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      高海拔地區(qū)進(jìn)展期胃癌切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1 mRNA及蛋白表達(dá)與化療療效的相關(guān)性研究*

      2016-03-26 03:56:11祁玉娟韓靜綺才保加駱玉霜冀保妍袁青玲宋曉燕張文彥白麗艷劉五甲青海省人民醫(yī)院青海西寧80007青海大學(xué)附屬醫(yī)院青海西寧8000青海大學(xué)青海西寧8006
      關(guān)鍵詞:高海拔地區(qū)進(jìn)展期胃癌化療

      祁玉娟,韓靜綺,才保加,駱玉霜,冀保妍,袁青玲,宋曉燕,張文彥,白麗艷,劉五甲(.青海省人民醫(yī)院,青海西寧80007;.青海大學(xué)附屬醫(yī)院,青海西寧8000;.青海大學(xué),青海西寧8006)

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      高海拔地區(qū)進(jìn)展期胃癌切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1 mRNA及蛋白表達(dá)與化療療效的相關(guān)性研究*

      祁玉娟1,韓靜綺2,才保加2,駱玉霜2,冀保妍1,袁青玲1,宋曉燕1,張文彥1,白麗艷3,劉五甲3
      (1.青海省人民醫(yī)院,青海西寧810007;2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院,青海西寧810001;3.青海大學(xué),青海西寧810016)

      摘要:目的研究高海拔地區(qū)進(jìn)展期胃癌切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)mRNA和蛋白表達(dá),及其與化療療效的相關(guān)性。方法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)60例進(jìn)展期胃癌患者ERCC1 mRNA的表達(dá),免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ERCC1蛋白的表達(dá)并予以FOLFOX4方案化療,分析ERCC1 mRNA及蛋白表達(dá)與化療客觀反應(yīng)率(ORR)和無進(jìn)展生存期(PFS)的相關(guān)性。結(jié)果進(jìn)展期胃癌ERCC1 mRNA的表達(dá)與化療療效(ORR)、PFS呈負(fù)相關(guān)(P=0.038和0.032);ERCC1蛋白表達(dá)與FOLFOX4化療療效(ORR)無關(guān)(P= 0.089),與PFS呈負(fù)相關(guān)(P=0.039)。結(jié)論高海拔地區(qū),進(jìn)展期胃癌ERCC1 mRNA與化療療效呈負(fù)相關(guān),ERCC1蛋白表達(dá)與化療療效無關(guān);ERCC1 mRNA及蛋白表達(dá)與PFS呈負(fù)相關(guān)。

      關(guān)鍵詞:進(jìn)展期胃癌;切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1;化療;高海拔地區(qū)

      胃癌在中國屬高發(fā)腫瘤,其死亡率占所有惡性腫瘤的23.02%,青海、寧夏、甘肅3省的胃癌死亡率超過35/10萬。青海省西寧市海拔2295m,地處西北地區(qū),胃癌具有發(fā)病率高、手術(shù)切除率低、生存期短、死亡率高等特點(diǎn)。大部分患者就診時(shí)已屬進(jìn)展期,無手術(shù)機(jī)會(huì);化療是胃癌治療的重要手段之一,是胃癌綜合治療的重要組成部分[1]。目前為止,鉑類及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)為治療胃癌的基本用藥。本研究探討高海拔地區(qū)進(jìn)展期胃癌切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross-complementation group 1,ERCC1)mRNA和蛋白表達(dá)水平,及其與化療療效的相關(guān)性。

      1 資料與方法

      1.1研究對(duì)象

      選取2010年12月-2013年12月本院經(jīng)病理學(xué)檢查確診的進(jìn)展期胃癌70例進(jìn)行研究。入選標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)證實(shí)具有可測(cè)量腫瘤病灶;②距離最后一次放化療≥3個(gè)月;③化療前血常規(guī)、肝、腎功能在正常范圍內(nèi);④心電圖正常;⑤美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)評(píng)分≤2分。排除標(biāo)準(zhǔn):①ECOG評(píng)分≥3分;②腫瘤病灶不可測(cè)量;③風(fēng)濕瓣膜性心臟病及器質(zhì)性心臟病。入選患者手術(shù)切除的腫瘤組織置于-196℃液氮中保存,部分組織經(jīng)過梯度酒精及二甲苯脫水后包埋于石蠟中,制備組織的石蠟標(biāo)本。

