王軍旗 張超 馬明瑛

[摘要]目的：探討微血管密度（MVD）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在鼻息肉患者鼻內(nèi)鏡術(shù)后囊泡組織中的表達(dá)及意義。方法：選取40例慢性鼻息肉患者（80側(cè)）為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)組為術(shù)后鼻腔刮除的囊泡組織，對(duì)照組為術(shù)中鼻息肉組織、下鼻甲組織，比較各組MVD和VEGF陽(yáng)性區(qū)域平均光密度的表達(dá)水平，并分析二者在囊泡組織中的相關(guān)性。結(jié)果：MVD在鼻息肉組織、囊泡組織及下鼻甲組織中依次增高，各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；VEGF的陽(yáng)性區(qū)域的平均光密度在鼻息肉組織、囊泡組織及下鼻甲組織中依次降低，各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；囊泡中MVD與VEGF陽(yáng)性區(qū)域的平均光密度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：MVD和VEGF的動(dòng)態(tài)變化可以作為鼻內(nèi)鏡術(shù)后粘膜預(yù)后轉(zhuǎn)歸的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]鼻息肉；MVD；VEGF；免疫組化；功能性鼻內(nèi)鏡手術(shù)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R765.25

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2016）02-0037-03

慢性鼻鼻竇炎（伴鼻息肉）為鼻部常見(jiàn)病、多發(fā)病，其發(fā)病與多種因素有關(guān)，其中血管的形成、細(xì)胞因子等在鼻息肉的發(fā)病和形成中發(fā)揮著重要作用。VEGF是己知的最強(qiáng)的血管通透因子，有研究認(rèn)為鼻粘膜血管通透性增加是導(dǎo)致鼻息肉組織水腫的重要原因，但VEGF在鼻粘膜炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程中的表達(dá)、誘生、調(diào)控因素等諸方而的研究尚不清楚，鼻息肉術(shù)后術(shù)腔的囊泡組織是影響患者恢復(fù)的重要因素，需在內(nèi)窺鏡下定期清理，才能使術(shù)腔完成上皮化過(guò)程。雖然現(xiàn)在認(rèn)為術(shù)腔囊泡等的增生是鼻內(nèi)窺鏡術(shù)腔轉(zhuǎn)歸的必經(jīng)階段，但其產(chǎn)生的生物學(xué)機(jī)制并不清楚。本研究檢測(cè)MVD及VEGF的表達(dá)，以探討其對(duì)鼻息肉術(shù)后囊泡組織的MVD及VEGF的表達(dá)對(duì)鼻腔粘膜上皮化進(jìn)程的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例及標(biāo)本：病例選自筆者所在醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2014年3月至8月行鼻內(nèi)鏡手術(shù)，術(shù)后定期隨訪且有粘膜囊泡、肉芽組織增生的慢性鼻竇炎（雙側(cè)，伴鼻息肉）患者40例（80側(cè)）其中男23例，女17例，年齡16-72歲，平均38.5歲。全部病例根據(jù)慢性鼻竇炎、鼻息肉診斷和治愈標(biāo)準(zhǔn)（2007 EPOS標(biāo)準(zhǔn)）納入。所有病例統(tǒng)一手術(shù)方式及術(shù)前術(shù)后用藥（口服或靜脈抗生素、糠酸莫米松噴鼻及鼻腔沖洗），均在鼻內(nèi)鏡下?lián)Q藥。術(shù)后換藥以術(shù)后14周內(nèi)作為研究期限。術(shù)后換藥并取鼻腔囊泡組織，同時(shí)取12例正常下鼻甲做對(duì)照組。

1.1.2 試劑與儀器：鼻內(nèi)鏡手術(shù)及監(jiān)視系統(tǒng)采用Storz系統(tǒng)，VEGF鼠抗人單克隆抗體、及二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。光鏡及免疫組化攝影采用OLYMPUS BH2型攝影生物顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：分別在留取術(shù)中下鼻甲組織、鼻息肉組織以及術(shù)后鼻內(nèi)鏡復(fù)查時(shí)的鼻腔囊泡組織，均經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，做成5μm厚切片，行伊紅（HE）染色。

1.2.2

MVD的計(jì)數(shù)：選取VEGF染色豐富的區(qū)域，每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，取平均值。

1.2.3 細(xì)胞因子VEGF免疫組織化學(xué)檢測(cè)：VEGF采用免疫組織化學(xué)SP法染色，染色操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以PBS替代一抗設(shè)立陰性對(duì)照， 以已知的陽(yáng)性組織片作為陽(yáng)性對(duì)照。圖像采集利用OLYMPUS BH2型攝影生物顯微鏡，在40倍接物鏡下，選取陽(yáng)性細(xì)胞集中的視野，調(diào)整圖像效果，使圖像的背底光密度一致。結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞可見(jiàn)棕黃色顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。并采用ImageProPlus6.O軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)量免疫組化切片的陽(yáng)性而積和積分光密度，通過(guò)陽(yáng)性區(qū)域的平均光密度比較陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)以x±s表示均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，選用SPSS13.O統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差分析；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；P

2 結(jié)果

2.1 光鏡下囊泡組織均為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，一部分組織表現(xiàn)為上皮剝蝕，基底膜不連續(xù)，細(xì)胞間隙寬，間質(zhì)內(nèi)大量紅細(xì)胞、大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、固有層水腫，上皮下層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖IA）；-部分表現(xiàn)為上皮層完整連續(xù)，上皮層可見(jiàn)杯狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞；纖毛柱狀上皮增多，腺體導(dǎo)管內(nèi)及血管周?chē)梢?jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤(rùn)（見(jiàn)圖IB）。

