許丹丹， 何　艮， 周慧慧， 宋　飛

(中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

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玉米蛋白粉部分替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚的生長(zhǎng)性能和游離氨基酸代謝的影響?

許丹丹， 何艮??， 周慧慧， 宋飛

(中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

摘要：以初始體重(9.19±0.01)g的大菱鲆幼魚為研究對(duì)象，研究玉米蛋白粉部分替代飼料中的魚粉蛋白對(duì)大菱鲆幼魚的生長(zhǎng)性能、血漿生化指標(biāo)、組織游離氨基酸含量及氨基酸分解關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響。設(shè)計(jì)2種等氮、等能的實(shí)驗(yàn)飼料組：魚粉對(duì)照組(FM)和玉米蛋白粉替代45%魚粉蛋白組(CGM)，分別飽食投喂大菱鲆幼魚30天。研究表明：與FM組相比，CGM組大菱鲆幼魚的特定生長(zhǎng)率、飼料效率、以及蛋白質(zhì)和脂肪沉積率顯著降低，且全魚粗蛋白和粗脂肪含量也顯著降低(P<0.01)，但CGM組的全魚水分和灰分含量顯著高于FM組(P<0.01)。CGM組血漿總蛋白、葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇含量均較FM組顯著降低(P<0.05)。大菱鲆攝食CGM組飼料后，其血漿和肌肉游離氨基酸含量均較FM組顯著降低，且肌肉氨基酸降幅度更大(P<0.05)。CGM組腸道支鏈α-酮酸脫氫酶二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙?；?BCKD-E2)mRNA表達(dá)量較FM組顯著升高。結(jié)果表明：玉米蛋白粉替代45%魚粉蛋白顯著抑制了大菱鲆幼魚的生長(zhǎng)，降低了飼料效率，影響了魚體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成和代謝，加快了腸中氨基酸的分解代謝，降低了組織游離氨基酸的平衡性和總量。

關(guān)鍵詞：大菱鲆；玉米蛋白粉；替代；氨基酸；基因表達(dá)

XU Dan-Dan, HE Gen, ZHOU Hui-Hui, et al. Effects of partial replacement of fish meal with corn gluten meal on growth performance and free amino acid metabolism of juvenile turbot (ScophthalmusmaximusL.) [J].Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(2)： 26-34.

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織的報(bào)告，2012年世界上超過(guò)一半的水產(chǎn)品來(lái)自養(yǎng)殖[1]。然而，受世界魚粉產(chǎn)量和價(jià)格的影響，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展越來(lái)越受到飼料原料來(lái)源的制約，而飼料原料的核心問(wèn)題是蛋白源問(wèn)題[2]。盡管一系列植物性蛋白原料，可用于部分替代魚類飼料中的魚粉，然而對(duì)于海水肉食性魚類，植物蛋白源的替代遇到了瓶頸，當(dāng)飼料中魚粉替代率超過(guò)50%以后，飼料的蛋白質(zhì)效率就明顯下降，并伴隨有生長(zhǎng)減緩、生理機(jī)能降低等情況的出現(xiàn)[3-5]。從養(yǎng)殖成本、可持續(xù)性及魚類健康方面來(lái)說(shuō)，非魚粉蛋白源替代魚粉的研究需不斷深入。

氨基酸不僅是蛋白質(zhì)和其它含氮化合物合成的前體，也參與體內(nèi)主要代謝途徑的調(diào)控，且越來(lái)越多的學(xué)者證明氨基酸也作為信號(hào)分子參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程[6-7]。因此，體內(nèi)氨基酸組成的變化將對(duì)機(jī)體生理變化、代謝狀態(tài)和生長(zhǎng)等有重要影響。在魚類中研究發(fā)現(xiàn)，飼料氨基酸模式和組織游離氨基酸庫(kù)的組成具有高度相關(guān)性[8-10]。組織游離氨基酸的變化說(shuō)明了機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀況，決定蛋白質(zhì)合成方向，因此需要闡明不同飼料原料與組織氨基酸庫(kù)組成間的關(guān)系。已有研究表明，當(dāng)體內(nèi)FAA不平衡時(shí)，氨基酸分解供能加劇，降低蛋白質(zhì)的合成率，通過(guò)檢測(cè)氨基酸分解的關(guān)鍵酶基因表達(dá)狀況可以一定程度判斷體內(nèi)氨基酸代謝情況[11]，本文選擇檢測(cè)支鏈α-酮酸脫氫酶二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰基酶(BCKD-E2)的基因表達(dá)變化。

