岳　雷,李中勇,尹寶穎,張　媛,徐繼忠

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,河北 保定　071001;2.滄州市農(nóng)林科學(xué)院,河北 滄州　061001)

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外源亞精胺對鴨梨自花授粉花粉管伸長及花柱蛋白表達(dá)的影響

岳雷1,2,李中勇1,尹寶穎1,張媛1,徐繼忠1

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,河北 保定071001;2.滄州市農(nóng)林科學(xué)院,河北 滄州061001)

摘要：為探討外源多胺調(diào)控鴨梨自交不親和的生理生化機(jī)制,分別以自花授粉和外源亞精胺處理后1~3 d的花柱為試材,測定了不同處理不同時期花粉管生長發(fā)育動態(tài),利用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)分析了外源亞精胺處理前后不同時期鴨梨花柱蛋白的差異表達(dá)。結(jié)果顯示:與對照相比,不同濃度的Spd處理均能極顯著促進(jìn)花粉管生長,0.25 mmol/L Spd處理72 h后可使大量花粉管到達(dá)花柱基部;在自交花柱電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)了3種特異蛋白質(zhì),A蛋白質(zhì)MrA=28.0 kDa,pI=5.7;B蛋白質(zhì)MrB=28.5 kDa,pI=5.7;C蛋白質(zhì)MrC=22.0 kDa,pI=5.3,這3種特異蛋白質(zhì)可能與自交不親和性相關(guān);質(zhì)譜分析獲得了2個較好的蛋白點,分別為推定和假定蛋白。

關(guān)鍵詞：亞精胺;鴨梨;花粉管;花柱蛋白

梨屬植物(PyrusL.)為配子體型自交不親和性果樹,絕大多數(shù)品種自花授粉不結(jié)實。自花授粉后,花粉管在沿花柱向子房生長途中受到抑制而停止生長是不能完成授粉受精的主要原因[1]。徐義流等[2]發(fā)現(xiàn),豐水梨授粉后36 h,自花授粉的花粉管僅伸長到花柱全長的44.3%位置,并停止生長,而異花授粉的花粉管已達(dá)到花柱的基部。在配子體自交不親和研究中需要解決的關(guān)鍵問題是花柱如何識別自己和異己的花粉管,解決此問題的著眼點集中在分離S位點的基因及其產(chǎn)物上。自證實配子體自交不親和性花柱抑制花粉管生長的物質(zhì)主要是S-RNase后,許多果樹的S基因所對應(yīng)的蛋白質(zhì)被分離和鑒定[3-5]。

多胺是一類小分子生物活性物質(zhì),在植物細(xì)胞生長和分裂中起重要作用,參與植物花芽分化、花和果實的發(fā)育及各種生理脅迫反應(yīng)。已有研究表明,多胺與果樹花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長密切相關(guān)[6-10],適宜濃度外源多胺可促進(jìn)梨[6]、蘋果[7]、獼猴桃[8]自花授粉后花粉管的伸長。但目前關(guān)于多胺與自交不親和關(guān)系的研究多集中于花粉管生長發(fā)育表型[6-8]及內(nèi)源激素含量測定[9,11-12]等生理指標(biāo)上,而對授粉受精過程中外源多胺對花柱內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)缺乏深入研究。本研究以自交不親和品種鴨梨為試材,探討外源亞精胺處理對鴨梨自交授粉花柱內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,并進(jìn)行差異點質(zhì)譜分析,以期為揭示外源多胺調(diào)控鴨梨自交結(jié)實的生理生化機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

于花前采取鴨梨樹冠外圍帶飽滿花芽的健壯枝條,帶回實驗室置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),開花后分別進(jìn)行人工自花和噴施亞精胺后自花授粉處理,以不同處理1~3 d的花柱為試驗材料。