      所有患者有CT、B超及MRI證實(shí)的可測(cè)量腫瘤病灶。其中4例失訪,3例不能按規(guī)定評(píng)估療效,3例因不良反應(yīng)未完成規(guī)定的治療方案。最終60例患者符合標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。60例患者中,男性39例(65%),女性21例(35%);年齡<55歲22例(36.7%),≥55歲38例(63.3%);體力評(píng)價(jià):0分40例(66.7%),1、2分20例(33.3%)。病理類型:腺癌46例(76.7%),黏液癌5例(8.3%),印戒細(xì)胞癌7例(11.7%),其他2例(3.3%);分化程度:中、高分化23例(38.3%),低分化34例(56.7%),其他3例(5.0%);民族:漢族49例(81.7%),回族6例(10%),藏族3例(5%),蒙古族2例(3.3%)。所有患者系長期居住高海拔地區(qū)(海拔2 200 m左右)。

      1.2方法

      1.2.1化療方案和療效評(píng)價(jià)所有患者采用FOLFOX4方案治療。奧沙利鉑(連云港江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,商品名:艾恒)85 mg/m2,第1天靜脈滴注2 h;亞葉酸鈣200 mg/m2,第1、2天化療前靜脈滴注2 h;5-氟尿嘧啶400 mg/m2,第1、2天靜脈沖入;5-氟尿嘧啶600 mg/m2,第1、2天靜脈持續(xù)泵入,14 d為1個(gè)周期。治療前l(fā)周完成各項(xiàng)基線檢查。近期療效的評(píng)價(jià)按照實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors,RECIST),分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(complete response,PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease,SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease,PD)。以CR+PR為客觀緩解率(objective response rate,ORR)。腫瘤無進(jìn)展生存期(progress free survival,PFS)從治療開始計(jì)算,終止日期為局部區(qū)域復(fù)發(fā)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或末次隨訪日。每?jī)蓚€(gè)周期評(píng)價(jià)療效1次,若出現(xiàn)可能為病情進(jìn)展的臨床表現(xiàn)可提前評(píng)價(jià)療效。所有患者進(jìn)行隨訪。

      1.2.2ERCC1蛋白檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidinperosidase,SP)檢測(cè)胃癌石蠟切片組織中ERCC1的表達(dá)。ERCC1鼠抗人多克隆抗體為ab43(美國Abcam公司)。組織切片經(jīng)高壓處理,修復(fù)暴露抗原。每批染色設(shè)陽性和陰性對(duì)照,以已知陽性切片作陽性對(duì)照組,以磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)代替一抗作空白對(duì)照組,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色。免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[2],采用二級(jí)評(píng)分法進(jìn)行,由2位病理醫(yī)師判定。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞。按顯色強(qiáng)度分為4級(jí):陰性(不著色)、弱陽性(著淡黃色)、陽性(著棕黃色)及強(qiáng)陽性(著棕褐色或者出現(xiàn)粗大的棕褐色顆粒),0~3分分別代表不同顯色強(qiáng)度。同時(shí)計(jì)算陽性腫瘤細(xì)胞百分?jǐn)?shù),對(duì)陽性腫瘤細(xì)胞比例評(píng)分(陽性細(xì)胞0%為0.0分,1%~9%為0.1分,10%~49%為0.5分,>50%為1.0分),用陽性強(qiáng)度評(píng)分乘以陽性腫瘤細(xì)胞比例評(píng)分得到最后的半定量H值來衡量最終的蛋白表達(dá)強(qiáng)度。按照每個(gè)指標(biāo)各自中位H值來確定胃癌組織中指標(biāo)表達(dá)的高低。

