于曉俊，曹紹玉，董玉梅，畢保良，張應(yīng)華，許俊強

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省滇臺特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心，昆明 650201)

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鈣結(jié)合蛋白對花粉生長發(fā)育調(diào)控研究進展

于曉俊，曹紹玉，董玉梅，畢保良，張應(yīng)華，許俊強*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省滇臺特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心，昆明 650201)

植物鈣結(jié)合蛋白存在于花粉管中，通過直接或間接結(jié)合Ca2+，定位膜結(jié)構(gòu)，形成Ca2+信號通道，發(fā)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對花粉發(fā)育及花粉管的生長起到調(diào)控作用。目前已明確以鈣調(diào)蛋白(CAM)、鈣依賴型蛋白激酶(CDPK)、類鈣調(diào)蛋白(CML)、類鈣調(diào)素B類蛋白(CBL)和激酶蛋白(CIPK)為主的植物鈣結(jié)合蛋白在調(diào)控花粉發(fā)育及花粉管生長方面的重要作用。該文主要對近年來國內(nèi)外已經(jīng)明確的各類鈣結(jié)合蛋白家族以及家族成員間不同的作用機理的研究進展進行綜述，并舉例闡述了鈣結(jié)合蛋白家族中各類成員對花粉管特定的作用方式及調(diào)控作用，最后對今后相關(guān)領(lǐng)域的研究前景進行了展望。

鈣結(jié)合蛋白；花粉萌發(fā)；花粉管伸長

A.生殖細胞;B.正在分裂的生殖細胞;C、D.正在變化的生殖細胞和花粉管;E.顯示還未分裂的生殖細胞;F.顯示生殖細胞隨伸長的花粉管運動;G.顯示由生殖細胞分裂成的2個精子隨花粉管伸長向胚囊方向運動圖1 花粉萌發(fā)與雄配子發(fā)育(A～G)[2]A.Generative cell; B.The division of generative cell;C, D. The changing generative cell and pollen tube; E.Represent for non dividing generative cell; F.Represent for the motion of generative cell with the elongation of pollen tube; G.Represent for two germ cell split by generative cell move into the embryo sac with the elongation for pollen tubeFig.1 Germination of pollen grain and development of male gametes(A-G)[2]

植物正常生長發(fā)育與花粉受基因正確調(diào)控、表達生長功能相關(guān)?；ǚ郯l(fā)育前期僅含營養(yǎng)細胞、生殖細胞或經(jīng)其分裂成的2個精子，其中精子結(jié)合卵細胞，形成受精卵，發(fā)育形成胚；另外精子結(jié)合兩極核細胞，形成受精極核，發(fā)育成胚乳。而花粉發(fā)育主要在傳粉后落至柱頭，受柱頭分泌黏液刺激，使萌發(fā)花粉粒內(nèi)壁突出，內(nèi)壁經(jīng)花粉外壁萌發(fā)孔向外延伸細管，形成動態(tài)伸長的花粉管，花粉管從柱頭經(jīng)花柱向子房方向延伸，待長至一定長度，原先花粉粒內(nèi)含物質(zhì)運動至花粉管頂端，直達胚珠，花粉管最終到達胚囊位置，攜帶兩精子及其它內(nèi)含物至胚囊，同卵細胞受精(圖1)。已知鈣離子作為調(diào)控花粉管生長的第二信使，可直接或間接結(jié)合鈣調(diào)蛋白，發(fā)揮鈣結(jié)合功能，改變花粉管Ca2+濃度梯度。研究表明，鈣離子濃度梯度經(jīng)調(diào)控高爾基體小泡定向分泌、運轉(zhuǎn)與融合，促使合成花粉管壁及質(zhì)膜相關(guān)物質(zhì)不斷運輸至花粉管頂端，形成新管壁及質(zhì)膜，最終導(dǎo)致花粉管頂端極性生長[1]。但各類型鈣結(jié)合蛋白作用鈣離子方式不同，因此，鈣結(jié)合蛋白相關(guān)類型與花粉發(fā)育具緊密聯(lián)系。

Ca2+作用于植物生長及對環(huán)境的適應(yīng)性，受刺激的Ca2+信號在特定時空內(nèi)表現(xiàn)為二價游離鈣離子。高濃度Ca2+分布于水合花粉萌發(fā)孔周圍，形成濃度梯度?；ǚ酃苌L受其頂端的限制，其生長速率可能與管頂端Ca2+的濃度呈正相關(guān)。而Ca2+可能參與調(diào)控花粉管極性生長，調(diào)控花粉管尖端細胞內(nèi)Ca2+濃度可能高度影響花粉管極性生長與伸長。

