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      黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶研究進展

      2016-03-15 09:51:31韓雙艷
      化學(xué)與生物工程 2016年1期
      關(guān)鍵詞:黑曲霉聚糖脂肪酶

      張 熙,韓雙艷

      (華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006)

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      黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶研究進展

      張熙,韓雙艷

      (華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006)

      摘要:黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉屬真菌中的常見種,它生長旺盛、發(fā)酵周期短、不產(chǎn)生毒素,是美國FDA認證安全菌種(GRAS)之一,也是重要的酶制劑生產(chǎn)菌種。綜述了黑曲霉產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究進展,并展望了其廣闊的應(yīng)用前景。

      關(guān)鍵詞:黑曲霉;酶;發(fā)酵產(chǎn)酶

      黑曲霉(Aspergillus niger),屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科,是絲狀真菌的一個常見種,廣泛分布于糧食、植物產(chǎn)品和土壤中。人類運用黑曲霉的歷史悠久,早在中國古代,人們就利用黑曲霉制作醬料、醬油、米酒等。由于黑曲霉生長旺盛、發(fā)酵周期短、不產(chǎn)生毒素,被美國FDA認證為安全菌種(GRAS)。

      黑曲霉具有很強的外源基因表達能力及高效的蛋白表達、分泌和修飾能力,同時重組子具有很高的遺傳穩(wěn)定性。隨著越來越多的外源蛋白在黑曲霉成功表達,且被證明具有較高的產(chǎn)量和活性,黑曲霉成為了一個重要的酶表達體系,也逐漸成為重要的工業(yè)酶制劑生產(chǎn)菌種[1]。據(jù)報道,黑曲霉可生產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果膠酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多種酶。作者綜述了黑曲霉產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究進展,并展望了其廣闊的應(yīng)用前景。

      1黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的研究進展

      纖維素是地球上分布最廣泛的一類碳水化合物,也是最豐富的可再生資源,但因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、降解難度大,還未實現(xiàn)有效的轉(zhuǎn)化利用。纖維素酶由葡聚糖內(nèi)切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(β-BG)構(gòu)成[2],主要用于水解纖維素的β-1,4葡萄糖苷鍵,使纖維素分解成短鏈糖。纖維素酶不僅在傳統(tǒng)的醫(yī)藥、食品、飼料、飲料、酒類、醬油等行業(yè)有應(yīng)用價值,而且擴展到單細胞發(fā)酵、紡織、造紙、環(huán)保、能源等新領(lǐng)域。黑曲霉是產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)量最高的菌株之一[3],目前國內(nèi)外基于黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究也較為集中。

      高星星等[4]為提高纖維素酶酶解秸稈產(chǎn)糖效果,以堿性雙氧水處理過的玉米秸稈為發(fā)酵基質(zhì),通過里氏木霉與黑曲霉混合發(fā)酵,獲得最佳產(chǎn)酶條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn),濾紙酶活力(FPA)可達1.224IU·mL-1,β-BG可達0.315IU·mL-1。

      先天敏等[5]通過單因素實驗及均勻設(shè)計法實驗研究了黑曲霉C112發(fā)酵產(chǎn)β-BG的最優(yōu)條件,所得酶活力最大可達12.925IU·mL-1,較優(yōu)化前提高了79.0%。

      董基等[6]以桔粉為原料,以黑曲霉為發(fā)酵菌株,采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在添加桔粉80g·L-1、麩皮和蛋白胨質(zhì)量比為1∶2下培養(yǎng)72h,纖維素酶產(chǎn)量達到1 885.71U·g-1。

      Acharya等[7]研究了不同木屑培養(yǎng)環(huán)境下黑曲霉產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶的最優(yōu)條件。結(jié)果表明,在堿(2mol·L-1NaOH)預(yù)處理木屑濃度9.6%、pH值4.0~4.5、深層發(fā)酵轉(zhuǎn)速120r·min-1、發(fā)酵溫度28 ℃時,纖維素酶活力最大達0.1813IU·mL-1。

      黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量大、活力高、優(yōu)化程度高、酶功能完整、用途廣泛,是一種生產(chǎn)纖維素酶的良好手段。

      2黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶的研究進展

      半纖維素是植物纖維素的主要組成成分,是自然界中含量僅次于纖維素的可再生生物資源,廣泛分布于高等植物的細胞壁中。木聚糖酶通常是內(nèi)切和外切木聚糖酶的總稱,作用于木聚糖主鏈內(nèi)部的木糖苷鍵,將其切斷并降解為寡聚木糖和少量單糖。