      1.2.3ERCC1 mRNA檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)ERCC1 mRNA的表達(dá)。Trizol試劑一步法提取胃癌組織總RNA,檢測(cè)組織總RNA濃度及完整度,cDNA第一鏈合成,PCR擴(kuò)增ERCC1和內(nèi)參基因β-actin。ERCC1正向引物:5'-GCCTCC GCTACCACAACCT-3',反向引物:5'-TCTTCTCTTGA TGCGGCGA-3',產(chǎn)物長度313bp;β-actin正向引物:5'-CGGGACCTGACTGACTACCTC-3',反向引物:5'-TCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3',產(chǎn)物長度545 bp。引物由上海英駿生物工程公司合成。反應(yīng)體系為25μl,其中2μl cDNA模板,正、反向引物各1μl,2×PCR Master Mix 12.5μl,加雙蒸水至25μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min,96℃變性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),72℃繼續(xù)延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后,取5μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物加1μl加樣緩沖液在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。紫外光下觀察電泳結(jié)果,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

      1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

      采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn),生存分析用Kaplan-Meier法,各因素水平的比較用Log-rank法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1進(jìn)展期胃癌ERCC1蛋白及mRNA的表達(dá)

      ERCC1蛋白陽性表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞核內(nèi),呈棕黃色或棕紅色顆粒,偶見于胞漿內(nèi)。60例標(biāo)本中,ERCC1蛋白陽性表達(dá)率為35%。見圖1。

      圖1 進(jìn)展期胃癌組織中ERCC1陽性表達(dá)(免疫組織化學(xué)法×400)

      以一個(gè)內(nèi)體間標(biāo)記60例進(jìn)展期胃癌ERCC1 mRNA的表達(dá)變量,ERCC1/β-actin比率為0.160~0.821,中位比率為0.290。60例患者以中位值為界,分為ERCC1 mRNA高、低表達(dá)兩組。進(jìn)展期胃癌組織ERCC1 mRNA與β-actin表達(dá)見圖2。

      圖2 部分胃癌組織ERCC1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

      2.2ERCC1蛋白及mRNA表達(dá)與進(jìn)展期胃癌臨床特征的相關(guān)性

      60例胃癌檢測(cè)標(biāo)本中,ERCC1蛋白及mRNA的表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者臨床病理參數(shù),如不同年齡、性別、組織學(xué)類型及分級(jí)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、2。

      表1 進(jìn)展期胃癌臨床病理參數(shù)與ERCC1蛋白表達(dá)的相關(guān)性 例(%)

      2.3進(jìn)展期胃癌ERCC1蛋白與mRNA表達(dá)

      青海地區(qū)60例進(jìn)展期胃癌患者中,ERCC1蛋白陽性患者ERCC1 mRNA高表達(dá)為40%,ERCC1mRNA低表達(dá)為30%;ERCC1蛋白與mRNA的陽性表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

      續(xù)表1

      表2 進(jìn)展期胃癌臨床病理參數(shù)與ERCC1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 例(%)

      表3 進(jìn)展期胃癌中ERCC1 mRNA與蛋白表達(dá)的相關(guān)性例

      2.4ERCC1蛋白及mRNA表達(dá)與FOLFOX4化療療效的相關(guān)性

      所有60例患者完成≥4個(gè)周期的化療后進(jìn)行療效評(píng)價(jià)并4周后確認(rèn)。進(jìn)展期胃癌ERCC1蛋白表達(dá)與化療療效無關(guān)(P=0.089)(見表4);ERCC1蛋白陽性表達(dá)者ORR為19.0%,陰性者為43.6%。ERCC1 mRNA高表達(dá)ORR為20.0%,低表達(dá)為50.0%,ERCC1 mRNA的表達(dá)與化療療效呈負(fù)相關(guān)(P=0.038)(見表5)。