鈣結(jié)合蛋白用于解碼植物鈣信號，在植物體內(nèi)形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，接收并處理信息，調(diào)控花粉萌發(fā)及花粉管伸長[3]。國內(nèi)外學(xué)者越來越重視花粉管鈣離子信號作用植物相關(guān)位點的研究。目前已知鈣結(jié)合蛋白主要包含五大類鈣感受器，即鈣依賴型蛋白激酶(Ca2+-dependent kinases protein，CDPK)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CAM)、類鈣調(diào)蛋白(calmodulin-like protein，CML)、類鈣調(diào)素B類蛋白(calcineurin B-like protein，CBL)和激酶蛋白(CBL-interacting protein kinases，CIPK)，以及未知的一類蛋白質(zhì)。本文通過介紹花粉管中存在的不同鈣結(jié)合蛋白家族、代表性家族成員及相關(guān)作用機理，并從鈣結(jié)合蛋白對花粉管發(fā)育所起各類功能等方面詳細闡述，希望為相關(guān)研究者提供參考借鑒。

1 鈣依賴型蛋白激酶(CDPK)

CDPK作為Ca2+的感受器，對植物調(diào)控自身代謝及對外界環(huán)境的適應(yīng)性發(fā)揮重要作用，其中胞內(nèi)游離鈣離子是促進花粉萌發(fā)和花粉管生長過程中必不可少的要素[4]。CDPK具1個N-末端結(jié)構(gòu)域和其他3個相對保守結(jié)構(gòu)域[激酶結(jié)構(gòu)域，自抑制結(jié)構(gòu)域和C-末端類鈣調(diào)結(jié)構(gòu)域(4個鈣結(jié)合蛋白EF手型結(jié)構(gòu))]，在鈣調(diào)蛋白家族中，僅CDPK具蛋白激酶活性，與Ca2+結(jié)合以誘導(dǎo)自身構(gòu)象改變發(fā)揮其功能。

目前，已鑒定出擬南芥基因組花粉基因共34類AtCDPKs，其中有5類CDPK在花粉管中高度表達，分別是CDPK14、CDPK16、CDPK17、CDPK32和CDPK34；有12類CDPK與花粉管表達高度關(guān)聯(lián)[5]；經(jīng)CDPK N端標記的GFP(綠色熒光蛋白)對CDPK基因功能無明顯作用。研究表明，CDPK14和CDPK34誘導(dǎo)花粉管去極化生長(圖2)；CDPK32誘導(dǎo)花粉管過表達的作用最為明顯，其花粉管頂端形成球狀體積[6]，而CDPK14僅輕度抑制花粉管伸長，CDPK17的過表達對花粉管伸長甚至無影響。同時，因CDPK17和CDPK34為Ca2+信號傳導(dǎo)提供固定支撐模式，以提高花粉管尖端生長速率，從而使CDPK17和CDPK34在成熟花粉管中優(yōu)先表達[7]。另外，CDPK11和CDPK24作為Ca2+下游的響應(yīng)因子，對內(nèi)向K+通道AKT6具調(diào)控作用，雙方作為激酶級聯(lián)的局部結(jié)構(gòu)，在質(zhì)膜上相互作用，發(fā)生信號傳導(dǎo)，最終起到調(diào)控花粉管生長的功能[8]。

已知矮牽牛中有2種CDPKs(PiCDPK1和PiCD-PK2)在花粉管中高度表達。其中，PiCDPK1主要調(diào)控花粉管生長極性，PiCDPK2則參與花粉管伸長調(diào)節(jié)。過表達的PiCDPK1和PiCDPK2均可使花粉管生長極發(fā)生突變，使花粉管生長長度縮短，并生成球狀尖端。瞬時表達和超表達的PiCDPK1會擾亂花粉管的生長極，可能與管尖膨脹誘導(dǎo)Ca2+濃度上升有關(guān)，結(jié)果表明PiCDPK1可能參與調(diào)節(jié)Ca2+動態(tài)平衡。而PiCDPK2的表達未改變花粉管的生長極性、萌發(fā)率及生長形態(tài)，但抑制花粉管伸長生長[9]，表明CDPK1和CDPK2對花粉管生長具不同作用。另外，分析表明PiCDPK1與擬南芥CDPK17最為接近，二者具78%一致性，PiCDPK1也與在玉米花粉表達的CDPK具77% 一致性[10]。PiCDPK1主要經(jīng)酰化介導(dǎo)發(fā)生質(zhì)膜定位，激發(fā)激酶活性，而PiCDPK2位于未知內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜定位會多次重復(fù)發(fā)生，酰化作用還會再次介導(dǎo)部分定位發(fā)生。已知擬南芥植物生長發(fā)育演變過程中，調(diào)控花粉管伸長生長的氨基酸序列會隨CDPK17和CDPK24廣泛分離產(chǎn)生差異性[11]，表明CDPK在植物生長過程中起到不同功能。其他物質(zhì)結(jié)構(gòu)，如經(jīng)三磷酸依賴性肌醇釋放的Ca2+有利于Ca2+濃度梯度形成[4]；研究表明，PiCDPK1活性定位花粉肌動蛋白[12]，細胞內(nèi)微絲骨架與活性氧(reactive oxygen species, ROS)信號分子發(fā)生相互作用，均對花粉管尖端生長起到重要作用[13]，肌動蛋白失去細胞質(zhì)流將受到抑制，使花粉管停止生長[14]。玉米花粉中特定CDPK的表達不利于花粉管生長，但加入激酶抑制劑及鈣拮抗劑時則相反[10]。對花粉管尖端中心部位Ca2+濃度梯度分析表明Ca2+濃度梯度與濃度上升部位激酶活性上升相關(guān)[15]。