1.2試驗方法

1.2.1花粉液體培養(yǎng)花柱提取液參考齊國輝[13]方法略加修改。取各處理花柱0.1 g,加1 mL預(yù)冷的基本培養(yǎng)液(10%蔗糖,0.01%硼酸)冰浴研磨成勻漿,以12 000 r/min離心20 min,上清液再用基本培養(yǎng)液稀釋1倍即為花柱提取液。在洗凈的雙凹玻片上滴上花柱提取液,將花粉均勻點播在上面,放入(25±1)℃的培養(yǎng)箱保濕避光培養(yǎng)12 h,每個處理觀察3個視野,重復(fù)4次。拍照并用Spot圖像分析軟件統(tǒng)計不少于100?；ǚ哿：?0個花粉管,數(shù)據(jù)經(jīng)處理后用Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

1.2.2花粉管生長的動態(tài)觀察在授粉后24,48,72 h采取物候期一致的第1,2朵邊花,每次5朵,去掉花瓣和萼片后放入裝有FAA固定液(70%酒精∶甲醛∶冰醋酸=90∶5∶5)的小瓶中,抽氣固定后備用。固定的花柱用清水沖洗后,用8 mol/L的氫氧化鈉軟化10 h,清水沖洗后放入事先配置好的過夜的脫色苯胺藍(lán)溶液(0.1%苯胺藍(lán)+0.1 mol/L磷酸鉀)中染色1 h(陰暗處),然后將花柱和子房分開,花柱直接在載玻片上用蓋玻片壓片,用ZEISS Axioskop 40型熒光顯微鏡觀察花粉管生長并拍照。

1.2.3可溶性蛋白的提取參照張金銳等[14]方法略加修改。稱取30 mg樣品,加入0.6 mL蛋白提取緩沖液(62.5 mmol/L Tris-HCl pH值6.8,20 g/L SDS,15 g/L DTT),4 ℃下研磨并完全移至1.5 mL離心管中,在4 ℃下提取1 h后,于15 000 r/min離心20 min,取上清液置入干凈離心管,按4∶1(V/V)加入變性樣品緩沖液(60 mmol/L Tris-HCl pH值6.8,25%甘油,2%SDS,5%β-巰基乙醇,0.1%溴酚藍(lán)),沸水浴8 min后備用。

SDS不連續(xù)電泳過程參照汪家政等[15]的方法(垂直板不連續(xù)電泳),分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%,電極緩沖液為Tris-甘氨酸(pH值8.3),含0.1%SDS。點樣量15 μL,濃縮膠穩(wěn)壓80 V,分離膠穩(wěn)壓160 V,至溴酚藍(lán)指示劑距膠底1 cm時結(jié)束電泳。

考染顯色的凝膠用BIO-RAD凝膠成像儀拍照,用Quantity One分析軟件對圖像進(jìn)行分析。

1.2.4蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備參照何瑞鋒等[16]的方法并加以改進(jìn)。取一定量樣品放入液氮中研成粉末,隨后加入-20 ℃預(yù)冷的10%三氯乙酸(丙酮配制,內(nèi)含有0.07%β-巰基乙醇)-20 ℃沉淀2 h。于4 ℃,13 000 r/min條件下離心20 min。棄上清,加入冷丙酮(其中含0.07%β-巰基乙醇)中,-20 ℃放置1 h(期間每隔一定時間振蕩一次使色素充分脫去),同上離心。重復(fù)2~3次。將沉淀懸浮于80%冷丙酮中-20 ℃放置1 h,離心去丙酮后將沉淀于-20 ℃放置,待丙酮揮發(fā)干凈即可備用。使用前按每mg干粉加20 μL樣品溶解液(9.5 mol/L尿素,4% NP-40,2.5%兩性電解質(zhì)載體(其中0.5% pH值3.0~9.5,1.0% pH值4.0~6.0,1.0% pH值6.0~9.0),5%β-巰基乙醇),37 ℃保溫30 min以上,上樣前于15 000 r/min離心20 min,上清液上樣或-70 ℃保存。