      2.5進(jìn)展期胃癌ERCC1蛋白及mRNA表達(dá)與FOLFOX4治療無進(jìn)展生存期的療效分析

      對(duì)完成化療方案的患者進(jìn)行隨訪。ERCC1蛋白陽性表達(dá)者無進(jìn)展生存期(6.24個(gè)月)較陰性者(7.23個(gè)月)短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)。以ERCC1 mRNA表達(dá)水平中位值為界,將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。ERCC1 mRNA低表達(dá)組的中位PFS為7.32個(gè)月,與高表達(dá)組的6.3個(gè)月比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)(見圖3)。Cox比例回歸模型將年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、ECOG評(píng)分等可能影響的因素進(jìn)行多步驟校正后發(fā)現(xiàn),ERCC1蛋白及mRNA表達(dá)仍然與PFS有關(guān)(P<0.05)。

      表4 高海拔地區(qū)進(jìn)展期胃癌化療療效與ERCC1蛋白表達(dá)的相關(guān)性 例(%)

      表5 高海拔地區(qū)進(jìn)展期胃癌化療療效與ERCC1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 例(%)

      圖3 進(jìn)展期胃癌ERCC1蛋白及mRNA表達(dá)與FOLFOX4化療后PFS

      3 討論

      ERCC1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類DNA損傷修復(fù)基因,是一種高度保守的單鏈DNA核酸內(nèi)切酶。定位于染色體19q13.2~13.3,包含10個(gè)外顯子,基因全長15×10 bp,編碼含297個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[3]?;瘜W(xué)藥物造成的DNA損傷主要通過核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NER)途徑修復(fù),目前已明確ERCC1基因是核苷酸切除修復(fù)的關(guān)鍵基因[4]。

      奧沙利鉑是第3代鉑類抗癌藥物,其形成的鉑-DNA復(fù)合物體積更大,能有更效地抑制DNA合成。然而腫瘤患者個(gè)體對(duì)草酸鉑的敏感性迥然不同,耐藥者與敏感者比較,生存期減少幾倍甚至十幾倍[5]。鉑類耐藥是因DNA的修復(fù)能力造成,其包含減少細(xì)胞毒的鉑-DNA復(fù)合物形成,以及與鉑-DNA復(fù)合物形成后防止細(xì)胞死亡[6]。其通過NER去除鉑類藥物導(dǎo)致DNA鏈內(nèi)加合物被認(rèn)為是鉑類藥物耐藥的主要機(jī)制[7],NER增強(qiáng)是導(dǎo)致順鉑耐藥的一個(gè)重要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力不同會(huì)導(dǎo)致其對(duì)草酸鉑的敏感性差異。

      Kwon等[8]對(duì)韓國進(jìn)展期胃癌患者接受奧沙利鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶化療的研究顯示,ERCC1蛋白陽性率為70.3%,ERCC1蛋白陰性表達(dá)者有更好的化療反應(yīng)率及長的無進(jìn)展總生存期(P=0.045和0.040)。Yun等[9]的一項(xiàng)對(duì)韓國進(jìn)展期胃癌患者行一線鉑類為基礎(chǔ)的療效及生存研究提示,ERCC1陽性表達(dá)率為66%,ERCC1陰性較ERCC1陽性患者有更高的治療反應(yīng)率(44% vs 28%),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.420),ERCC1的表達(dá)與總生存期無關(guān)(P= 0.570)。但是也有不一致的研究,Baek等[10]對(duì)韓國>Ⅱ期胃癌患者行鉑類術(shù)后輔助化療的研究表明,ERCC1蛋白陽性組的無病生存期和總生存期明顯較陰性組長。本研究結(jié)果顯示,ERCC1蛋白表達(dá)陽性率為35%;進(jìn)展期胃癌ERCC1蛋白表達(dá)與化療客觀有效率無關(guān),與無進(jìn)展生存期呈負(fù)相關(guān);青海地區(qū)ERCC1蛋白陽性率表達(dá)較低,其治療反應(yīng)差可能與本實(shí)驗(yàn)入組患者分期晚及低分化腺癌比例較高有關(guān),以及與不同地區(qū)胃癌的發(fā)病因素、發(fā)病機(jī)制及腫瘤的異質(zhì)性相關(guān),需要在以后的研究中擴(kuò)大病例、分層分析。