大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)是世界范圍內(nèi)重要的海水養(yǎng)殖肉食性性魚類[9,12-13]，也是中國(guó)北方重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，其飼料蛋白需求量高，大概為50%左右，因此本論文選擇大菱鲆作為研究對(duì)象。課題組前期研究結(jié)果顯示，復(fù)合植物蛋白源替代大菱鲆幼魚飼料魚粉比例超過(guò)40%時(shí)顯著降低魚類生長(zhǎng)性能[14]，且玉米蛋白粉單一替代鲆鰈魚類飼料魚粉蛋白超過(guò)40%時(shí)，對(duì)生長(zhǎng)有顯著負(fù)面影響[8,15]。因此，本研究選擇45%替代水平的玉米蛋白粉作為實(shí)驗(yàn)飼料，研究其在影響魚體生長(zhǎng)的情況下對(duì)魚體生理生化指標(biāo)、組織游離氨基酸含量和氨基酸分解代謝的影響，以探究植物蛋白源在魚體中引起的生理應(yīng)答狀態(tài)的變化，以期為植物蛋白源在肉食性魚類飼料中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以魚粉(OPENCA，秘魯)和谷朊粉為主要蛋白源，魚油、棕櫚油和大豆卵磷脂為主要脂肪源，配制粗蛋白約50%，粗脂肪約11.5%的對(duì)照組飼料(FM)。以玉米蛋白粉(CG)(七好生物科技有限公司，中國(guó))替代FM組45%魚粉蛋白，設(shè)計(jì)等氮等能的植物蛋白源替代組飼料，實(shí)驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1，2組飼料氨基酸組成見(jiàn)表2。

飼料原料粉碎后過(guò)80目篩網(wǎng)，將粉碎好的原料按飼料配方由小到大逐一混合均勻，然后與油脂充分混合，最后再加入大約30%蒸餾水揉勻后制粒。烘干且待冷卻后，用雙層塑料袋包裝并封口，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程與管理

大菱鲆幼魚為當(dāng)年人工培育的同一批苗種，購(gòu)于山東省海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在山東省海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)公司養(yǎng)殖基地進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前，以兩處理組實(shí)驗(yàn)飼料的等量混合物作為暫養(yǎng)料暫養(yǎng)2周，使魚逐漸適應(yīng)水環(huán)境和實(shí)驗(yàn)飼料。

實(shí)驗(yàn)開始前，將暫養(yǎng)魚饑餓24h，然后用丁香酚麻醉(1∶10000)(上海試劑公司)。之后隨機(jī)抽取100尾魚稱重作為初始魚體重((9.19±0.01)g)。選擇大小均勻、體格健壯、無(wú)損傷的大菱鲆隨機(jī)分到6個(gè)養(yǎng)殖桶(玻璃纖維，500L),每桶放養(yǎng)40尾魚。每組飼料隨機(jī)投喂3個(gè)養(yǎng)殖桶的實(shí)驗(yàn)魚，并于每天2次(07:00和19:00)投喂大菱鲆至表觀飽食，投喂1h后記錄每頓的殘餌數(shù)量。投喂后換水70%左右。如有死魚,記錄數(shù)量、重量和癥狀。養(yǎng)殖采用室內(nèi)長(zhǎng)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)，整個(gè)養(yǎng)殖期間均采用24h連續(xù)充氧，遮蔽所有窗戶、關(guān)閉燈光(投喂期間除外)以降低室內(nèi)光線強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)期間水溫保持在16～19℃。