采用IEF/SDS-PAGE雙向電泳,參照O′Farrell[17]的方法,略有改動。第一向電泳采用微型等電聚焦柱狀電泳,凝膠長9 cm,直徑2 mm。凝膠組成為:3.78%丙烯酰胺,0.22%甲叉雙丙烯酰胺,9.0 mol/L尿素,2% NP-40,3% Ampholine pH值 3.5～10.0。負(fù)極電極液為20 mmol/L NaOH,正極電極液為10 mmol/L H3PO4,加樣(每管15 μL),進(jìn)行電泳50 V×1 h,100 V×30 min,250 V×30 min,500 V×6~7 h。聚焦電泳結(jié)束后,剝下膠柱放入平衡液(60 mmol/L Tris-HCl pH值6.8,3%SDS,5%β-巰基乙醇,10%甘油,微量1%溴酚藍(lán))中,30 ℃平衡25~30 min。第二向為SDS-PAGE微型平板電泳,分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%。將固定后的第一向膠柱橫放在第二向凝膠板的上端,并在近膠柱堿性端一側(cè)加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo)記液10 μL,再用融化的1%瓊脂糖將膠柱封固,然后進(jìn)行第二向電泳,穩(wěn)流20 mA/板,大約2 h 30 min結(jié)束。用銀染法染色,拍照記錄。

1.2.5差異點質(zhì)譜分析根據(jù)總蛋白2-DE圖譜上顯示的差異蛋白點,將蛋白點A~C從凝膠上切取后送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司,進(jìn)行肽質(zhì)指紋圖譜測定,查詢與結(jié)果相匹配的蛋白質(zhì),并將氨基酸序列在NCBI上搜索,根據(jù)同源的序列,推測其功能。

2結(jié)果與分析

2.1外源亞精胺對鴨梨花粉管伸長的影響

試驗結(jié)果表明(表1),不同濃度的Spd處理后花柱提取液都能促進(jìn)花粉管生長。授粉后1 d,0.50 mmol/L Spd處理的花柱提取液花粉管長度為261.8 μm,極顯著高于對照和其他3種濃度Spd處理水平。授粉后3 d,花粉管長度以0.25 mmol/L Spd處理的效果最好,為對照長度的123.35%,差異達(dá)極顯著水平。

表1　Spd處理花柱提取液對花粉管生長的影響

注：同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase in the same column represent significant difference(P<0.05);Different capital letters represent extremely significant difference(P<0.01)。

對鴨梨花柱進(jìn)行人工自花授粉,通過熒光觀察(圖1-3),授粉24 h后,花粉剛在柱頭萌發(fā),48 h后可看到花粉管伸進(jìn)到花柱1/4處,72 h后花粉管在花柱中部停止伸長,花粉管先端膨大呈球狀。0.25 mmol/L Spd處理鴨梨花柱后自花授粉,進(jìn)行熒光觀察(圖4-6)可以看出,授粉24 h后花粉在柱頭大量萌發(fā)且花粉管有一定伸長,48 h后花粉管伸長并穿過花柱中部,72 h后大量花粉管到達(dá)花柱基部。

圖1　自花授粉24 h(柱頭)

圖2　自花授粉48 h(上部)

圖3　自花授粉72 h(花粉管末端)

圖4　Spd處理授粉后24 h(上部)

圖5　Spd處理授粉后48 h(中部)

圖6　Spd處理授粉后72 h(基部)

2.2自花授粉和亞精胺處理后鴨梨花柱可溶性蛋白表達(dá)的比較

分別取鴨梨自花授粉和0.25 mmol/L Spd處理后的鴨梨花柱,提取可溶性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析,由圖7可以看出,在自花授粉1,2 d的花柱中,存在一條分子量為25.5 kDa的蛋白帶(6泳道右側(cè)箭頭所示),這條帶在自花授粉后3 d的花柱中消失。

