李敏王宇宏李巍

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基質(zhì)金屬蛋白酶2，9，12與慢性阻塞性肺疾病的臨床研究

李敏①王宇宏①李?、?/p>

【摘要】目的：探討慢性阻塞性肺疾?。–OPD）與血清基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP-12）的相關(guān)性。方法：選取COPD患者80例，其中急性加重期（AECOPD）40例，臨床緩解期40例，健康對(duì)照者45例，采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定所有研究對(duì)象的血清MMP-2、MMP-9、MMP-12含量，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：COPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平均明顯高于健康對(duì)照者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；且AECOPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平顯著高于臨床緩解期患者（P＜0.01）。穩(wěn)定期COPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與第1秒用力呼氣容積（FEV1）成負(fù)相關(guān)（r＝-0.529，P＜0.01；r＝-0.385，P＜0.05；r＝-0.627，P＜0.01）。結(jié)論：COPD患者血清MMP-2、MMP9、MMP-12水平均明顯升高，且與疾病嚴(yán)重程度成正相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】基質(zhì)金屬蛋白酶； 慢性阻塞性肺疾?。?第1秒用力呼氣容積

①吉林省吉林市中心醫(yī)院 吉林 吉林 132011

【Key words】 Matrix metalloproteinase； Chronic obstructive pulmonary disease； Forced expiratory volume in first second

First-author’s address：The Central Hospital of Jilin City，Jilin 132011，China

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是持續(xù)性氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病，其氣流受限呈可逆性進(jìn)行性進(jìn)展，與氣道和肺組織對(duì)香煙煙霧等有害氣體或顆粒的異常慢性炎癥反應(yīng)。COPD的發(fā)生與炎癥機(jī)制、蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激機(jī)制以及自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂、營(yíng)養(yǎng)不良等有關(guān)。氣道壁纖維化、細(xì)支氣管平滑肌增生和肺泡壁變薄、肺泡腔變大是COPD氣道重塑的主要病理特征。支氣管肺泡組織中彈性成分的降解是肺氣腫發(fā)生發(fā)展的最主要原因。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成與降解之間的平衡對(duì)維持肺泡結(jié)構(gòu)和肺功能具有重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是調(diào)節(jié)ECM的主要限速酶，在維持正常組織結(jié)構(gòu)、組織細(xì)胞分化、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、血管形成等多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1]。蛋白酶增加或抗蛋白酶不足均可以導(dǎo)致肺組織機(jī)構(gòu)的破壞，產(chǎn)生肺氣腫。自上個(gè)世紀(jì)60年代提出蛋白酶和抗蛋白酶失衡是導(dǎo)致COPD的重要機(jī)制以來(lái)，MMPs在COPD的發(fā)病過(guò)程中得到深入研究。本試驗(yàn)基于理論與基礎(chǔ)研究，通過(guò)測(cè)定COPD患者血清的MMP-2、MMP-9、MMP-12的水平，探索MMPs在COPD中的表達(dá)及其相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年12月-2014年12月在本院特診呼吸科住院的COPD患者80例，所有入選對(duì)象均按照《慢性阻塞性肺疾病指南》標(biāo)準(zhǔn)[2]，入組前均簽署知情同意書(shū)。按患者入院時(shí)病情輕重分為急性發(fā)作期（AECOPD）、臨床緩解期，其中急性加重期40例，臨床緩解期40例；男46例，女34例，平均年齡（72.00±11.00）歲。同時(shí)選取同期健康體檢對(duì)象45例作為健康對(duì)照組。詳細(xì)采集所有入選對(duì)象的一般資料及既往病史（性別、年齡、吸煙史、家族史），行心電圖、肺CT、肺功能、肝功、腎功能、心彩等檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性心、腦血管疾病、急性肺栓塞、風(fēng)濕結(jié)締組織疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全以及其他呼吸系統(tǒng)疾病以及惡性腫瘤等疾病患者。根據(jù)肺功能檢查結(jié)果，F(xiàn)EV1占預(yù)計(jì)值的百分比將臨床緩解期40例患者分為4組。輕度組，F(xiàn)EV1％ pred≥80％，共5例，平均年齡（65.56±8.23）歲；中度組，50％≤FEV1％ pred＜80％，共18例，平均年齡（68.30±9.18）歲；重度組，30％≤FEV1％ pred＜50％，共11例，平均年齡（72.66±9.34）歲。極重度組，F(xiàn)EV1％ pred＜30％，共6例，平均年齡（75.12±8.54）歲。健康對(duì)照組45例，平均年齡（61.24±9.54）歲。COPD組與對(duì)照組的年齡、性別、高血壓、吸煙、體重等基線資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法 所有研究對(duì)象于入院24 h內(nèi)抽取靜脈血3 mL，2000 r/min離心20 min收集上層血清，采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血清MMP-2、MMP-9、MMP-12含量。檢測(cè)試劑盒由上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，兩因素之間相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1COPD組與對(duì)照組血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平比較 COPD組患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），AECOPD組患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平均顯著高于臨床緩解期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1　COPD組與對(duì)照組血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平比較（±s） ng/mL