1.3 樣品采集

分魚期間，隨機(jī)抽取20尾實(shí)驗(yàn)魚作為初始魚，樣品置-20℃冰箱保存待用。30d養(yǎng)殖結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)魚饑餓24h后稱重，記錄每桶魚的數(shù)量和重量，分別隨機(jī)從每桶中抽取6尾魚，用于常規(guī)分析，置-20℃冰箱保存。其它魚繼續(xù)饑餓24h，共饑餓48h，以使各組魚代謝均達(dá)到均勻穩(wěn)定水平[16]。然后重新投喂各自飼料至表觀飽食狀態(tài)，在投喂后8和24h分別隨機(jī)取樣，確保所取的魚均為充分?jǐn)z食的魚即胃腸中充滿食物的魚，否則棄用。2個(gè)時(shí)間點(diǎn)魚均抽取尾靜脈血于肝素鈉抗凝管中，靜置后3000g離心5min，吸取上層血漿后分裝，放于液氮保存。投喂后8h時(shí)，在抽完血的魚背部相同位置割下一塊肌肉放離心管中，置液氮中保存，用于檢測(cè)肌肉中的游離氨基酸含量。在禁食8h時(shí)，每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)取4尾魚用于分子實(shí)驗(yàn)的分析，每2尾魚的樣品放于1個(gè)離心中，每個(gè)處理共取6份獨(dú)立樣品(n=6)；采用頸椎切斷法殺死實(shí)驗(yàn)魚，剝?nèi)∧c，在生理鹽水中快速?zèng)_洗掉食物殘?jiān)?置離心管中放于液氮保存；每尾魚在背部相同位置割下一塊肌肉置離心管中放于液氮保存；取樣結(jié)束后所有樣品置-80℃冰箱中保存待用。

表1　實(shí)驗(yàn)飼料配方及化學(xué)組成(干物質(zhì))

Nate:1礦物質(zhì)混合物Mineral premix(mg/kg)：CoCl2·6H2O (1%), 50; CuSO4·5H2O (25%), 10; FeSO4·H2O (30%), 80; ZnSO4·H2O (34.5%), 50; MnSO4·H2O(31.8%), 45; MgSO4·7H2O(15%), 1200; Sodium selenite (1%), 20; Calcium iodine (1%) 60; Zoelite, 11470。

2維生素混合物Vitamin premix(mg/kg)：Thiamin (98%), 25; Riboflavin (80%), 45; Pyridoxine-HCl (99%), 20; Vitamin B12 (1%), 10;Vitamin K3 (51%), 10; Inositol(98%), 800; Pantothenic acid(98%), 60; Niacin acid(99%), 200; Folic acid(98%), 20; Biotin(2%), 60; Retinol acetate(500000IU/g), 32; Cholecalciferol(500000IU/g), 5 mg; Alpha-tocopherol(50%), 240; Ascorbic acid(35%), 2000; Anti-oxidants (Oxygen ling grams, 100%), 3; Rice husk powder (100%), 11470。

3其它：啤酒酵母2%，氯化膽堿0.25%，防霉劑0.1%，抗氧化劑0.05%，誘食劑(甜菜堿∶二甲基-β -丙酸噻亭∶甘氨酸∶丙氨酸∶5-磷酸肌苷=4∶2∶2∶1∶1) 1.0%。Others: Beer yeast 2%, Choline Chloride 0.25%, Mold inhibitor 0.1%, Antioxidant 0.05%, Attractant (Betaine∶Dimethyl-propiothetin∶Glycine∶Alanine∶5-phosphate inosine = 4∶2∶2∶1∶1) 1.0%.

表2　實(shí)驗(yàn)飼料氨基酸組成(干物質(zhì))

1.4 生化分析

飼料原料、飼料和全魚常規(guī)組成測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[17]。樣品在105℃烘干24h，檢測(cè)水分；凱氏定氮法(N×6.25)檢測(cè)粗蛋白；索氏抽提法檢測(cè)粗脂肪；550℃馬弗爐高溫灼燒法檢測(cè)灰分。使用絕熱式熱量計(jì)(C2000；IKA werke，Germany)檢測(cè)飼料能量。

1.5 血漿生化指標(biāo)檢測(cè)

