只有少量增加；經(jīng)高溫、酸、堿、氧化破壞后，2（5H）-呋喃酮的含量增加較為明顯。根據(jù)文獻(xiàn)[6]報道，左卡尼汀溶液在pH2～8、溫度110～130Ⅱ的條件下能產(chǎn)生2（5H）-呋喃酮，結(jié)合破壞性試驗結(jié)果亦可見，樣品在堿性和高溫條件下有關(guān)物質(zhì)2（5H）-呋喃酮增加最明顯。

2.5 線性關(guān)系考察

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖A.光破壞；B.高溫破壞；C.酸破壞；D.堿破壞；E.氧化破壞；F.未破壞；1.2（5H）-呋喃酮；2.左卡尼汀Fig 2 HPLC chromatograms of destructive testA.destroyed by light；B.destroyed by temperature；C.destroyed by acid；D.destroyed by alkali；E.destroyed by oxidant；F.not destroyed；1.2（5H）-Furanone；2.levocanitine

分別精密稱取左卡尼汀對照品和2（5H）-呋喃酮對照品適量，用流動相溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度均為2 mg/ml的混合對照品貯備液。取上述貯備液適量，用流動相稀釋制成質(zhì)量濃度分別均為0.002、0.01、0.05、0.2、1 mg/ml的系列混合對照品溶液。分別精密量取上述溶液各20 μl，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以2（5H）-呋喃酮質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝130 400.843 1x+1 768.424 3（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，2（5H）-呋喃酮檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.001 974～0.987 mg/ml。

2.6 定量限與檢測限考察

精密量取“2.5”項下質(zhì)量濃度為2 mg/ml的混合對照品貯備液適量，等倍逐步稀釋，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限為4.0 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限為1.2 ng。

2.7 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，2（5H）-呋喃酮峰面積的RSD＝0.16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：21405260）適量，于室溫下放置0、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，2（5H）-呋喃酮峰面積的RSD＝0.73%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號：21405260）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，2（5H）-呋喃酮的平均含量為0.003%，RSD＝1.94%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的樣品（批號：21405260）5 ml，置于10 ml量瓶中，用流動相定容，搖勻，作為供試品貯備液。精密量取供試品貯備液5 ml，共9份，分別置于50 ml量瓶中，分別精密加入低、中、高質(zhì)量的2（5H）-呋喃酮對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

取62批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算2（5H）-呋喃酮的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 2 Results of related substance in samples（n＝3，%）

續(xù)表2Continued tab 2

3 討論

在樣品質(zhì)量評價過程中，筆者曾采用國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中左卡尼汀注射液的含量測定條件[7]（C18柱、225 nm檢測波長）測定其有關(guān)物質(zhì)并與本試驗中的色譜條件進(jìn)行比較。結(jié)果，在色譜柱的選擇方面，由于左卡尼汀極性較大，在C18柱上保留時間較短，色譜峰拖尾嚴(yán)重，與有關(guān)物質(zhì)不能得到有效分離，而采用APS-2 Hypersil柱時，左卡尼汀與有關(guān)物質(zhì)均能達(dá)到有效分離，因此本試驗采用APS-2 Hypersil柱進(jìn)行分析；在檢測波長的選擇方面，筆者采用二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)左卡尼汀及其主要有關(guān)物質(zhì)均在紫外末端處有最大吸收，干擾測定，而在205 nm波長下進(jìn)行檢測各色譜峰分離度均較好，因此本試驗選擇205 nm作為檢測波長。

本試驗采用外標(biāo)法與自身對照法分別計算了樣品中2（5H）-呋喃酮的含量，由“2.11”項結(jié)果可知兩種計算方法所得含量結(jié)果的差異較大。這是因為在本試驗的色譜條件下，2（5H）-呋喃酮與左卡尼汀的響應(yīng)值相差154倍，若采用自身對照法計算會放大2（5H）-呋喃酮的真實含量，因此建議在采用本檢測方法時，用外標(biāo)法進(jìn)行含量計算。

綜上所述，本方法簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于左卡尼汀注射液中有關(guān)物質(zhì)2（5H）-呋喃酮的含量測定。

[1] 劉孟娟，周陳西.左卡尼汀的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國藥師，2011，14（1）：127.

[2] Council of Europe Strasbourg.European Phamacopoeia：8.0 [S].2013：2 607-2 608.

[3] 李紅英.左卡尼汀注射液的質(zhì)量評價[J].北方藥學(xué)，2014，11（12）：17.

[4] 王麗君，王靜，王一奇.左卡尼汀注射液的制備及質(zhì)量控制[J].藥物研究，2013，30（5）：269.

[5] 閔翠娥，陸媛，江少儀，等.HPLC法測定左卡尼汀注射液含量及有關(guān)物質(zhì)[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2009，25（6）：588.

[6] 毛超旭，汪朝陽，譚越河，等.金屬催化的2（5H）-呋喃酮反應(yīng)研究進(jìn)展[J].有機(jī)化學(xué)，2011，31（9）：1 377.

[7] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-023）-2005Z[S].2005：61-221.

（編輯：劉 柳）

Determination of the Related Substance in Levocanitine Injection

LI Mo，YU Ming，LI Shangying，JIANG Dandan，LIU Meichen，SUN Lingling（Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of 2（5H）-Furanone in Levocanitine injection.METHODS：HPLC was performed on the column of APS-2 HYPERSIL with mobile phase of 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate buffer solution（pH4.7）-acetonitrile（35∶65，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 205 nm，column temperature was 30Ⅱ，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range of 2（5H）-Furanone was 0.001 974-0.987 mg/ ml；the limit of quantitation was 4.0 ng，the limit of detection was 1.2 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 97.04%-103.36%（RSD＝0.24%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，sensitive and reproducible，and suitable for the content determination of 2（5H）-Furanone in Levocanitine injection.

Levocanitine injection；Related substance；2（5H）-Furanone；HPLC

R927.2

A

1001-0408（2016）36-5162-04 DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.39

2016-05-26

2016-07-08）

＊主管藥師，碩士。研究方向：化學(xué)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：024-31266303。E-mail：lemonbz@163.com

#通信作者：主任藥師，博士。研究方向：藥品標(biāo)準(zhǔn)。電話：024-31266505。E-mail：sunll@vip.163.com