圖2 鈣結(jié)合蛋白分類及作用類型Fig.2 Classification and function types of calcium binding proteins

2 鈣調(diào)蛋白(CAM)

CAM是普遍存在真核生物中，屬于具調(diào)控花粉萌發(fā)及花粉管生長作用的一類鈣結(jié)合蛋白，位于花粉萌發(fā)孔和水合花粉萌發(fā)泡附近細胞質(zhì)及花粉管胞漿中的CAM，形成與管尖端處相似Ca2+濃度[16]。CAM家族自身不具激酶活性，僅通過與Ca2+相互作用，以形成Ca2+-CaM復(fù)合體，作用下游靶點，從而改變蛋白構(gòu)象。CAM的三維結(jié)構(gòu)類似啞鈴狀，具單個由3個鈣結(jié)合蛋白EF手型結(jié)構(gòu)組成的Ca2+結(jié)構(gòu)域[17]?；蚪M數(shù)據(jù)顯示，擬南芥家族共7類成員編碼4類鈣調(diào)蛋白亞基(CaMl/4；CaM2/3，5；CaM6；CaM7)[18]，其間僅相差5個氨基酸。

利用顯微注射技術(shù)，將CAM均勻注射到花粉管細胞質(zhì)中[19]，花粉管尖端處CAM仍具較高活性，因為CAM活性依賴于結(jié)合鈣離子，而低濃度CAM抑制活性物質(zhì)分泌，并改變花粉管生長極[20]。由于朱頂紅花粉管細胞外源性CAM含量上升可促進花粉管的伸長，外源性CAM與拮抗劑W7-agarose及EGTA相互作用，則能增大花粉管伸長速率[21]。

研究顯示，至少有90類具單個脫氧核糖核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與CAM間相互關(guān)聯(lián)[22]，這類蛋白質(zhì)主要來自BZIP、WRKY和 MYB轉(zhuǎn)錄因子家族[23]，CAM與轉(zhuǎn)錄激活因子(CAMTA)結(jié)合，促使所有含有這類轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)與CAM結(jié)合[24]。CAMTA在植物各種生理活動中發(fā)揮各類功能，如傳導(dǎo)激素信號[25]、維持碳氮代謝Ca2+運輸過程動態(tài)平衡[26]及響應(yīng)鹽和干旱脅迫信號等，這類鈣調(diào)蛋白可抵消其他鈣結(jié)合蛋白作用，如自我抑制型Ca2+泵(Auto in-hibted Calcium ATPase，ACA2)的Ca2+-ATP酶活性受CPK1磷酸化N-末端結(jié)構(gòu)域抑制作用，反會促進ACA2同CAM結(jié)合[27]。CAM與Ca2+相互作用條件下，幾類質(zhì)膜的結(jié)合與激酶胞漿受體的活性增強[28]。CAM是最為保守的一類真核蛋白，經(jīng)CAM擴展的蛋白質(zhì)家族，由數(shù)量各異Ca2+同鈣結(jié)合蛋白EF手型結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域結(jié)合其他結(jié)構(gòu)域組成[29]。其中CAM2對植物生殖生長發(fā)揮重要作用，通常CAM2決定花粉管伸長方向，并在花粉管生長過程中以改變Ca2+濃度為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮感應(yīng)Ca2+的功能，而CAM2和CAM7均可促進花粉管生長(圖2)。

3 類鈣調(diào)蛋白(CML)

CML是近年來發(fā)現(xiàn)僅存于植物體內(nèi)的一類鈣結(jié)合蛋白。其自身無法直接激發(fā)酶活性，僅通過與鈣依賴性蛋白間互作改變下游靶點，發(fā)揮鈣調(diào)功能。CML家族又屬于編碼蛋白一類蛋白質(zhì)家族，具鈣結(jié)合蛋白EF手型結(jié)構(gòu)，與CAM具16%氨基酸序列同源性[18]。擬南芥中50類CMLs均屬于編碼蛋白，這類CML包含大量功能性鈣結(jié)合蛋白EF手型結(jié)構(gòu)[30]。許多CML雖屬胞質(zhì)蛋白，但部分經(jīng)脂質(zhì)修飾的CML與膜發(fā)生作用[30]。對擬南芥AFFYMETRK ATH1基因芯片數(shù)據(jù)分析顯示，檢測中的48類CMLs基因，有19類在花粉管中表達，9類優(yōu)勢表達，部分基因轉(zhuǎn)錄時期水平含量會明顯升高。其中，CML39在花粉萌發(fā)期間表達上調(diào)；11類基因(CML2、CML3、CML14、CML15、CML16、CML20、CML21、CML24、CML39、CML42、CML49)在花粉管生長期間表達上調(diào)。需注意的是，部分基因(CML6、CML13、 CML25、CML28)均在花粉萌發(fā)及花粉管生長期間高度表達[31]。