檢測(cè)攝食后24h實(shí)驗(yàn)魚血漿中的總蛋白、葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇含量。使用全自動(dòng)生化分析儀(Biomix-800，Sysmex，Japan)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)所需試劑購(gòu)自Sysmex Corporation。

1.6 氨基酸檢測(cè)

1.6.1 原料和飼料氨基酸的檢測(cè)準(zhǔn)確稱取20～40mg樣品雙份于25mL水解管中，酸水解方法制得水解液[18]。含硫氨基酸蛋氨酸和胱氨酸的檢測(cè)，必需先用過(guò)硫酸氧化，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的氧化物蛋氨酸砜和磺基丙氨酸，再進(jìn)行檢測(cè)[19]，使用全自動(dòng)氨基酸檢測(cè)儀(L-8900，Hitachi，Japan)檢測(cè)氨基酸含量，色譜柱為鈉離子交換柱。

1.6.2 組織游離氨基酸的檢測(cè)檢測(cè)攝食后8h的實(shí)驗(yàn)魚血漿和肌肉中游離氨基酸的含量。使用全自動(dòng)氨基酸檢測(cè)儀(L-8900，Hitachi，Japan)檢測(cè)氨基酸含量，色譜柱為鋰離子交換柱。

從-80℃中取出血漿置4℃冰箱中解凍，待血漿融化后，取0.4mL血漿置于2mL離心管中，加入1.2mL 10%磺基水楊酸，二者充分混勻靜置5min，13000r/min 4℃ 離心15min，用1mL注射器吸取上清，0.22μm濾膜過(guò)濾加入上樣管中，檢測(cè)血漿中游離氨基酸濃度[20]。

從-80℃中取出肌肉樣品置4℃冰箱中解凍，待融化后，準(zhǔn)確稱取1g肌肉置于5mL離心管中，加入3mL 10%磺基水楊酸，勻漿破碎后取1.5mL勻漿液，13000r/min 4℃離心15min，取上清用0.22μm濾膜過(guò)濾,檢測(cè)肌肉中游離氨基酸濃度[21]。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)

腸和肌肉總RNA提取采用Trizol試劑(Invitrogen，USA)，具體操作過(guò)程參考李明珠[22]的方法。使用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TAKALA，Japan)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。使用SYBR? Primix Ex TaqTM(TAKALA，Japan)進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程與條件參照Z(yǔ)uo等[23]。目的基因BCKD-E2(branch-chain α-keto acid dehydrogenase dihydrolipoyl transacylase)引物序列為：上游引物，CTGCTCAGCGTGTTGGATG；下游引物，GAGGGAGAATCACTGGTTTGG。內(nèi)參基因選擇GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，引物序列為：上游引物，AGCAGCAGCCATGTCAGACC；下游引物，TTGGGAGACCTCACCGTTGTAAC；且2個(gè)處理組間內(nèi)參基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異(結(jié)果未列出)。定量數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量中的2-△△Ct分析，要使此分析方法有效，目的基因和內(nèi)參基因的引物擴(kuò)增效率必須一致且接近1[22]，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蚺c內(nèi)參基因擴(kuò)展效率一致。采用2-ΔΔCt方法測(cè)定目的基因的表達(dá)量，計(jì)算各處理組目的基因的表達(dá)量。計(jì)算公式為：

△△Ct=△Ct(處理組)-△△Ct(對(duì)照組);

△Ct(處理組)=

Ct(處理組目的基因)-Ct(處理內(nèi)參基因);

△Ct(對(duì)照組)=

Ct(對(duì)照組目的基因)-Ct(對(duì)照內(nèi)參基因)。

1.8 相關(guān)指標(biāo)計(jì)算和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=100×(ln終末體重-ln初始體重)/養(yǎng)殖天數(shù)。

攝食量(FI，%/d)=100×總攝食量/[養(yǎng)殖天數(shù)×(初始體重+終末體重)/2]。

飼料效率(FE)=魚體濕增重(g)/總攝食量(g)。

蛋白質(zhì)效率(PER)=魚體濕增重(g)/蛋白質(zhì)攝入量(g)。

營(yíng)養(yǎng)沉積率=100×[(終末體重×終末魚體營(yíng)養(yǎng)成分含量)-(初始體重×初始魚體營(yíng)養(yǎng)成分含量)]/營(yíng)養(yǎng)攝入量。