對0.25 mmol/L Spd處理后的鴨梨花柱提取可溶性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析,由圖7可以看出,分子量為24.5,32.5 kDa的蛋白帶只存在于Spd處理后1 d的花柱中,而在Spd處理后2,3 d的花柱中沒有表達(dá)(2泳道右側(cè)箭頭所示)。分子量為30.0 kDa的蛋白帶存在于Spd處理后1,2 d的花柱中,而在3 d的花柱中沒有表達(dá)(3泳道左側(cè)箭頭所示)。

對比自花授粉和0.25 mmol/L Spd處理后的鴨梨花柱單向電泳蛋白條帶,發(fā)現(xiàn)分子量為18.0 kDa的蛋白帶在自花授粉花柱中均有表達(dá)(7泳道右側(cè)箭頭所示),而其只在Spd處理后3 d的花柱中微弱表達(dá)。分子量分別為22.5,30.0 kDa的2條蛋白帶在自花授粉3 d花柱中表達(dá)(7泳道左側(cè)箭頭所示)，而在Spd處理后3 d花柱中沒有表達(dá)。

圖7　自花授粉和Spd處理后鴨梨花柱蛋白比較

2.3自花授粉和亞精胺處理后鴨梨花柱蛋白的雙向電泳分析

對比自花授粉的鴨梨花柱和0.25 mmol/L Spd處理后鴨梨花柱的雙向電泳圖譜可以看出(圖8-13),蛋白點主要分布在等電點(pI)4.0~8.0,分子量(Mw)20.0~100.0 kDa。應(yīng)用ImageMaster 2D Platinum軟件對2塊膠進(jìn)行分析,將凝膠去除紋理和消除背景,進(jìn)行自動點檢測,手工消除因雜質(zhì)或明顯的瑕疵形成的“假點”,添加或切割因距離過近被識別成同一蛋白的蛋白點,每塊膠圖都能得到約200個蛋白點。然后利用軟件進(jìn)行差異點分析,結(jié)合肉眼觀察,在矩形區(qū)域(分子量:21.0~35.0 kDa、等點電:pI 4.5~6.5)差異比較明顯。

圖8　鴨梨自花授粉1 d花柱蛋白雙向電泳圖譜

圖9　Spd處理后1 d鴨梨花柱蛋白雙向電泳圖譜

圖10　鴨梨自花授粉2 d花柱蛋白雙向電泳圖譜

圖11　Spd處理后2 d鴨梨花柱蛋白雙向電泳圖譜

對比0.25 mmol/L Spd處理后鴨梨花柱與自花授粉的鴨梨花柱雙向電泳圖譜(圖14)可以看出,蛋白點A(28.0 kDa,pI=5.7)存在于自花授粉1~3 d的花柱中,而在Spd處理的花柱中,其表達(dá)量隨授粉時間延長而減弱。蛋白點B(28.5 kDa,pI=5.7)存在于自花授粉1~3 d的花柱中,而該點在Spd處理花柱中,隨授粉時間的延長,其表達(dá)量逐漸減弱并消失。蛋白點C(22.0 kDa,pI=5.3)存在于自花授粉1~3 d和Spd處理1 d的花柱中,而在Spd處理后2,3 d的花柱中沒有表達(dá)。

圖13　Spd處理后3 d鴨梨花柱蛋白雙向電泳圖譜

1-3.鴨梨自花授粉1~3 d的花柱;4-6.Spd處理后1~3 d的鴨梨花柱。

綜上所述,本試驗可以確定這個區(qū)域(分子量約為21.0~35.0 kDa、等點電pI 4.5~6.5)的蛋白與鴨梨自交不親和性相關(guān),同時也能說明在鴨梨花期噴施外源多胺,能夠影響授粉受精過程中花柱內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。

2.4差異蛋白點的初級質(zhì)譜結(jié)果分析

根據(jù)上述確定的差異蛋白,挖取了部分分辨率良好的差異蛋白質(zhì)點,在北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心進(jìn)行了肽指紋圖譜分析。對蛋白點A~C進(jìn)行了MALDI-TOF-MS分析,將所得的結(jié)果在http://www.matrixscience.com/數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行查詢,得到2個較好的蛋白匹配結(jié)果(表2)。