CML25的相關(guān)研究表明，作為CML蛋白家族中一類具Ca2+結(jié)合活性成員，CML25普遍存在于成熟花粉粒及生長的花粉管中，CML25蛋白主要針對細胞質(zhì)發(fā)生介導(dǎo)作用。其中，CML25中斷供給使花粉管Ca2+濃度上升，CML25是通過Ca2+介導(dǎo)調(diào)控K+內(nèi)流，以促進花粉萌發(fā)及花粉管伸長的一類重要鈣結(jié)合蛋白[32]，故CML25功能性發(fā)揮，可能與管的腫脹尖端處Ca2+濃度改變相關(guān)。另有研究顯示，擬南芥CML24與Ca2+經(jīng)CML24肌動蛋白組織介導(dǎo)發(fā)生相互作用，進而影響花粉萌發(fā)及花粉管伸長(圖2)[33]；而CML21僅在過表達時顯著抑制花粉管伸長，但輕度拓寬花粉管，花粉管長度與野生型相比縮短近18%[34]，但其它類型基因過表達個體與野生型花粉管間極性生長并無明顯差異[35]；對自交不親和甘藍材料F1花粉萌發(fā)前后總蛋白雙向電泳結(jié)果的質(zhì)譜分析，得到花粉萌發(fā)及花粉管伸長相關(guān)的重要鈣結(jié)合蛋白CML49，并構(gòu)建35S與LAT52啟動子下反義CML49的表達載體，結(jié)果顯示，反義轉(zhuǎn)基因植株花粉萌發(fā)率顯著低于對照水平，花粉管長度也明顯縮短。此外，CML49在不同器官的表達分析說明該基因在不同器官均發(fā)生表達，花粉萌發(fā)前CML49基因表達量為萌發(fā)后的2.73倍，CML49在擬南芥生長發(fā)育各階段均存在表達，但表達量水平較低[18]。因花粉管存在大量不同類型鈣結(jié)合蛋白的表達，難以用傳統(tǒng)遺傳途徑研究CML對花粉管的作用機制，只能通過間接掌握CML與其他蛋白間相互作用機制，進一步深入研究CML對花粉萌發(fā)尤其是花粉管伸長方面的作用。

雖然目前國內(nèi)外對CML與花粉萌發(fā)及花粉管伸長作用關(guān)系的研究有部分進展，但仍處于起步階段，許多新型基因功能和機制還有待進一步研究和發(fā)現(xiàn)[34]。

4 類鈣調(diào)素B類蛋白(CBL)

CBL是一類最新發(fā)現(xiàn)的的鈣結(jié)合蛋白，具典型Ca2+結(jié)構(gòu)域，屬于傳遞型感受器。CBL需同CIPK相互作用傳遞信號，以發(fā)揮自身活性，其中CIPK是植物體內(nèi)特有的具絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶[36]，其絡(luò)合物CBL-CIPK鈣感受器具雙分子，于CBL的N-末端定位亞細胞[37]，以便各類CBL-CIPK絡(luò)合物建立解碼Ca2+的信號網(wǎng)，增強對細胞內(nèi)外Ca2+信號感知能力[38]。此外，類SNF1蛋白激酶已知是CBL的靶蛋白[39]，參與植物體內(nèi)各類細胞代謝過程，包括調(diào)節(jié)離子動態(tài)平衡及植物應(yīng)激反應(yīng)等。這類鈣結(jié)合蛋白的過表達，會抑制花粉管伸長，誘導(dǎo)花粉管去極化生長。此外，CBL蛋白還在穩(wěn)定植物體內(nèi)鈣離子含量、花粉管尖端生長鈣依賴性及花粉管振蕩生長平衡性方面發(fā)揮重要作用[40]。

已知擬南芥中具10類CBLs，經(jīng)微陣列數(shù)據(jù)分析10類CBLs，顯示4類CBLs(CBL1、CBL2，CBL3和CBL9)在成熟花粉、水合花粉和花粉管中表達[41]。CBL1與CBL9均在煙草花粉管中正常表達，但二者過表達不利于花粉管生長及形態(tài)發(fā)育；有數(shù)據(jù)分析表明，成功誘導(dǎo)這類表型需CBL1于質(zhì)膜高效定位，同時要求Ca2+獨立與CBL1第4位點鈣結(jié)合蛋白EF手型結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域成功結(jié)合。此外，CBL1和CBL9對花粉管生長調(diào)控受質(zhì)膜上K+濃度適中調(diào)節(jié)[42]，當(dāng)外界K+濃度上升時，于擬南芥花粉管中過表達的CBL1和CBL9能增強花粉管伸長敏感性；而K+濃度降低時，花粉管長度變短，當(dāng)外部K+濃度上升，CBL1和CBL9穩(wěn)定過表達均顯著降低花粉萌發(fā)率，并改變花粉管形態(tài)。CBL1和CBL9過表達誘導(dǎo)煙草粉管長度變短，造成其頂端膨大。這些研究結(jié)果表明，適度調(diào)節(jié)質(zhì)膜CBL1和CBL9累積水平是花粉正常萌發(fā)、花粉管極性生長的關(guān)鍵。除此以外，CBL1和CBL9也可調(diào)節(jié)花粉中各類離子間動態(tài)平衡。對煙草花粉管中CBL2和CBL3研究表明，二者氨基酸序列具92%一致性，均在花粉管細胞3個不同發(fā)育階段對亞細胞動態(tài)定位，這表明CBL2和CBL3可能參與調(diào)控?zé)煵莼ǚ酃茉缙谠偕L及去極化生長。CBL3過表達影響花粉管去極化生長，以抑制花粉管尖端伸長，拓寬花粉管管壁(圖2)；相似部位的CBL2僅抑制花粉管伸長，但未顯著拓寬花粉管管壁[34]。由此可見，過表達的CBL1、CBL2、CBL3和CBL9均抑制花粉管伸長，除CBL2未顯著拓寬花粉管尖端外，CBL1、CBL3和CBL9均誘導(dǎo)花粉管尖端膨脹，其中的CBL1與CBL9主要經(jīng)改變花粉管外K+濃度對花粉管頂端發(fā)揮作用。