式中，營(yíng)養(yǎng)指蛋白質(zhì)和脂肪。

成活率(SR，%)=100×(終末魚數(shù)量/初始魚數(shù)量)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(M±SE)表示，采用SPSS 16.0版軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)作單因子方差分析(ANOVA)，且數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若處理間有顯著差異，再作Tukey’s多重比較，P<0.05表示處理間差異性顯著。

2結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)和飼料利用

如表3所示，與魚粉組(FM)相比，玉米蛋白粉替代45%魚粉蛋白(CGM)極顯著降低大菱鲆幼魚的終末體重(FBW)、定生長(zhǎng)率(SGR)、飼料效率(FE)、蛋白質(zhì)效率(PER)、蛋白質(zhì)沉積率和脂肪沉積率(P<0.01)，其中以脂肪沉積率降低幅度最大，下降98.85%±075%。攝食量(FI)和成活率(SR)在各處理組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.2 全魚體組成

由表4可知，CGM組的水分和灰分含量極顯著高于FM組(P<0.01)，但粗蛋白和粗脂肪含量極顯著低于FM組(P<0.01)。

表3　生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)利用

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3)。Values are means±SE (n=3).

①Initoal body weight； ②Final body weight；③Specific growth rate； ④Feed intake； ⑤Feed efficiency； ⑥Protein efficiency； ⑦Protein retention； ⑧Fat retention； ⑨Percentge of survival

表4　攝食不同飼料對(duì)大菱鲆幼魚體成分的影響(濕重)

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3)。Values are means ± SE (n=3).

2.3 血漿生化指標(biāo)

由表5中結(jié)果可知，F(xiàn)M組血漿總蛋白和葡萄糖(GLU)含量顯著高于CGM組(P<0.05)，而甘油三酯和總膽固醇(TCHO)含量均極顯著高于CGM組(P<0.01)。

表5　攝食不同飼料對(duì)大菱鲆幼魚血漿指標(biāo)的影響

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3)。 Values are means ± SE (n=3).

①Total protein； ②Glucose； ③Triglyceride； ④Total cholesterol

2.4 血漿游離氨基酸組成

表6結(jié)果表明，大菱鲆攝食CGM組飼料8h后，血漿游離單一必需氨基酸(EAA)Thr、Ile、Leu和Phe均較FM組顯著降低(P<0.05)，且游離總EAA含量也出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。而對(duì)于CGM組的血漿游離單一非必須氨基酸(NEAA)，除Ala和Pro外，其它氨基酸均顯著低于FM組(P<0.05)，且游離總NEAA也較FM組顯著降低(P<0.05)。與FM組相比，CGM組也顯著降低血漿總游離氨基酸(TAA)含量(P<0.05)。

表6　攝食不同飼料對(duì)大菱鲆幼魚血漿游離氨基酸組成的影響

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3)。 Values are means ± SE (n=3).

2.5 肌肉游離氨基酸組成

表7結(jié)果表明，大菱鲆攝食CGM組飼料8h后，除肌肉Phe外，其它游離單一必需氨基酸(EAA)含量均較FM組顯著降低：其中His顯著降低(P<0.05)，而其它氨基酸均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，且游離總EAA含量也極顯著降低(P<0.01)。而對(duì)于CGM組的肌肉游離單一非必須氨基酸(NEAA)，除Gly外，其它氨基酸均顯著低于FM組(P<0.05)，且游離總NEAA也較FM組極顯著降低(P<0.01)。與FM組相比，CGM組也極顯著降低肌肉TAA(P<0.01)。

表7　攝食不同飼料對(duì)大菱鲆幼魚肌肉游離

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3)。Values are means ± SE (n=3).