表2　通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析和PMF檢索確定的蛋白點

3討論與結(jié)論

陳迪新等[18]研究認(rèn)為,適宜濃度的多胺可以促進(jìn)豐水梨花粉萌發(fā)和花粉管生長。徐繼忠等[19]研究表明,噴施3種多胺均能夠加速蘋果花粉管的伸長,從而縮短授粉受精時間,提高授粉受精能力。本試驗研究結(jié)果表明,亞精胺處理后花柱提取液對鴨梨花粉管生長的影響與濃度和處理天數(shù)有關(guān),通過熒光觀察,0.25 mmol/L亞精胺處理能夠促進(jìn)活體鴨梨花粉管生長,3 d后使其穿過花柱中部到達(dá)花柱基部。

配子體型自交不親和果樹之所以表現(xiàn)為自交不親和,可能是由于花粉管在花柱生長過程中,花柱內(nèi)S復(fù)等位基因產(chǎn)物——具RNase活性的S糖蛋白在花柱內(nèi)分解同源花粉管的RNA,而抑制花粉管生長所造成的[20-21]。陳學(xué)好等[22]對黃瓜子房施用外源Spd處理，在花后1~3 d的子房中出現(xiàn)了4種特異的蛋白質(zhì)，從而影響單性結(jié)實和子房(幼果)發(fā)育。肖華山等[23]對荔枝花芽分化過程中多胺、RNA/DNA以及蛋白質(zhì)/RNA比值動態(tài)的進(jìn)行研究，揭示了多胺在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯3個水平上都能影響生物大分子的合成，參與了蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)。本試驗通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),與自花授粉花柱相比,0.25 mmol/L Spd處理后3 d的鴨梨花柱有2條蛋白帶(22.5,30.0 kDa)沒有表達(dá)。Spd處理后不同時期的花柱蛋白表達(dá)也存在明顯差異,在處理后1 d的花柱中有2條特異蛋白帶(24.5,32.5 kDa)表達(dá),分子量為30.0 kDa的蛋白帶在處理后3 d的花柱中消失。這可能與外施多胺通過影響核酸的構(gòu)象及各種酶的活性而影響蛋白質(zhì)的合成或降解有關(guān)[24]。細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能行為在部分程度上能通過翻譯后的降解來互補(bǔ)調(diào)控,有目的地降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)是許多細(xì)胞程序調(diào)控的重要模式[3]。本研究通過雙向電泳技術(shù)對上述處理進(jìn)一步蛋白分離,發(fā)現(xiàn)在Spd處理的花柱中,蛋白點A隨著授粉天數(shù)的延長,其表達(dá)量減弱。蛋白點B隨著授粉天數(shù)的延長,其表達(dá)量減弱直至消失。蛋白點C存在于自花授粉1~3 d和Spd處理后1 d的花柱中,而在Spd處理后2,3 d的花柱中消失。這些變化可能是由于多胺能刺激蛋白質(zhì)合成的各個中間步驟,如激活一系列氨酰_tRNA合成酶與核糖體結(jié)合,起裝備核糖體和穩(wěn)定亞基的作用,并參與蛋白質(zhì)合成的起始、延長、終止各個過程[25],從而降低花柱內(nèi)具RNase活性的S糖蛋白濃度,打破鴨梨自交不親和性。

本試驗選取了3個蛋白點進(jìn)行肽質(zhì)指紋分析,通過數(shù)據(jù)庫檢索,得到2個有意義的結(jié)果。蛋白點A~B的結(jié)果匹配第一的結(jié)果分別為假定蛋白和推定蛋白,蛋白功能尚未知曉;蛋白點C的匹配結(jié)果分?jǐn)?shù)較低,但其功能與影響核糖核酸酶有關(guān)。