5 激酶蛋白(CIPK)

CIPK是與CBL互作的特定激酶，同樣依賴與CBL互作激發(fā)活性，發(fā)揮鈣調(diào)功能。CIPK家族成員主要在一定濃度水平的Ca2+下，介導(dǎo)各成員間保守區(qū)域C端非激酶結(jié)構(gòu)域同CBL相互作用[36]，以形成CBL-CIPK雙分子傳感器，從而發(fā)生信號傳導(dǎo)。

CIPK與CBL發(fā)生相互作用，以參與調(diào)控花粉管細胞活動。其中，過表達的CIPK12誘導(dǎo)擬南芥花粉管尖端去極化生長，因為CBL2和CBL3與CIPK12發(fā)生共識表達，誘導(dǎo)CIPK12磷酸化依賴性增強，從而膨脹液泡并中斷花粉管極性生長[43]。

有研究表明，與CIPK12高度相似的CIPK19，對擬南芥花粉管生長同樣具明顯調(diào)控作用，CIPK19于花粉管中特異性表達，但過表達會誘發(fā)花粉管去極化生長，表明CIPK12與CIPK19存在功能冗余。花粉管外與管內(nèi)CIPK19表達，均阻礙花粉管正常極性生長；缺失CIPK19導(dǎo)致雄性花粉不育，但CIPK19過表達誘發(fā)花粉管去極化生長(圖2)。此外，經(jīng)Lat52啟動子啟動全長CIPK編碼序列與N-末端GFP相融合表達，利用基因槍法，瞬時表達煙草花粉管的融合結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明CIPK19-GFP過表達會高度誘發(fā)花粉管去極化生長。

CIPK19與CIPK12均可高度誘發(fā)花粉管去極化生長，大大降低花粉管伸長率，其間可能存在功能冗余。不同之處在于，CIPK12主要借助與CBL2或CBL3相互作用，以增強磷酸化依賴性，從而膨脹液泡，最終對擬南芥花粉管伸長起到抑制作用；CIPK19則主要借由介導(dǎo)Ca2+流，調(diào)控花粉管生長極性，CIPK含量過高或過低，均誘導(dǎo)花粉管尖端去極生長[44]。OsCIPK25和OsCIPK26與玉米晚穗期表達的玉米CDPK基因高度相似，其中由反義機制產(chǎn)生抑制作用誘導(dǎo)花粉管的生長[45]。

6 其他類型的鈣結(jié)合蛋白

除上述主要鈣結(jié)合蛋白家族，還涉及其他調(diào)控花粉管生長的鈣結(jié)合蛋白，膜聯(lián)蛋白是可調(diào)控質(zhì)膜、磷脂、肌動蛋白結(jié)合Ca2+調(diào)控花粉管生長的一類鈣結(jié)合蛋白，其作用機理在于結(jié)合Ca2+質(zhì)膜形成Ca2+信號通道，以進行膜性生物學(xué)活動，如信號傳導(dǎo)，從而發(fā)揮鈣調(diào)功能，調(diào)控花粉管生長發(fā)育[46]。

花粉管尖端高濃度膜聯(lián)蛋白(annexin)與高濃度Ca2+共存，同Ca2+結(jié)合花粉管突觸小泡、膜聯(lián)蛋白以及發(fā)揮鈣結(jié)合功能具直接聯(lián)系[47]。已知經(jīng)各類植物體中分離的膜聯(lián)蛋白，對肌動細胞骨架、MEM—膜，Ca2+中具連接功能，這些結(jié)構(gòu)用于促進花粉管伸長。此外，annexin5調(diào)控花粉管伸長，并在成熟花粉管中特定表達，用以誘導(dǎo)花粉管生長(圖2)；而花粉管發(fā)育二階段，annexin5僅對花粉管起保護作用，花粉管停止進一步生長時，由于annexin5功能水平下調(diào)，使花粉管最終退化變形[48]。對擬南芥8個家族膜聯(lián)蛋白氨基酸序列進行比較，結(jié)果表明，膜聯(lián)蛋白在花粉管發(fā)育初期表達量較高，并可能參與調(diào)控花粉管極性生長。此外，膜聯(lián)蛋白表達量在參與的極性伸長部位如根毛、花粉管等也會上調(diào)[49]。另有研究表明，BoAnnexin2于花粉萌發(fā)后期表達下調(diào)，經(jīng)免疫定位試驗發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白聚集于玉米花粉管[50]，Annexin D2、Annexin D6和Annexin D7在擬南芥花器官中均發(fā)生表達[51]。