      木聚糖酶的工業(yè)化始于1980年左右,最初應(yīng)用于飼料工業(yè),飼料中添加木聚糖酶系可使植物性飼料更加容易被消化吸收。后來又擴展到食品、紡織和造紙等工業(yè)。木聚糖酶作為重要的酶制劑在市場上的份額占總銷售額的10%[8]。黑曲霉是發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的菌種之一,目前國內(nèi)外有很多關(guān)于提高黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶表達的最新研究。

      劉新育等[9]對黑曲霉孢子進行熱擊處理,探討了熱擊處理促進孢子萌發(fā)和木聚糖酶活力的機制。結(jié)果表明,42 ℃下熱擊4 h后轉(zhuǎn)入29 ℃發(fā)酵,可促使黑曲霉孢子較早萌發(fā)和菌絲較快生長。其中,發(fā)酵24 h的菌絲干重提高了38.5%,發(fā)酵72 h時達到最大生物量,較未處理的提前了12 h。熱擊處理后的發(fā)酵產(chǎn)酶總量和單位質(zhì)量菌絲產(chǎn)酶量均高于恒溫發(fā)酵,熱擊處理對木聚糖酶的種類并沒有影響。

      Okafor等[10]從廢舊木材中分離出一株野生黑曲霉菌株ANL301,研究了其在不同碳源(燕麥木聚糖、木屑、甘蔗漿和小麥糠)下產(chǎn)木聚糖酶的活性。結(jié)果表明,發(fā)酵96 h后,木聚糖酶活力分別為9.36 U·mg-1、3.37 U·mg-1、5.69 U·mg-1和3.86 U·mg-1。

      Betini等[11]將雪白曲霉、黑曲霉和赭曲霉以農(nóng)業(yè)剩余料為底物進行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶。其中,黑曲霉在培養(yǎng)基為麥糠和酵母提取物(或蛋白胨)混合物時產(chǎn)酶提高;當以玉米糠和麥糠為混合底物時,黑曲霉的木聚糖酶產(chǎn)量提高了18%,木聚糖酶活力達35 U·g-1。

      Dobrev等[12]優(yōu)化了黑曲霉B03產(chǎn)木聚糖酶的液體發(fā)酵條件。研究得到最優(yōu)培養(yǎng)基為(g·L-1):(NH4)2HPO42.6,尿素0.9,玉米芯24.0,麥麩14.6,麥芽6.0。優(yōu)化后的酶活力最高達996.30 U·mL-1,較優(yōu)化前提高了33%。

      黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶獲得了較高的產(chǎn)量、開發(fā)了廉價的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)底物,為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的基礎(chǔ)和條件。

      3黑曲霉產(chǎn)蛋白酶的研究進展

      蛋白酶是水解肽鍵的一類酶的總稱。按照水解方式的不同,蛋白酶可以分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩種。內(nèi)肽酶主要以蛋白質(zhì)分子鏈中間的肽鍵為作用位點,可以把蛋白質(zhì)分子切斷成為較短的肽鏈;外肽酶主要從蛋白質(zhì)分子的末端氨基或羧基進行逐個切割。蛋白酶主要應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、皮革紡織后加工等領(lǐng)域[13]。工業(yè)上主要的蛋白酶制劑生產(chǎn)菌株為枯草桿菌、棲土曲霉等。黑曲霉以其食品衛(wèi)生認可和可觀的蛋白酶表達量,也日益成為另一個重要的蛋白酶發(fā)酵菌株。國內(nèi)外的研究主要集中在發(fā)酵培養(yǎng)基的組成方面[14]。

      方春玉等[15]以瀘型大曲中分離的黑曲霉為菌種,采用固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酸性蛋白酶,酸性蛋白酶活力達24 350 U·g-1,平均酶活比初始培養(yǎng)基提高了64.6%。

      羅躍中等[16]對誘變后的黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)酸性蛋白酶的培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,得到最適培養(yǎng)基為:米糠20 g·kg-1,碳源玉米粉60 g·kg-1,氮源硝酸銨5 g·kg-1,MnCl24 g·kg-1;最適條件為:料液比1.0∶1.5(g∶mL),初始pH值7,接種量6 mL·(100 g)-1,40 ℃、180 r·min-1下發(fā)酵72 h,搖瓶產(chǎn)酶達到1 120.0 U·mL-1,比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了近2.9倍。