表1　COPD組與對(duì)照組血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平比較（±s） ng/mL

*P＜0.05，**P＜0.01，與對(duì)照組比較；△與臨床緩解期組比較，P＜0.05

組別　MMP-2　 MMP-9　 MMP-12 AECOPD組（n＝40）4.50±1.26**△5.02±1.34**△5.88±1.78**△臨床緩解期組（n＝40）3.07±0.65*　3.47±0.88*　3.32±0.89*對(duì)照組（n＝45）　1.31±0.43　 1.13±0.32　 0.94±0.27

2.2血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與FEV1相關(guān)性分析 穩(wěn)定期COPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與FEV1成負(fù)相關(guān)（r＝-0.529，P＜0.01；r＝-0.385，P＜0.05；r＝-0.627，P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2　血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與FEV1相關(guān)性分析（±s） ng/mL

表2　血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平與FEV1相關(guān)性分析（±s） ng/mL

組別　MMP-2　MMP-9　 MMP-12輕度組（n＝5）　1.50±1.09　 1.75±0.68　 1.24±1.02中度組（n＝18）　2.12±1.08　 2.02±1.05　 2.12±1.13重度組（n＝11）　2.40±1.27　 2.89±0.98　 4.02±1.28極重度組（n＝6）　3.96±1.39　 3.65±1.26　 4.46±1.49

3　討論

COPD是以ECM破壞、組織纖維化為特點(diǎn)的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病率及致殘率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，全球死因居于第四位。1992年在我國(guó)北部和中部地區(qū)對(duì)102 230名農(nóng)村成年人進(jìn)行調(diào)查，COPD患病率為3％；近年來(lái)對(duì)我國(guó)地區(qū)20 245名成年人進(jìn)行調(diào)查，COPD的患病率占40歲以上人群的8.2％，預(yù)計(jì)到2020年時(shí)COPD將占世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的第五位[3]。目前COPD發(fā)病機(jī)制主要為炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自主神經(jīng)功能失調(diào)、蛋白酶—抗蛋白酶失衡。Montagnana等[4]認(rèn)為肺泡壁基底膜斷裂，而分泌細(xì)胞通過(guò)斷裂的基底膜侵入肺泡，導(dǎo)致肺泡細(xì)支氣管化，促進(jìn)肺氣腫形成?，F(xiàn)已證明，破壞肺泡壁基底膜的蛋白酶有中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶、MMPs、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）等。MMPs是一個(gè)大家族，因其需要Ca2＋、Zn2＋等金屬離子作為輔助因子而得名。MMPs 有26個(gè)成員，編號(hào)分別為MMP1～26。根據(jù)作用底物以及片斷同源性，將MMPs分為6類(lèi)，分別為膠原酶、明膠酶、彈性蛋白酶類(lèi)、間質(zhì)溶解素、模型蛋白酶類(lèi)和其他型。它們主要由中性粒細(xì)胞（PMN）、肺泡巨噬細(xì)胞（AM）和呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生，能夠降解肺實(shí)質(zhì)ECM的所有成分，包括彈性蛋白、膠原蛋白、蛋白多糖、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等[5]。膠原酶包括MMP-2、MMP-9，作用底物為基底膜Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ膠原酶，纖維粘連蛋白、明膠等。MMP-12屬于彈性蛋白酶類(lèi)，作用底物為彈性纖維、纖維粘連蛋白等。MMP-2、MMP-9及MMP-12在降解ECM占主要地位[6]。