2.6 支鏈氨基酸分解關(guān)鍵酶基因表達(dá)變化

如圖1所示，腸道中CGM組支鏈α-酮酸脫氫酶二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰基酶(BCKD-E2)表達(dá)量較FM組極顯著提高(P<0.01)，而肌肉中兩處理組BCKD-E2表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

(以GAPDH作為內(nèi)參，CMG處理組目的基因表達(dá)量以FM組的數(shù)值作為參照求比值，將FM組的數(shù)值設(shè)為1，得到替代組的各數(shù)值。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=6)表示，全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，進(jìn)行Tukey’s多重比較檢驗(yàn)，分析結(jié)果標(biāo)注在各圖上方(*:P<0.05; **:P<0.01)。Transcription levels were normalized by the reference gene GAPDH. Target gene of CGM group were normalized to the corresponding expression levels of FM sample. Results are expressed as mean ± SE (n=6) and were analyzed by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple range test (*:P<0.05; **:P<0.01).)

圖1攝食不同飼料對(duì)大菱鲆幼魚BCKD-E2基因表達(dá)的影響

Fig.1BCKD-E2 mRNA levels of juvenile turbot fed the experimental diets

3討論

研究結(jié)果表明，玉米蛋白粉替代45%飼料魚粉蛋白后，顯著降低了大菱鲆幼魚的特定生長(zhǎng)率(SGR)和飼料效率(FE)。這與其它學(xué)者在大菱鲆上的植物蛋白源替代研究結(jié)果一致，當(dāng)玉米蛋白粉[8]或大豆?jié)饪s蛋白[12]替代飼料魚粉蛋白比例接近50%時(shí)，SGR和FE均顯著性降低。另外，在其它肉食性魚類，如紅鰭東方鲀[24]、尖吻鱸[3]和條石鯛[25]上的結(jié)果表明，當(dāng)非魚粉蛋白源單一替代飼料中的魚粉比例超過(guò)50%時(shí)，F(xiàn)E和蛋白質(zhì)效率(PER)均降低。一方面，植物蛋白源的生物學(xué)價(jià)值低于魚粉，如玉米蛋白粉富含Leu但缺乏Lys，豆粕中嚴(yán)重缺乏Met，且Lys為第二限制性氨基酸。另一方面，F(xiàn)E和PER的降低與蛋白質(zhì)的消化率低有關(guān)。Regost等[8]發(fā)現(xiàn)，大菱鲆對(duì)添加玉米蛋白粉的飼料消化率隨玉米蛋白粉替代量的升高而降低。在其它魚類尤其是肉食性魚類中，玉米蛋白粉的蛋白質(zhì)消化率往往低于魚粉[26-27]。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)玉米蛋白粉替代45%飼料魚粉蛋白后，顯著降低蛋白質(zhì)沉積率(PR)和脂肪沉積率(FR)。已知營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沉積率與養(yǎng)殖期間機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加量相關(guān)，也就意味著當(dāng)非魚粉蛋白源替代魚粉后導(dǎo)致魚體蛋白質(zhì)和脂肪的合成均降低。因此我們認(rèn)為，植物蛋白源替代魚粉后引起魚體內(nèi)新陳代謝平衡的混亂，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)和脂肪沉積率的降低[14,28]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

當(dāng)玉米蛋白粉單一替代魚粉后，顯著降低魚體粗蛋白含量。這與Rogost的研究結(jié)果不一致，Rogost的結(jié)果顯示即使玉米蛋白粉100%替代大菱鲆飼料中的魚粉也未對(duì)魚體粗蛋白產(chǎn)生影響[8]。分析原因可能是由于實(shí)驗(yàn)魚的大小不同，對(duì)同一蛋白源的耐受性不同。另一方面，玉米蛋白粉替代45%魚粉蛋白后，極顯著的降低了魚體粗脂肪含量，且脂肪沉積率也大幅度降低。這與東方紅鰭豚[24]、金頭鯛[29]和尖吻鱸[3]上植物蛋白源替代結(jié)果一致，表明當(dāng)植物蛋白源替代魚粉比例過(guò)高，將影響魚類體脂積累。

