劉培，彭楊思，趙良娟，張霞，龐璐，宋喆，張海英，吳冬雪，高旗利，鄭文杰（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

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金黃色葡萄球菌分離株自動化核糖體分型的研究

劉培，彭楊思，趙良娟，張霞，龐璐，宋喆，張海英，吳冬雪，高旗利，鄭文杰
（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

摘要：運用自動化核糖體基因分型系統(tǒng)（Riboprinter），用EcoRI酶，對實驗室分離的31株金黃色葡萄球菌進(jìn)行分子分型研究。31株菌均被鑒定為金黃色葡萄球菌，并獲得25種Riboprinter核糖體基因條帶型。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；杜邦全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)；核糖體基因分型

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylo-coccus），有“嗜肉菌”的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染[1]。一般說，金黃色葡萄球菌可通過以下途徑污染食品：食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌，造成食品污染；食品在加工前本身帶菌，或在加工過程中受到了污染，產(chǎn)生了腸毒素，引起食物中毒；熟食制品包裝不密封，運輸過程中受到污染；奶?；蓟撔匀橄傺谆蚯菪缶植炕摃r，對肉體其他部位的污染。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其隨著眾多微生物基因組全序列測序的完成，細(xì)菌分型的生物學(xué)技術(shù)研究取得了廣泛的發(fā)展。美國等發(fā)達(dá)國家早在20世紀(jì)90年代開始就使用多種分子生物學(xué)技術(shù)對細(xì)菌進(jìn)行分型研究。其中結(jié)合稀有內(nèi)切酶限制性切割染色體技術(shù)和分析酵母核型的改良凝膠電泳技術(shù)的脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型方法、Mazurek等建立的低頻限制性切割位點聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（IRS-PCR）分型方法、Welsh和Williams等利用一種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)建立的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）分型方法、由荷蘭Keygene公司的Marc和Pieter發(fā)明創(chuàng)建的擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）分型方法、Harris等建立的基于分離株的同工酶的多態(tài)性進(jìn)行分型的多位點酶電泳（MLEE）分型方法和由MLEE衍生出來多位點測序（MLST）分型方法等分子生物學(xué)技術(shù)得到廣泛應(yīng)用[2]。這些技術(shù)各有特色，各有利弊。其中，AFLP和RFLP的重復(fù)性較差，不利于實驗室間交流共享數(shù)據(jù)。MLST依賴基因測序，方法成本較高。PFGE應(yīng)用最為廣泛，其分辨力也很高，但比較費時，在某種程度上限制了PFGE的技術(shù)優(yōu)勢[3]。核糖體分型技術(shù)利用細(xì)菌核糖體基因在進(jìn)化中比較保守的原理，采用限制性內(nèi)切酶對細(xì)菌基因組進(jìn)行消化，經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移到膜上，再用核糖體基因探針進(jìn)行Southern雜交，得到細(xì)菌的特異性圖譜，具有較好的分型結(jié)果[4]。Riboprinter是一種全自動核糖體分型儀器，操作程序化，自動分析能力強(qiáng)，正常情況下，可在8 h內(nèi)同時完成8個細(xì)菌的核糖體分型。

本研究共采用來自不同國家樣品中分離出來的金黃色葡萄球菌菌株31株進(jìn)行了自動化核糖體分型，初步建立了實驗室金黃色葡萄球菌核糖體分型數(shù)據(jù)庫。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑

31株試驗菌株（見表1）；7.5 %氯化鈉肉湯、CM304凍干血漿：陸橋；哥倫比亞瓊脂、Baird-Parker瓊脂平板：OXOID；VITEK 2 Compact GP卡片：法國梅里埃公司；Riboprinter試劑盒EcoRI試劑套裝：美國杜邦公司。

表1試驗菌株Table 1 Testing strains

1.2主要儀器與設(shè)備

Riboprinter系統(tǒng)：美國杜邦公司；VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)：法國梅里埃公司；BioNumerics數(shù)據(jù)庫軟件5.0：APPLIED MATHS公司；常規(guī)培養(yǎng)法必備的儀器設(shè)備和器具。