2.2 MVD在三組組織中的表達(dá)情況，MVD在鼻息肉組織、囊泡組織及下鼻甲組織中依次增高，各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.3 免疫組化染色結(jié)果顯示，VEGF主要定位于囊泡組織基底膜周?chē)难仔约?xì)胞和上皮細(xì)胞以及腺體、血管周?chē)脱鼙趦?nèi)皮細(xì)胞（見(jiàn)圖2A、2B）； VEGF的陽(yáng)性區(qū)域的平均光密度在鼻息肉組織、囊泡組織及下鼻甲組織中依次降低，各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.4 囊泡組織中MVD與VEGF的相關(guān)性分析，MVD與VEGF陽(yáng)性區(qū)域的平均光密度呈負(fù)相關(guān)（r=0.575，P

3 討論

VEGF是一種多功能的細(xì)胞因子，能高度作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，其生物學(xué)功能為：增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，促進(jìn)淋巴管增生，誘導(dǎo)血管生成。在炎癥、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長(zhǎng)等多種病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理或病理作用，特別是在腫瘤新生血管形成中的作用已成為研究熱點(diǎn)。Lee等發(fā)現(xiàn)VEGF是慢性鼻息肉的新型標(biāo)志物，通過(guò)自分泌前饋方式促進(jìn)鼻粘膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)并抑制其凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其遷移并形成管腔樣結(jié)構(gòu)；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，它可改變內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)方式，促進(jìn)纖維蛋白酶和間質(zhì)膠原酶的表達(dá)，直接誘導(dǎo)新生血管的生長(zhǎng)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，囊泡組織的MVD是介于下鼻甲和鼻息肉之間，下鼻甲的MVD最高。Coste A等發(fā)現(xiàn)鼻腔粘膜的血流中鼻甲血流明顯低于下鼻甲，鼻息肉組織及息肉樣變的中鼻甲等的血液供應(yīng)明顯低于鼻腔余處的粘膜組織，鼻息肉的發(fā)生區(qū)域和鼻腔的血液供應(yīng)差異明顯相關(guān)。這可能從某些角度反應(yīng)鼻息肉以及息肉樣變經(jīng)常發(fā)生在中鼻甲、中鼻道，而下鼻甲及鼻中隔等很少發(fā)生息肉樣變。在鼻息肉術(shù)后術(shù)腔恢復(fù)過(guò)程中囊泡等組織的血液供應(yīng)明顯改善，術(shù)腔粘膜上皮化向良性轉(zhuǎn)歸。但也有人在鼻息肉形成的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育的鼻息肉基質(zhì)中有大量的血管存在。

與MVD相比，VEGF在下鼻甲組織、囊泡組織以及鼻息肉組織中的表達(dá)不盡相同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF在鼻息肉組織的的表達(dá)不局限于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在一些成纖維細(xì)胞以及一些炎性細(xì)胞內(nèi)也可以檢測(cè)到，囊泡組織中主要定位于囊泡組織的腺體、血管周?chē)难鼙趦?nèi)皮細(xì)胞以及基底膜周?chē)难仔约?xì)胞和上皮細(xì)胞，下鼻甲粘膜上皮微量表達(dá)。VEGF在鼻息肉組織中表達(dá)最高，囊泡組織次之，下鼻甲組織最低，提示VEGF不僅僅參與鼻息肉的形成，也參與鼻腔正常生理功能的調(diào)節(jié)。在人體VEGF以旁分泌的方式特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)囊泡器的功能發(fā)揮對(duì)毛細(xì)血管和小靜脈的特異性通透作用.這種作用極利于大分子物質(zhì)外滲，沉積在血管外的基質(zhì)中，為血管形成過(guò)程中多種細(xì)胞遷移提供了一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò)。VEGF還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種組織蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)、新生血管形成子、基質(zhì)膠原酶等在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)釋放等以上這些作用可改變細(xì)胞外的基質(zhì)，參與細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，使其更易于血管的生長(zhǎng)。囊泡組織中的VEGF表達(dá)程度可能提示術(shù)后的鼻腔粘膜在由鼻息肉向正常鼻腔粘膜轉(zhuǎn)歸的過(guò)程中隨著鼻腔粘膜水腫程度的降低，VEGF的表達(dá)程度也隨之減低。由此可以推測(cè)通過(guò)檢測(cè)在術(shù)后囊泡等VEGF的表達(dá)水平可以判斷術(shù)后粘膜預(yù)后的轉(zhuǎn)歸，如果術(shù)后的囊泡組織和鼻息肉VEGF表達(dá)程度一樣或者更高，則提示鼻息肉復(fù)發(fā)的可能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MVD與VEGF陽(yáng)性區(qū)域的平均光密度呈負(fù)相關(guān)，即隨著MVD的增高VEGF的表達(dá)程度逐漸降低。雖然很多實(shí)驗(yàn)證明VEGF能引起血管增生，但是并不能說(shuō)明鼻腔術(shù)后囊泡組織VEGF表達(dá)越高，囊泡組織的MVD就越高?？赡芏咄瑫r(shí)受另一個(gè)因素的影響所致。

VEGF可能參與鼻息肉形成的同時(shí)也參與正常生理功能的調(diào)節(jié)。在不同時(shí)期囊泡組織中MVD和VEGF關(guān)系，以及囊泡組織中的其他細(xì)胞因子對(duì)鼻息肉術(shù)后粘膜預(yù)后轉(zhuǎn)歸的影響等還需進(jìn)一步深入探宄。