本研究表明，當(dāng)玉米蛋白粉替代魚粉后，血漿總蛋白顯著降低，變化趨勢(shì)與全魚粗蛋白變化一致，說(shuō)明大菱鲆整體蛋白質(zhì)代謝發(fā)生變化。替代組的葡萄糖含量也較魚粉組降低，與其它魚類中的研究結(jié)果一致[29-31]，說(shuō)明非魚粉蛋白源替代后影響了魚類的能量代謝過(guò)程。與體脂肪含量變化一致，各替代組的血漿甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCHO)含量均低于魚粉對(duì)照組，這也進(jìn)一步說(shuō)明非魚粉蛋白源替代魚粉后，極大的抑制了脂肪代謝過(guò)程。Lim等[24]推測(cè)，血漿TG和TCHO含量的降低是由于植物蛋白源中的多酚(黃烷醇類、黃酮類、黃酮醇類等的混合物)導(dǎo)致。然而，在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用醇洗大豆蛋白除去其中的異黃酮后，小鼠血漿中膽固醇含量仍顯著降低，且脂肪酸合成途徑也處于被抑制狀態(tài)。Takahashi和Ide[32]認(rèn)為大豆蛋白本身比其原料中的異黃酮對(duì)降低肝臟脂肪生成作用更為重要，而異黃酮在調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和脂肪組織基因表達(dá)中發(fā)揮作用。而Yun等[13,33]在高植物蛋白飼料中添加膽固醇，發(fā)現(xiàn)大菱鲆幼魚血漿和肝臟中膽固醇含量的升高與飼料中膽固醇含量有較高的相關(guān)性，因此提出植物蛋白源降低機(jī)體膽固醇的作用是由于植物中本身膽固醇含量較低的緣故。

已有研究表明，當(dāng)虹鱒[18]攝食飼料后，分別在肝靜脈和背動(dòng)脈取血，發(fā)現(xiàn)血漿游離氨基酸(FAA)在攝食后快速升高，總FAA均在攝食后6h達(dá)峰值，而各FAA的峰值出現(xiàn)在6～12h之間，在大西洋鱈魚[34]中的研究也得到了類似結(jié)果。因此本試驗(yàn)選擇在大菱鲆幼魚中攝食后8h取樣。結(jié)果表明，玉米蛋白粉替代飼料魚粉蛋白后，顯著降低了血漿中4種游離必需氨基酸(EAA)的含量，且多數(shù)游離非必需氨基酸(NEAA)也有降低，因此我們認(rèn)為植物蛋白源必需氨基酸的不平衡干擾了非必需氨基酸的吸收。早前研究已經(jīng)證明了飼料中必需氨基酸模式與組織FAA濃度的關(guān)系，我們的結(jié)果與之一致[8,35]。這說(shuō)明血漿游離氨基酸組成受飼料蛋白質(zhì)質(zhì)量影響。分析原因，可能是由于肉食性魚類對(duì)植物蛋白的消化率低，且多數(shù)必需氨基酸的可利用性也低于魚粉[27,36]。肌肉是體內(nèi)重要的游離氨基酸貯存庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，替代組中肌肉各FAA較魚粉組下降幅度更大，在血漿中與對(duì)照組無(wú)差異的氨基酸，在肌肉中出現(xiàn)了顯著性降低，說(shuō)明肌肉氨基酸庫(kù)對(duì)飼料蛋白質(zhì)質(zhì)量更加敏感。在動(dòng)物快速生長(zhǎng)時(shí)期，骨骼肌的快速生長(zhǎng)主要由餐后蛋白質(zhì)高合成率決定，由攝食后機(jī)體中升高的氨基酸和胰島素調(diào)節(jié)[37]。因此當(dāng)非魚粉蛋白源替代魚粉后降低了肌肉中FAA含量，從而抑制蛋白質(zhì)的合成代謝，導(dǎo)致生長(zhǎng)減緩。

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)玉米蛋白粉替代魚粉，腸道支鏈氨基酸分解途徑關(guān)鍵酶支鏈α-酮酸脫氫酶二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙?；?BCKD-E2)mRNA表達(dá)量較魚粉組顯著升高。因此，腸吸收了消化道中組成不平衡的氨基酸，導(dǎo)致腸中支鏈氨基酸分解代謝加劇[38]，從而進(jìn)一步加劇了血漿中氨基酸的不平衡程度。因此，盡管玉米蛋白粉中富含亮氨酸(Leu)，但是其血漿中Leu含量仍較魚粉組顯著降低。