7 小結(jié)與展望

經(jīng)上述對鈣結(jié)合蛋白分類闡述，以及各類鈣結(jié)合蛋白對花粉管作用方式差異性的綜合闡述，結(jié)合已有研究成果表明，僅CDPK一類鈣結(jié)合蛋白自身具蛋白激酶活性，可直接與Ca2+結(jié)合誘導(dǎo)自身構(gòu)象改變，發(fā)揮調(diào)控功能；而CAM、CML自身均不具酶活性功能，需經(jīng)間接作用，激發(fā)自身酶活性，兩者差異在于CAM經(jīng)同Ca2+相互作用以調(diào)控花粉管，而CML僅通過鈣依賴性蛋白間相互作用，來改變下游靶點，發(fā)揮鈣調(diào)功能；CBL發(fā)揮激酶活性方式更具特異性，僅通過與特異性互作激酶CIPK相互作用，傳遞信號來發(fā)揮自身酶活性，CIPK作為CBL靶蛋白，對花粉管調(diào)控同樣需與CBL結(jié)合，以生成CIPK-CBL絡(luò)合物的方式，發(fā)揮鈣調(diào)功能。此外，各大類鈣結(jié)合蛋白下不同家族成員對花粉管伸長與極性調(diào)控的作用效果也不同，可能具促進、抑制或無明顯作用。

近年來，研究人員對植物鈣結(jié)合蛋白家族類型、作用機理以及對花粉管的調(diào)控效應(yīng)等方面展開了一定程度的研究，越來越多的證據(jù)顯示鈣結(jié)合蛋白家族大多數(shù)成員對花粉管的生長發(fā)育起到重要調(diào)控作用，但還存在許多未知鈣結(jié)合蛋白家族成員有待發(fā)現(xiàn)，鈣結(jié)合蛋白相關(guān)作用機理、定位底物也有待進一步深掘，如鈣結(jié)合蛋白定位質(zhì)膜、細胞質(zhì)是否一定與鈣結(jié)合蛋白種類相關(guān)，EF手型蛋白的數(shù)量及結(jié)構(gòu)類型與鈣結(jié)合蛋白發(fā)揮功能性之間具哪些規(guī)律可尋，鈣結(jié)合蛋白發(fā)揮鈣調(diào)功能與花粉管中其他內(nèi)含物質(zhì)間的關(guān)聯(lián)是否有進一步研究的空間等。今后，擴大對花粉管相關(guān)鈣結(jié)合蛋白種類及作用機理多樣性進一步深掘成為鈣結(jié)合蛋白作用花粉管領(lǐng)域的主要研究方向。相信隨著相關(guān)理論研究不斷深入，鈣結(jié)合蛋白對花粉管伸長作用這一研究內(nèi)容會更加清晰，鈣結(jié)合蛋白對花粉管伸長調(diào)控作用研究水平會更加進步與完善。

[1] STEER M, STEER J. Pollen tube tip growth[J].NewPhytologist, 1989, 111(3): 323-358.

[2] TRISHA. Sexual Reproduction in Angiosperm Plants(Steps)[EB/OL]. 2013. http://www.biologydiscussion.com/ angiosperm/ sexual-reproduction-in-angiosperm-plants-steps/ 6506.htm.

[3] BREW J, KNACK B. The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth[J].AmericanJournalofBotany, 1963,859-865.

[4] MALHO R, READ N, TREWAVAS A. Calcium channel activity during pollen tube growth and reorientation[J].ThePlantCell, 1995, 7(8): 1 173-1 184.

[5] HARPER J, BRETON G, HARMON A. Decoding Ca2+signals through plant protein kinases[J].Annu.Rev.PlantBiol., 2004 55: 263-288.

[6] YOON G, DOWD P, GILROY S,etal. Calcium-dependent protein kinase isoforms in Petunia have distinct functions in pollen tube growth, including regulating polarity[J].ThePlantCell, 2006, 18(4): 867-878.

[7] PODELL S, GRIBSKOV M. Predicting N-terminalmyristoylationsites in plant proteins[J].BmcGenomics, 2004, 5(1): 1.

[8] ZHAO L, SHEN L, ZHANG W. Ca2+-dependent proteinkinase11 and 24 modulate the activity of the inward rectifying K+channels inArabidopsispollen tubes[J].ThePlantCell, 2013, 25(2): 649-661.

[9] YOON G, DOWD P, GILROY S. Calcium-dependent protein kinase isoforms in Petunia have distinct functions in pollen tube growth, including regulating polarity[J].ThePlantCell, 2006, 18(4): 867-878.

[10] ESTRUCH J, KADWELL S, MERLIN E. Cloning and characterization of a maize pollen-specific calcium-dependent calmodulin independent protein kinase[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences, 1994, 91(19): 8 837-8 841.