1.3目標(biāo)菌Riboprinter核糖體自動分型

根據(jù)GB 4789.10-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》對試驗用31株目標(biāo)菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，在Baird-Parker瓊脂平板上挑取灰黑色帶透明光環(huán)菌落，接種營養(yǎng)瓊脂，挑取營養(yǎng)瓊脂上的菌落進(jìn)行Riboprinter鑒定。向微量離心管中加入40 μL樣本緩沖液，用菌落采集棒接觸菌苔，采集細(xì)菌放入樣本緩沖液中，制成均勻菌懸液。向樣本盛放管中加入制備好的菌懸液30 μL，放入配套熱處理儀滅活處理約30 min。向熱處理好的樣本中加入裂解液A和裂解液B各5 μL，制成上樣液。按儀器操作要求進(jìn)行程序自檢，輸入?yún)?shù)，按程序提示在指定位置安裝酶管（EcoRI）、尼龍膜、1 %瓊脂糖凝膠盒、基質(zhì)盒、純凈水、樣品盛放管，執(zhí)行啟動程序。

2結(jié)果與分析

自動化的Riboprinter過程從細(xì)胞裂解、釋放細(xì)菌DNA開始，之后經(jīng)限制性內(nèi)切酶將DNA切成大小一般為2 kb～20 kb的片段，這些片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，在膜上和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的包含編碼16SrRNA和23SrRNA的DNA片段及間隔序列的DNA探針雜交，雜交后得到細(xì)菌核糖體指紋圖譜，數(shù)碼相機(jī)捕捉特征性的發(fā)射光形成圖像數(shù)據(jù)，即Riboprinter條帶。在對原始圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析處理后，以0.85的相似度為界，與RiboPrinter菌庫內(nèi)的ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株譜圖進(jìn)行對比，當(dāng)樣品的圖譜與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)譜圖相似程度大于等于0.85時，系統(tǒng)給出結(jié)果；如果樣品的譜圖不能與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)譜圖的任何RiboPrinter模式相似程度大于等于0.85時，系統(tǒng)不能給出結(jié)果。整個自動化過程需8 h。

本研究選用EcoRI酶，通過Riboprinter系統(tǒng)，對31株菌進(jìn)行了核糖體基因分型過程，每個菌株都獲得了特征性條帶型，將每個菌株產(chǎn)生的條帶型與杜邦（DuPont）鑒定數(shù)據(jù)庫中的金黃色葡萄球菌條帶型比較，系統(tǒng)判定31株測試菌株全部為金黃色葡萄球菌。比較分析測試菌株時，若兩株菌的條帶型相似度≥0.90，系統(tǒng)不能區(qū)分而自動將其歸為同一核糖體基因型組（RiboGroup），并將該核糖體基因型組與杜邦數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)條帶型比較，給出最相似（相似度閾值≥0.85）杜邦條帶型。本研究中，31個測試菌株共產(chǎn)生25個核糖體基因型組（RiboGroup）。這25個組分別于數(shù)據(jù)庫中的DUP-15475、DUP-20338、DUP-20341、DUP-4008、DUP -15500、DUP -4073、DUP -15257、DUP -19244、DUP -14190、DUP -14159、DUP -22308、DUP -4067、DUP -19335、DUP -4014、DUP -4029、DUP -18720、DUP-14200、DUP-4036、DUP-4020相似。其中2株金黃色葡萄球菌集中于EcoRI 229-432-S-1組，與數(shù)據(jù)庫中的DUP-15475相似度達(dá)0.85～0.87；另8株金黃色葡萄球菌產(chǎn)生4個核糖體基因型組，都與數(shù)據(jù)庫中的DUP-20338相似；3株金黃色葡萄球菌產(chǎn)生2個核糖體基因型組，都與數(shù)據(jù)庫中的DUP-20341相似；2株金黃色葡萄球菌產(chǎn)生2個核糖體基因型組，都與數(shù)據(jù)庫中的DUP-4008相似；另2株金黃色葡萄球菌產(chǎn)生2個核糖體基因型組，都與數(shù)據(jù)庫中的DUP-15500相似；其余條帶型都只包含1個菌株，31株金黃色葡萄球菌的核糖體分型結(jié)果見表2。

表2 31株金黃色葡萄球菌的核糖體分型結(jié)果Table 1 31 Staphylococcus aureus Strains rDNA ribotyping