綜上所述，玉米蛋白粉單一替代45%魚粉蛋白可顯著降低魚類生長(zhǎng)性能和飼料利用。玉米蛋白粉替代魚粉干擾了魚體蛋白質(zhì)、脂肪的沉積，使蛋白質(zhì)尤其是脂肪的沉積率降低。飼料氨基酸的不平衡，加劇了腸道中EAA的氧化消耗，從而進(jìn)一步降低機(jī)體組織中氨基酸的平衡程度，表現(xiàn)為血漿和肌肉中FAA含量出現(xiàn)顯著性降低，肌肉中FAA降低幅度更大。對(duì)于植物蛋白源替代魚粉后組織游離氨基酸庫(kù)變化對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)答，三大營(yíng)養(yǎng)素代謝變化的機(jī)制，有待深入研究。

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責(zé)任編輯朱寶象

Effects of Partial Replacement of Fish Meal with Corn Gluten Meal on Growth Performance and Free Amino Acid Metabolism of Juvenile Turbot (ScophthalmusmaximusL.)

XU Dan-Dan, HE Gen, ZHOU Hui-Hui, SONG Fei

(The Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feeds, Ministry of Agriculture; The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract：The study was conducted to investigate the effects of the partial substitution of dietary fish meal by corn gluten meal on growth performance, plasma metabolites, tissue amino acid concentration, and branch-chain α-keto acid dehydrogenase dihydrolipoyl transacylase (BCKD-E2) mRNA level of juvenile turbot, Scophthalmus maximus L. (initial weight (9.19±0.01)g). Two isonitrogenous and isoenergetic diets were designed based on fish meal (FM) and corn gluten meal replacing 45% of fish meal protein (CGM). Each diet was randomly allocated to triplicate groups of juvenile turbots for 30 days. The results showed that corn gluten meal replacing 45% of fish meal protein resulted in significantly decreased financial body weight (FBW), specific growth rate (SGR), feed efficiency (FE), protein efficiency ratio (PER), protein and fat retention (PR and FR), as well as whole body crude protein and lipid content (P<0.01), while feed intake (FI) and survival rate (SR) were not affected by both two diets. However, compared with FM diet, fish fed CMG diet greatly increased whole body moisture and ash content (P<0.01). Fish meal was replaced by corn gluten meal resulted in the reduction of plasma total protein (TP), glucose (GLU), triglycerides (TG) and total cholesterol (TCHO) (P<0.05). Plasma and muscle free amino acid patterns were affected by dietary protein sources and showed significant low levels in fish fed CGM diet, especially in muscle except phenylalanine and glycine, all of the essential and non-essential amino acids were markedly lower in CMG diet than that FM diet (P<0.05). Compared with FM diet, CGM diet significantly increased BCKD-E2 mRNA level in intestine (P<0.01). Thus, this study suggested that 45% substitution of fish meal by corn gluten meal significantly decreased growth performance, feed utilization, affected global nutrient composition and metabolism, increased intestinal amino acid catabolism, and impaired tissue amino acid balance and concentration in juvenile turbot. The present study indicates that the poor growth performance of corn gluten meal incorporated diet may be mainly due to the lower free amino acid concentration in fish tissues after feeding.

Key words:Turbot; corn gluten meal; replacement; amino acid; gene expression

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20140408

中圖法分類號(hào)：S963.16

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5174(2016)02-026-09

作者簡(jiǎn)介：許丹丹(1986-)，女，博士。E-mail：dandxu2008@163.com??通訊作者： E-mail:hegen@ouc.edu.cn

收稿日期：2014-12-12；

修訂日期：2015-02-15

基金項(xiàng)目：? 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31222055)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2014CB138602)資助

引用格式：許丹丹， 何艮， 周慧慧， 等. 玉米蛋白粉部分替代魚粉對(duì)大菱鲆幼魚的生長(zhǎng)性能和游離氨基酸代謝的影響[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2016, 46(2)： 26-34.

Supported by National Natural Science Foundation of China (31222055); National Program on Key Basic Research Projects(2014CB138602)