[11] HRABAK E. Calcium-dependent protein kinases and their relatives[J].AdvancesinBotanicalResearch, 2000,32: 185-223.

[12] EVANS C, HARMON A,etal. Calcium-dependent protein kinase is localized with F-actin in plant cells[J].CellMotilityandtheCytoskeleton, 1989, 12(1): 12-22.

[13] HEPLER P, VIDALI L, CHEUNG A. Polarized cell growth in higher plants[J].AnnualReviewofCellandDevelopmentalBiology, 2001, 17(1): 159-187.

[14] VIDALI L, MCKENNA S, HEPLER P. Actin polymerization is essential for pollen tube growth[J].MolecularBiologyoftheCell, 2001, 12(8): 2 534-2 545.

[15] MOUTINHO A, TREWAVAS A, MALHR. Relocation of a Ca2+-dependent protein kinase activity during pollen tube reorientation[J].ThePlantCell, 1998, 10(9): 1 499-1 509.

[16] MCCUBBIN A, RITCHIE S, SWANSON S. The calcium-dependent protein kinaseHvCDPK1 mediates the gibberellic acid response of the barley aleurone through regulation of vacuolar function[J].ThePlantJournal, 2004, 39(2): 206-218.

[17] PATIL S, TAKEZAWA D, POOVAIAH B. Chimeric plant calcium/calmodulin dependent protein kinase gene with a neural visinin like calcium-binding domain[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences, 1995, 92(11): 4 897-4 901.

[18] MCCORMACK E, TSAI Y, BRAAM J. Handling calcium signaling:ArabidopsisCaMsandCMLs[J].TrendsinPlantScience, 2005, 10(8): 383-389.

[19] MOUTINHO A, LOVE J, TREWAVAS A. Distribution of calmodulin protein andmRNAin growing pollen tubes[J].SexualPlantReproduction, 1998, 11(3): 131-139.

[20] RATO C, MONTEIRO D, HEPLER P. Calmodulin activity andcAMPsignalling modulate growth and apical secretion in pollen tubes[J].ThePlantJournal, 2004, 38(6): 887-897.

[21] MA L, SUN D. The effects of extracellular calmodulin on initiation ofhippeastrumrutilumpollen germination and tube growth[J].Planta, 1997, 202(3): 336-340.

[22] REDDY A, ALI G, CELESNIK H. Coping with stresses: roles of calcium and calcium/calmodulin regulated gene expression[J].ThePlantCell, 2011, 23(6): 2 010-2 032.

[23] DU L, ALI G, SIMONS K. Ca2+/calmodulin regulates salicylic acid mediated plant immunity[J].Nature, 2009, 457(7 233): 1 154-1 158.

[24] GALON Y, FINKLER A, FROMM H. Calcium-regulated transcription in plants[J].MolecularPlant, 2010, 3(4): 653-669.

[25] GALON Y, ALONI R, NACHMIAS D. calmodulin binding transcription activator 1 mediatesauxinsignaling and responds to stresses inArabidopsis[J].Planta, 2010, 232(1): 165-178.

[26] FRANZ S, EHLERT B, LIESE A. Calcium-dependent protein kinaseCPK21 functions inabioticstress response inArabidopsisthaliana[J].MolecularPlant, 2011, 4(1): 83-96.

[27] HARPER J, HONG B, HWANG I. A novel calmodulin regulated Ca2+-ATPASE (ACA2) fromArabidopsiswith anN-terminalautoinhibitorydomain[J].JournalofBiologicalChemistry, 1998, 273(2): 1 099-1 106.

[28] YANG T, CHAUDHURI S, YANG L. A calcium/calmodulin regulated member of the receptor-like kinase family confers cold tolerance in plants[J].JournalofBiologicalChemistry, 2010, 285(10): 7 119-7 126.

[29] SNEDDEN W, FROMM H. CALMODULIN CALMODULIN related proteins and plant responses to the environment[J].TrendsinPlantScience, 1998, 3(8): 299-304.

[30] YANG T, POOVAIAH B W.ARABIDOPSISchloroplast CHAPERONIN 10 is a CALMODULIN binding protein[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications, 2000, 275(2): 601-607.

[31] WANG Y, ZHANG W Z, SONG L F. TRANSCRIPTOME analyses show changes in gene expression to accompany pollen germination and tube growth in Arabidopsis[J].Plantphysiology,2008, 148(3): 1 201-1 211.

[32] WANG S S, DIAO W Z, YANG X.arabidopsisthalianaCML25 mediates the Ca2+regulation of K+transmembrane trafficking during pollen germination and tube elongation.[J].Plant,Cell&Environment,2015, 38(11): 2 372-2 386.

[33] YANG X, WANG S S, WANG M. Calmodulin like proteinCML24 regulates pollen tube growth by modulating the actin cytoskeleton and controlling the cytosolic Ca concentration[J].PlantMolecularBiology,2014, 3(86): 225-236.

[34] ZHOU L, FU Y, YANG Z. A genome-wide functional characterization of Arabidopsis regulatory Calcium sensors in pollen Tubes[J].JournalofIntegrativePlantBiology,2009, 51(8): 751-761.