      詹深山等[17]以黑曲霉為出發(fā)菌株,以提油后的麻瘋樹餅粕為培養(yǎng)基,采用固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶,控制培養(yǎng)基濕度為50%,添加5%的葡萄糖作為碳源,在此條件下發(fā)酵4 d,蛋白酶產(chǎn)量達到最大值9 204 U·g-1。

      de Almeida等[18]采用響應(yīng)面法對黑曲霉ATCC 16404進行產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化。研究表明,在底物濕度48%、底物含量 35%、接種量0.18%、反應(yīng)時間4 d、反應(yīng)溫度30~45 ℃下,酶活力最高達到144.49 U·g-1。

      黑曲霉由于本身可分泌大量內(nèi)源蛋白酶,在利用黑曲酶產(chǎn)蛋白酶方面還有很大的提升潛力,有待進一步研究。

      4黑曲霉產(chǎn)淀粉酶的研究進展

      淀粉酶是水解淀粉等葡萄糖大分子聚合物的酶類總稱,一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等。根據(jù)產(chǎn)物異構(gòu)類型的不同,可分為α-淀粉酶與β-淀粉酶等。其中,微生物分泌表達的淀粉酶一般是指α-淀粉酶。淀粉酶在淀粉加工中發(fā)揮重要作用,它可以將微生物難以利用的大分子轉(zhuǎn)化為低聚糖、麥芽糖、麥芽三糖、葡萄糖等小分子,加速生物轉(zhuǎn)化過程。因此,耐酸淀粉酶、耐高溫淀粉酶成了目前發(fā)酵原料處理方面的研究熱點[19]。黑曲霉作為傳統(tǒng)的產(chǎn)淀粉酶菌株之一,文獻報道較多。

      譚海剛等[20]對一株高產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的黑曲霉菌株A020進行研究,確定該菌株的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:香蕉皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%蛋白胨、1%麥芽糖和3×103mol·L-1NaCl,酶活比優(yōu)化前提高了68.2%。

      吳茜茜等[21]研究了固態(tài)發(fā)酵條件對黑曲霉PZ301合成酸性α-淀粉酶的影響。結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件下酶活力可達19.6 IU·g-1干培養(yǎng)基;菌株的生物量和淀粉酶產(chǎn)量在72 h時均達到最高,這表明耐酸性淀粉酶系同步合成型酶。

      Khalaf等[22]研究了黑曲霉菌株O103A產(chǎn)α-淀粉酶的培養(yǎng)基組分。結(jié)果表明,以木薯為主要底物的培養(yǎng)基中,酵母提取物2 g·L-1、麥芽糖3 g·L-1對產(chǎn)酶影響最大,優(yōu)化后的酶活力達到42 U·mL-1。

      淀粉酶作為不可替代的工業(yè)產(chǎn)品,使黑曲霉等工業(yè)微生物產(chǎn)α-淀粉酶的研究成為重要的食品工業(yè)議題。

      5黑曲霉產(chǎn)脂肪酶的研究進展

      脂肪酶是以酯鍵為催化位點的一類酶,由一個可打開和關(guān)閉的“蓋子”結(jié)構(gòu)作為催化中心,分為親水和疏水兩種構(gòu)象,具有多項催化反應(yīng)(如催化解脂、酯交換、酯合成等)能力,因而成為重要的工業(yè)酶制劑品種之一,廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、日化等領(lǐng)域[23]。脂肪酶基因作為外源基因在宿主中表達已成為可靠的技術(shù),在細菌、酵母和絲狀真菌都已經(jīng)實現(xiàn)量產(chǎn)[24]。黑曲霉由于其食品安全性,在食品用脂肪酶的生產(chǎn)上有較多的研究。

      陳婧[25]成功將疏棉狀嗜熱絲孢菌耐熱脂肪酶基因(tll)轉(zhuǎn)化到無孢黑曲霉SH-2中,得到的轉(zhuǎn)化子脂肪酶活力為73 U·mL-1;構(gòu)建糖化酶、淀粉酶以及蛋白酶轉(zhuǎn)錄因子的RNAi干擾后,脂肪酶活力提高至97 U·mL-1。轉(zhuǎn)化子進行了2 L發(fā)酵罐發(fā)酵初步研究,所得脂肪酶活力為187 U·mL-1。

