韓園芳，冀林華，劉芳，馮婷婷，李建平，馬曉靜，崔森，李占全

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810000；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院；3青海大學(xué)；4青海省人民醫(yī)院)

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慢性高原病患者骨髓有核紅細(xì)胞Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)變化

韓園芳1，冀林華2，劉芳3，馮婷婷1，李建平4，馬曉靜2，崔森2，李占全2

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810000；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院；3青海大學(xué)；4青海省人民醫(yī)院)

摘要：目的觀察慢性高原病(CMS)患者骨髓有核紅細(xì)胞Ras相關(guān)GTP酶(Ras-GTP)分泌水平及B型絲/蘇氨酸蛋白激酶(BRaf)、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)、細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ERK1)、細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2(ERK2)表達(dá)變化。方法 CMS患者15例(觀察組)，單純陳舊性骨折患者15例(對(duì)照組)，采用ELISA法檢測(cè)骨髓有核紅細(xì)胞Ras-GTP，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)骨髓有核紅細(xì)胞BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA。結(jié)果與對(duì)照組比較，觀察組Ras-GTP分泌水平升高，BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量增加(P均<0.05)。觀察組Ras-GTP、Braf mRNA、MEK mRNA、ERK1 mRNA、ERK2 mRNA與HGB呈正相關(guān)(r分別為0.860、0.849、0.653、0.773、0.746，P均<0.01)。結(jié)論 CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2表達(dá)升高，Ras/Raf/MEK/ERK通路可能與CMS紅細(xì)胞的過度累積有關(guān)，推測(cè)其可能是CMS發(fā)病機(jī)制中的重要通路之一。

關(guān)鍵詞：高原?。还撬栌泻思t細(xì)胞；Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路

慢性高原病(CMS)既往又稱為高原紅細(xì)胞增多癥，以過度紅細(xì)胞增多和嚴(yán)重低氧血癥為特征[1]，并伴有血紅蛋白(HGB)及紅細(xì)胞壓積升高，但目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究[2]認(rèn)為，CMS發(fā)生病理生理改變的主要機(jī)制是機(jī)體對(duì)高原環(huán)境失適應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)低氧，引起低氧誘導(dǎo)因子表達(dá)增加，促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等下游基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路通過瀑布式的激活過程將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。本研究觀察了CMS患者骨髓有核紅細(xì)胞Ras-GTP分泌水平及B型絲/蘇氨酸蛋白激酶(BRaf)、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)、細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ERK1)、細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2(ERK2)表達(dá)變化，并探討其意義。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2014年9月～2015年10月青海大學(xué)附屬醫(yī)院收治的CMS[1]患者15例(觀察組)，均為男性，年齡(50.4±3.5)歲；均為漢族，且長(zhǎng)期居住在海拔2 500 m以上的地區(qū)。另選15例單純陳舊性骨折患者作為對(duì)照組，患者均為男性，年齡(48.9±2.3)歲。兩組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。所有受試對(duì)象均簽署知情同意書，并經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2骨髓有核紅細(xì)胞采集、分選及培養(yǎng)采集受試對(duì)象骨髓液10 mL，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，以CD71、CD235a抗體磁珠分選陽性細(xì)胞，將分選的CD71、CD235a陽性細(xì)胞以1×106/mL培養(yǎng)于5 mL IMDM培養(yǎng)體系中(含30%胎牛血清、20 ng/μL IL-3、10 μmol/mL EPO、69%IMDM)，37 ℃、5%CO2、3%O2的培養(yǎng)箱內(nèi)低氧培養(yǎng)72 h。

1.3骨髓有核紅細(xì)胞分泌的Ras-GTP檢測(cè)將培養(yǎng)后的骨髓有核紅細(xì)胞以800 r/min離心，收集離心后的上清液，采用ELISA法檢測(cè)Ras-GTP，操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

1.4骨髓有核紅細(xì)胞BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA檢測(cè)收集培養(yǎng)后的有核紅細(xì)胞，按TRIzol 試劑盒說明裂解細(xì)胞，提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用于PCR擴(kuò)增，50 ℃、2 min，95 ℃、15 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物于Roche LightCycler?480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)掃描，讀取CT值。目的基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCT表示。

1.5外周血HGB、血氧飽和度、紅細(xì)胞壓積檢測(cè)抽取受試者外周血，采用XE-2100全自動(dòng)細(xì)胞分析儀檢測(cè)HGB、紅細(xì)胞壓積，指套式光電傳感器檢測(cè)血氧飽和度。

2結(jié)果

兩組Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較見表1。兩組外周血HGB、血氧飽和度、紅細(xì)胞壓積比較見表2。觀察組中Ras-GTP、Braf mRNA、MEK mRNA、ERK1 mRNA、ERK2 mRNA與HGB呈正相關(guān)(r分別為0.860、0.849、0.653、0.773、0.746，P均<0.01)。

表1　兩組Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表2　兩組HGB、血氧飽和度、紅細(xì)胞壓積比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3討論

CMS是以過度紅細(xì)胞增多和嚴(yán)重低氧血癥為特征[1]，并伴有HGB及紅細(xì)胞壓積升高。研究[3]發(fā)現(xiàn)，CMS骨髓紅細(xì)胞增生明顯活躍，以晚幼紅細(xì)胞增生明顯，且骨髓組織血管增生顯著。

近年來，Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路與低氧相關(guān)性疾病的關(guān)系越來越受到重視。發(fā)生CMS時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子高表達(dá)，可廣泛激活眾多低氧反應(yīng)基因如EPO、VEGF等，EPO可與促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)相互作用而激活JAK2基因[4]，使EPOR磷酸化，EPOR胞質(zhì)SH2結(jié)構(gòu)域與Grb2結(jié)合，吸引具有鳥苷酸交換因子活性的SOS至細(xì)胞膜，促進(jìn)Ras-GDP轉(zhuǎn)換為Ras-GTP，導(dǎo)致Ras活化，依次激活MEK、ERK，進(jìn)入核內(nèi)促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等功能[5～7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，CMS患者VEGF水平升高，VEGF在CMS中的作用主要是誘導(dǎo)血管形成，增強(qiáng)血管的通透性。而VEGF不僅僅是血管生成因子，而且與造血調(diào)節(jié)有密切關(guān)系。VEGF作為肝表面細(xì)胞膜生長(zhǎng)因子，受到刺激過度表達(dá)時(shí)，會(huì)激活Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，此通路持續(xù)活化后，通過抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活及促進(jìn)耐藥基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞異常增殖及腫瘤形成[9]。Ras/Raf/MEK/ERK通路不僅與肝細(xì)胞癌有關(guān)，在多種實(shí)體腫瘤及其他疾病中均檢測(cè)到該通路的異常激活，如食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、口腔癌、自閉癥等[10～14]。

本研究顯示，觀察組Ras-GTP分泌水平較對(duì)照組升高，BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組增加；觀察組Ras-GTP、Braf mRNA、MEK mRNA、ERK1 mRNA、ERK2 mRNA與HGB呈正相關(guān)。提示Ras/Raf/MEK/ERK通路可能與CMS紅細(xì)胞的過度累積有一定關(guān)系，推測(cè)其可能是CMS發(fā)病機(jī)制中的重要通路之一。

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(收稿日期:2015-11-05)

中圖分類號(hào)：R555.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2016)03-0052-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.019

通信作者：冀林華(E-mail: lindaji1@163.com)

基金項(xiàng)目：青海省科技廳國際合作項(xiàng)目(2014-HZ-808)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81441116)；青海省科技廳(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012-Z-729)。