[35] 許俊強. 甘藍花粉管鈣感受蛋白編碼基因CML49的克隆及功能鑒定研究[D].重慶：西南大學(xué), 2014.

[36] LUAN S, KUDLA J, RODRIGUEZ M. CALMODULINS and calcineurin B-like proteins calcium sensors for specific signal response coupling in plants[J].ThePlantCell, 2002, 14(suppl 1): S389-S400.

[38] HASHIMOTO K, KUDLA J. Calcium decoding mechanisms in plants[J].Biochimie, 2011, 93(12): 2 054-2 059.

[39] HALFTER U, ISHITANI M, ZHU J K. TheArabidopsisSOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium-binding proteinSOS3[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences, 2000, 97(7): 3 735-3 740.

[40] DRERUP M, SCHLüCKING K, HASHIMOTO K. The calcineurin B-like calcium sensorsCBL1 andCBL9 together with their interacting protein kinaseCIPK26 regulate thearabidopsisnadph oxidase rbohf[J].MolecularPlant, 2013, 6(2): 559-569.

[41] WANG H J, WAN A R, JAUH G Y. An actin binding protein, LlLIM1, mediates calcium and hydrogen regulation of actin dynamics in pollen tubes[J].Plantphysiology,2008, 147(4): 1 619-1 636.

[43] HEILMANN I, KUDLA J. VacuolarCBL-CIPK12 Ca2+-sensor-kinase complexes are required for polarized pollen tube growth[J].CurrentBiology, 2015,25: 1-8.

[44] ZHOU L, LAN W, CHEN B. A calcium sensor-regulated protein kinase, calcineurin b-like protein-interacting protein kinase19, is required for pollen tube growth and polarity.[J].PlantPhysiology,2015, 167(4): 1 351-1 360.

[45] DAS R, PANDEY G. expressional analysis and role of calcium regulated kinases in abiotic stress signaling[J].CurrentGenomics, 2010, 11(1): 2-13.

[46] HOFMANN A, PROUST J, DOROWSKI A. Annexin 24 from Capsicum annuum X-ray structure and biochemical characterization[J].JournalofBiologicalChemistry, 2000, 275(11): 8 072-8 082.

[47] FRANKLIN-TONG V. Signaling and the modulation of pollen tube growth[J].ThePlantCell, 1999, 11(4): 727-738.

[48] ZHU J, YUAN S, GUO W. Annexin5 is essential for pollen development inArabidopsis[J].MolecularPlant,2014, 7(4): 751-754.

[49] 黃逸群,左開井. 膜聯(lián)蛋白的功能與調(diào)控研究進展[J].生物技術(shù)進展,2012, 2(3): 157-164.

HUANG Y Q, ZUO K J .Advances in function and regulation of annexin[J].CurrentBiotechnology, 2012,2(3):157-164.

[50] 孫梓健,許俊強,宋 明,等. 結(jié)球甘藍花粉膜聯(lián)蛋白基因的克隆及其表達分析[J].園藝學(xué)報,2012, 39(8): 1 567-1 574.

SUN Z J, XU J Q, SONG M,etal. Molecular cloning and expression analysis of annexin gene from cabbage[J].ActaHorticulturaeSinica, 2012,39(8):1 567-1 574.

[51] CANTERO A, BARTHAKUR S, BUSHART T. Expression profiling of theArabidopsisannexin gene family during germination, de-etiolation and abiotic stress[J].PlantPhysiologyandBiochemistry, 2006, 44(1): 13-24.

(編輯:裴阿衛(wèi))

Research Progress of Calcium Binding Proteins in Pollen Growth and Development

YU Xiaojun, CAO Shaoyu, DONG Yumei, BI Baoliang, ZHANG Yinghua, XU Junqiang*

(Dian-Tai Engineering Research Center for Characteristic Agriculture Industrialization of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

The plant calcium binding protein was found in pollen tube, which combines with Ca2+directly or indirectly, orientates in membrane structure and forms Ca2+signal channel. After activation of signal transmission, it will regulate pollen development and pollen tube growth. The calcium binding proteins CAM(calmodulin),CDPK(Ca2+-dependent kinases protein),CML(calmodulin-like protein),CBL(calcineurin B-like protein)and CIPK(CBL-interacting protein kinases) are recognized as key roles in the regulation of pollen development and pollen tube growth. In this review, the recent research of mechanism in different protein families and whose members between the various types of calcium binding are summarized. It also presented the effect on pollen tube specific mode of action and regulation with some examples from the calcium binding protein family members for varioustypes. In addiction, the forecast is discussed in the review about the future research in related fields.

calcium binding protein；pollen germination；pollen tube elongation

1000-4025(2016)10-2121-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.2121

2016-07-13;修改稿收到日期:2016-09-11

國家自然科學(xué)基金(31560560，30972012)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃(2015FD019)

于曉俊(1992-)，男，在讀碩士研究生，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mial：1564810854@qq.com

*通信作者:許俊強，講師，主要從事蔬菜分子生物學(xué)研究。E-mail：xujunqiang101@163.com

Q945.6; Q257

A