獲得的核糖體指紋圖譜經(jīng)RiboprinterTM標(biāo)準(zhǔn)化后，使用BioNumerics數(shù)據(jù)庫軟件進(jìn)行處理，識別圖形條帶，確定條帶位置，必要時進(jìn)行手工校正。以BioN－umerics軟件分析Dice相關(guān)系數(shù)并繪制樹狀圖見圖1。條帶位置差異容許度和優(yōu)化度分別設(shè)為1.00和0.50。對核糖體譜型的聚類分析發(fā)現(xiàn)，相似度界限值對分型的范圍和數(shù)量影響很大。相似度界限值越大，菌株核糖體的型別越多，目前尚無統(tǒng)一的國際標(biāo)準(zhǔn)。Connie S 和Sylvain Brisse在對屎腸球菌（Enterococcus faecium）進(jìn)行的分型研究，以及Wong等對副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的研究中均采用了93 %的相似度；Jaiier G對氏菌進(jìn)行分型研究時采用了90 %的相似度。本研究借鑒Connie S等的研究，采用93 %的相似度為分型界限值。從圖1可見共有21種核糖體帶型，其中14種帶型分別對應(yīng)1株金黃色葡萄球菌試驗菌株，即Staphylococcus aureus111019、Staphylococcus aureus 091222、Staphylococcus aureus 111128、Staphylococcus aureus 080425、Staphylococcus aureus 090727、Staphylococcus aureus 601004、Staphylococcus aureus601002、Staphylococcus aureus 601001、Staphylococcus aureus 601003、Staphylococcus aureus 120401、Staphylococcus aureus 111108、CMCC26003、Staphylococcus aureus 601009、Staphylococcus aureus 080416；其中1種條帶對應(yīng)5株金黃色葡萄球菌試驗菌株，分別為Staphylococcus aureus 601005、Staphylococcus aureus 601007、Staphylococcus aureus 080627、Staphylococcus aureus 080619和Staphylococcus aureus 080301；另6種條帶各對應(yīng)2株金黃色葡萄球菌試驗菌株，分別為Staphylococcus aureus 080826和Staphylococcus aureus 101223、Staphylococcus aureus 110922和Staphylococcus aureus 601008、Staphylococcus aureus 060429和Staphylococcus aureus 110314、Staphylococcus aureus 120530 -S1B和Staphylococcus aureus 120531 -S3A、Staphylococcus aureus 601006和Staphylococcus aureus 1320725、Staphylococcus aureus 090907和Staphylococcus aureus 080528。所有菌株的核糖體DNA被限制性內(nèi)切酶EcoRI消化后條帶數(shù)為9個左右，酶切條帶分子量范圍位于1 kb～50 kb之間。

圖1 31株金黃色葡萄球菌分離株核糖體型分型樹狀圖Fig.1 Genetic relationships of Staphylococcus aureus from different regions

3　結(jié)論

通過試驗建立了31株菌，共25個核糖體型的金黃色葡萄球菌核糖體分型數(shù)據(jù)庫。本研究為建立金黃色葡萄球菌分離株自動化核糖體分型積累了一定的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗，但要為突發(fā)性食物中毒的診斷和為企業(yè)查找污染源進(jìn)行溯源提供有效信息，還待今后堅持長期連續(xù)收集菌株，分析不同來源地的菌株的核糖體基因型分布特征。

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Automated Ribotyping of Staphylococcus aureus Monocytogenes

LIU Pei，PENG Yang-si，ZHAO Liang-juan，ZHANG Xia，PANG Lu，SONG Zhe，ZHANG Hai-ying，WU Dong-xue，GAO Qi-li，ZHENG Wen-jie
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：31 Staphylococcus aureus strains were tested by the automated ribotyping system（Riboprinter）. All the strains were identified as Staphylococcus aureus by the Riboprinter system，and 25 groups of Riboprint patterns were got.

Key words：Staphylococcus aureus；Riboprinter；ribotyping

收稿日期：2015-09-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.032

作者簡介：劉培（1979—），女（回），高級工程師，碩士研究生，研究方向：食源性微生物檢測。

基金項目：國家質(zhì)檢總局科研項目《生態(tài)港外來有害動植物疫病及食源性致病菌風(fēng)險控制措施研究》資助（2014IK222）