      潘力等[26]通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的、以潮霉素抗性基因為篩選標準的黑曲霉轉(zhuǎn)化體系介導(dǎo)米黑根毛霉脂肪酶(RML)轉(zhuǎn)化黑曲霉SH-1,成功獲得了RML的黑曲霉轉(zhuǎn)化子,并通過優(yōu)化發(fā)酵條件實現(xiàn)了RML的高效表達,對硝基苯酚比色法測得轉(zhuǎn)化子酶活力最高可達15 U·mL-1,是其在酵母中表達水平的10倍以上。

      黑曲霉強大的酶表達和修飾體系,使其成為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的脂肪酶的優(yōu)良生產(chǎn)菌株。

      6結(jié)語

      黑曲霉不僅在傳統(tǒng)酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)上具有優(yōu)勢,在其它新酶的生產(chǎn)方面也具有非常廣闊的應(yīng)用前景。黑曲霉在眾多微生物表達系統(tǒng)中凸顯出優(yōu)勢,主要有以下幾個原因:

      首先,作為真核生物,黑曲霉細胞內(nèi)擁有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等蛋白后加工模塊及復(fù)雜的基因排列方式、內(nèi)含子等原核生物沒有的特征,這些特征使黑曲霉表達體系可以生產(chǎn)一些結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的蛋白質(zhì)或酶。許多工業(yè)酶、食品酶、醫(yī)藥類酶的結(jié)構(gòu)趨于復(fù)雜,是原核生物表達系統(tǒng)(如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等)無法完善表達的,這使得黑曲霉在結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的酶種表達領(lǐng)域具有廣闊前景。

      其次,黑曲霉表達體系不但擁有優(yōu)秀的蛋白后加工能力,而且秉承了大部分好氧微生物生長快速、代謝旺盛、生存力強的優(yōu)勢,這使得黑曲霉表達體系產(chǎn)出的蛋白和酶質(zhì)量高、產(chǎn)量大。黑曲霉可適應(yīng)26~37 ℃的生長溫度,耐pH值范圍達2.5~6.5,有類似低等植物的生長方式,菌絲發(fā)達且分枝多,也有類似酵母菌的孢子生殖方式,分生孢子梗由特化了的厚壁從膨大的菌絲上生出。這樣可以確保它在各種環(huán)境下快速增殖,并分泌表達各種蛋白質(zhì)[27]。

      另外,黑曲霉基因組中具有眾多強啟動子。有無強啟動子是微生物表達體系能否作為外源蛋白表達工具的重要參考。黑曲霉糖化酶啟動子(GlaA)[28]為黑曲霉中運用最廣泛的一個誘導(dǎo)型啟動子,許多已經(jīng)工業(yè)化的菌株都以它為啟動子,并經(jīng)過基因改造用來生產(chǎn)酶制劑。目前,黑曲霉野生菌株CBS513.88已經(jīng)完成基因測序,黑曲霉基因的秘密正在被揭開[29]。

      與此同時,黑曲霉還具有美國FDA認證的GRAS食品級生產(chǎn)許可,這是許多其它整合表達系統(tǒng)(如畢赤酵母表達系統(tǒng)等)所不具備的,這也為黑曲霉在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了質(zhì)量保障。

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      Research Progress on Fermentation Production of Enzyme byAspergillusNiger

      ZHANG Xi,HAN Shuang-yan

      (SchoolofBioscience&Biotechnology,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

      Abstract:Aspergillus niger is one of common fungus species.Some characters,such as vigorous growth,short fermentation cycle,no toxins produced during growth,make Aspergillus niger recognized as GRAS(Generally Recognized as Safe) by US Food and Drug Administration(FDA).Aspergillus niger tends to be an important industrial enzyme production strain.In this paper,production of cellulase,xylanase,protease,amylase,lipase by Aspergillus niger is reviewed,and their future prospects of applications are also presented.

      Keywords:Aspergillus niger;enzyme;fermentation production of enzyme

      中圖分類號:Q 939.97

      文獻標識碼:A

      文章編號:1672-5425(2016)01-0013-04

      作者簡介:張熙(1990-),男,內(nèi)蒙古呼和浩特人,碩士研究生,研究方向:微生物發(fā)酵及酶催化合成,E-mail:1275926738@qq.com;通訊作者:韓雙艷,教授,E-mail:syhan@scut.edu.cn。

      收稿日期:2015-09-07

      基金項目:廣東省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)攻關(guān)項目(2012A080800013)

      doi:10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.003

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