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《華北農(nóng)學(xué)報》征訂啟事

《華北農(nóng)學(xué)報》1986年創(chuàng)刊，由河北、北京、天津、河南、山西、內(nèi)蒙古六省市區(qū)農(nóng)科院、農(nóng)學(xué)會聯(lián)合主辦，為全國首家跨省、市、區(qū)多單位聯(lián)辦的農(nóng)業(yè)學(xué)術(shù)刊物。本刊立足華北，面向全國和全世界。主要刊載農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)學(xué)科學(xué)術(shù)論文、研究報告及科研簡報，報道農(nóng)業(yè)學(xué)術(shù)動態(tài)。主要服務(wù)于農(nóng)業(yè)高等院校師生和農(nóng)業(yè)科研機(jī)構(gòu)的研究人員。

《華北農(nóng)學(xué)報》為中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫核心期刊(CSCD核心庫)、中文核心期刊、中國科技核心期刊、RCCSE中國權(quán)威學(xué)術(shù)期刊(A+)和中國農(nóng)業(yè)核心期刊。在2014年版《中文核心期刊要目總覽》綜合性農(nóng)業(yè)科學(xué)類核心期刊中排名第2位，為我國有影響力的農(nóng)業(yè)學(xué)術(shù)刊物?！度A北農(nóng)學(xué)報》多次榮獲國家級及省級獎勵：全國優(yōu)秀科技期刊評比三等獎、全國優(yōu)秀農(nóng)業(yè)期刊學(xué)術(shù)類一等獎、首屆華北優(yōu)秀期刊、首屆北方十佳期刊、中國北方優(yōu)秀期刊、河北省優(yōu)秀期刊、河北省十佳期刊及河北省榮譽期刊等獎項；2011年被評選為“中國精品科技期刊”。

《華北農(nóng)學(xué)報》國內(nèi)外公開發(fā)行, 國內(nèi)統(tǒng)一刊號：CN13-1101/S，國際刊號ISSN 1000-7091。雙月刊，雙月28日出版，國際標(biāo)準(zhǔn)大16開本，240頁，每期定價12元，全年72.00元。郵發(fā)代號： 18-10，國外發(fā)行代號：5918。全國各地郵局均可訂閱?？呻S時匯款到編輯部訂閱，請注明刊名、份數(shù)、姓名、地址、郵編及電話。

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Effects of Exogenous Spd on the Pollen Tube Growth and Stylar Protein Expression During Pollination and Fertilization of Yali Pear

YUE Lei1,2,LI Zhongyong1,YIN Baoying1,ZHANG Yuan1,XU Jizhong1

(1.College of Horticulture,Agricultural University of Hebei,Baoding071001,China;2.Cangzhou Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Cangzhou061001,China)

Abstract：Yali pear belongs to the kind of gametophytic self-incompatibility,the percentage of self-pollinated fruit set is extremely low.Our previous research showed that sprayed polyamine in a concentration range at florescence could break self-incompatibility of Yali pear.In order to explore the physiological and biochemical mechanism,the effects of exogenous Spd on the pollen tube growth and stylar protein expression of the Yali pear were studied by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrum analysis technology.The main results were as follows:The pollen tube length were extremely significantly increased after suitable concentration of Spd treatment,the best effects of exogenous Spd were 0.25 mmol/L Spd treatment,the number of pollen tube reached to the bottom of style were the most after 72 hours of treatment.Three specific proteins were found in the electrophoretogram.Two protein spots were obtained by the mass spectrometry results,which were predicted protein and putative protein respectively.

Key words:Spermidine;Yali pear;Pollen tube;Stylar protein

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.004

中圖分類號：Q78;S661.03

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0022-07

作者簡介：岳雷(1982-),男,河北滄州人,助理研究員,碩士,主要從事果樹結(jié)實生理與分子生物學(xué)研究。通訊作者：徐繼忠(1964-),男,河北唐山人,教授,博士,主要從事果樹結(jié)實生理與分子生物學(xué)研究。

基金項目：河北省自然科學(xué)基金資助項目(C200600429)

收稿日期：2015-12-12