      黃朝暉等[11]在蘇州地區(qū)用半定量RT-PCR檢測(cè)62例胃癌組織ERCC1 mRNA表達(dá)水平的中位值為0.672;ERCC1 mRNA高表達(dá)組的無復(fù)發(fā)生存率和總生存率顯著低于低表達(dá)組(P<0.05)。多因素分析結(jié)果顯示,ERCC1 mRNA水平是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),與本研究結(jié)果相似,沒有顯示區(qū)域的差異。

      Matsubara等[12]報(bào)道,140例進(jìn)展期胃癌患者中43例接受鉑類為基礎(chǔ)的一線化療,結(jié)果表明,ERCC1 mRNA低表達(dá)化療反應(yīng)率為55.6%,高表達(dá)化療反應(yīng)率為18.8%(P=0.008),所有患者多變量生存分析顯示,ERCC1 mRNA高表達(dá)可預(yù)測(cè)不良預(yù)后。本研究顯示,在高海拔地區(qū),進(jìn)展期胃癌ERCC1 mRNA表達(dá)與化療客觀有效率、PFS呈負(fù)相關(guān)。但是也有不同的報(bào)道,Huang等[13]研究長沙地區(qū)實(shí)施DCF方案化療的48例進(jìn)展期胃癌患者,TUBB3、TS和ERCC1 mRNA采用多通路Branched-DNA液態(tài)芯片技術(shù)測(cè)定,ERCC1 mRNA的表達(dá)高低與化療反應(yīng)率、中位疾病進(jìn)展時(shí)間及中位總生存期無關(guān)。

      總之,本研究探討青海地區(qū)進(jìn)展期胃癌ERCC1蛋白及mRNA的表達(dá),分析其與化療的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)其與國內(nèi)外研究的不同之處,所以在以后的研究中,既要擴(kuò)大樣本研究,又要將不同民族、不同分期進(jìn)行分析,從而指導(dǎo)本地區(qū)進(jìn)展期胃癌的個(gè)體化治療。

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      (童穎丹編輯)

      Correlation of ERCC1 mRNA and protein expression in advanced gastric cancer with chemotherapy effect in high-altitude areas*

      Yu-juan Qi1, Jing-qi Han2, Bao-jia Cai2, Yu-shuang Luo2, Bao-yan Ji1, Qing-ling Yuan1, Xiao-yan Song1, Wen-yan Zhang1, Li-yan Bai3, Wu-jia Liu3
      (1.Qinghai Provincial Peoples' Hospital, Xining, Qinghai 810007, China; 2.The Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining, Qinghai 810001, China; 3.Qinghai University, Xining, Qinghai 810016, China)

      Abstract:Objective To investigate the values of mRNA and protein of excision repair cross-complementation group 1 (ERCC1) in predicting the prognosis of advanced gastric cancer patients treated with FOLFOX4 regime in high-altitude areas.Methods Seventy patients with advanced gastric cancer were enrolled in this study, 60 patients were eligible for analysis.All patients received FOLFOX4 regime repeated every two cycles.RT-PCR was used for analysis of ERCC1 mRNA; immunohistochemistry was used for analysis of ERCC1 protein expression.The relationships of mRNA and protein of ERCC1 with objective response rate (ORR) and progression-free survival (PFS) time were analyzed.Results ERCC1 mRNA expression was negatively associated with objective response rate (P= 0.038) and progression-free survival (P= 0.032).ERCC1 protein expression was not correlated with ORR of FOLFOX4 treatment (P= 0.089), but was negatively correlated with PFS (P= 0.039).Conclusions In high-altitude areas, the expression of ERCC1 mRNA in advanced gastric cancer patients is negatively correlated with PFS and ORR of FOLFOX4 treatment; the expression of ERCC1 proteinbook=1,ebook=82is not associated with ORR, but has correlation with PFS in advanced gastric cancer patients.

      Keywords:advanced gastric cancer; excision repair cross-complementation group 1; chemotherapy; highaltitude area

      *基金項(xiàng)目:青海省人力資源和社會(huì)保障廳2014年度留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目(No:青人社廳函2014-414)

      收稿日期:2015-09-14

      文章編號(hào):1005-8982(2016)01-0076-06

      中圖分類號(hào):R735.2

      文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

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