MMP-9在正常肺組織中并不產(chǎn)生，當(dāng)受到各種因素刺激時(shí)，支氣管上皮細(xì)胞、肺泡Ⅱ型細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等均可產(chǎn)生。MMP-9加速呼吸道壁ECM和基底膜崩解，使氣道壁失去正常結(jié)構(gòu)，還能促進(jìn)炎癥細(xì)胞積聚于氣道壁，并釋放炎癥因子，加重呼吸道的炎性反應(yīng)[7]。它還能刺激并激活生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管生成、成纖維細(xì)胞增生，引起氣道重塑，導(dǎo)致肺組織的破壞。Calikoglu等[8]研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期COPD患者血清MMP-9水平高于正常對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)大部分COPD患者的血液、痰液以及肺組織活檢中MMP-9的水平與活性均較高。Papakonstantinou等[9]納入97例COPD患者進(jìn)行試驗(yàn)，其中44例為AECOPD，測(cè)定COPD患者M(jìn)MP9、TIMP-1、TIMP-2含量、結(jié)構(gòu)，AECOPD患者支氣管肺泡灌洗液中上述指標(biāo)均顯著升高，且與肺功能呈負(fù)相關(guān)。Linder等[10]入選594例COPD患者進(jìn)行研究，對(duì)照組為948例健康者，結(jié)果COPD 組MMP-9中位數(shù)535 ng/mL，對(duì)照組為505 ng/mL （P＝0.017）。校正年齡、性別、吸煙量等后，發(fā)現(xiàn)MMP-9水平與FEV1％顯著相關(guān)（P＝0.033）。吸煙是COPD發(fā)病中最主要的危險(xiǎn)因素，研究表明80％～90％的COPD患者有吸煙史，而MMP-9與吸煙的相關(guān)性也得到證實(shí)：吸煙在COPD的發(fā)病機(jī)制中作為直接刺激因素，有可能導(dǎo)致蛋白酶增多及活性增強(qiáng)。Aviles等[11]報(bào)道，COPD患者痰液中MMP-9的濃度顯著高于健康吸煙者，健康吸煙者痰液中MMP-9濃度高于健康非吸煙者，且該濃度與他們吸煙量有一定相關(guān)性。MMP-2在正常肺組織中表達(dá)極少，主要來(lái)源于中性粒細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等[12]，其在降解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用。MMP-2在所有MMPs中分布最廣泛，當(dāng)組織受損或細(xì)胞惡變時(shí)MMP-2表達(dá)增加，其表達(dá)增加同時(shí)伴有蛋白水解酶活性增強(qiáng)，而后者加速了肺泡壁的破壞。Chen等[13]報(bào)道健康人與COPD 0、Ⅰ、ⅡA、ⅡB及Ⅲ級(jí)五組MMP-2水平分別為（0.7±0.4）、（4.0±0.9）、（4.5±1.5）、（7.7±3.1）、（11.9±3.5）、（18.5±5.0）microg/L（P＜0.01）。王小莉等[14]研究表明，被動(dòng)吸煙大鼠支氣管肺泡灌洗液MMP-2的活性和表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。孔英君等[15]研究MMP-2、MMP-9與COPD氣流阻塞的關(guān)系，結(jié)果COPD組MMP-2、MMP-9 mRNA均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。MMP-2、MMP-9蛋白廣泛表達(dá)在支氣管肺泡組織，而對(duì)照組表達(dá)非常弱；肺組織MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)與FEV1占預(yù)計(jì)值％、FEV1/FVC均呈負(fù)相關(guān)。

MMP-12又被稱為人巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶，體內(nèi)許多細(xì)胞因子（如白介素-4、粒細(xì)胞集落刺激因子、低密度脂蛋白）均能誘導(dǎo)或刺激MMP-12在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，其具體激活機(jī)制目前還不清楚。1993年Shapiro等[16]成功在吸煙者的肺泡巨噬細(xì)胞中克隆出MMP-12的cDNA序列。MMP-12不僅能夠降解富含于肺及動(dòng)脈壁的細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)成分，還能激活其他MMPs，使蛋白水解的作用放大[17]。1975年Werb等[18]首次在小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MMP-12基因；敲掉該小鼠的MMP12基因則能夠阻止吸煙小鼠的肺氣腫模型形成，認(rèn)為MMP-12在動(dòng)物COPD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。Hunninghake等[19]報(bào)道MMP-12與吸煙者的COPD發(fā)病有關(guān)，且與COPD患者FEV1下降存在一定關(guān)系。Demedts等[20]發(fā)現(xiàn)肺功能輕到中度的COPD患者痰液中MMP-12濃度及活性明顯高于對(duì)照組（包括吸煙者、不吸煙者以及既往吸煙者）。Yu等[21]的試驗(yàn)通過(guò)對(duì)1751例COPD患者及2472例健康者研究發(fā)現(xiàn)，MMP12 rs652438基因?yàn)镃OPD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，MMP12基因多態(tài)性與COPD發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，MMPs作為細(xì)胞外彈性蛋白和膠原蛋白的內(nèi)切酶，與COPD的發(fā)生有密切關(guān)系。通過(guò)本試驗(yàn)驗(yàn)證了MMP-2、MMP-9、MMP-12在COPD患者中顯著升高，其升高水平與肺功能?chē)?yán)重程度成正相關(guān)。TIMPs與MMPs基因多態(tài)性在COPD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中又起到怎樣的作用，尚需要大量的臨床研究來(lái)證實(shí)，從而為COPD的防治提供理論基礎(chǔ)及臨床依據(jù)。而TIMPs有望成為延緩COPD進(jìn)展的有效手段之一[6]。

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Clinical Research of Matrix Metalloproteinase 2，9，12 with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

/LI Min，WANG YU-hong，LI Wei.//Medical Innovation of China，2016，13（02）：044-047

【Abstract】Objective：To investigate the correlation of patients with chronic obstructive pulmonary disease（COPD） with matrix metalloproteinase2（MMP-2），matrix metalloproteinase9（MMP-9） and matrix metalloproteinase 12（MMP-12） in the serum.Method：Double-antibody sandwich method （ELISA） was used to measure the concentrations of MMP-2，MMP-9，MMP-12 in the serum of 80 patients with COPD，including acute exacerbation （AECOPD） for 40 cases and clinical remission for 40 cases.45 healthy people were selected as the healthy control group.The statistical analysis was conducted.Result：The concentrations of MMP-2，MMP-9，MMP-12 in patients with COPD were significantly higher than those of the healthy control group，the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.These index in AECOPD group were significantly higher than those in the clinical remission group（P＜0.01）.The concentrations of MMP-2，MMP-9，MMP-12 in stable COPD patients were passively correlated with forced expiratory volume in first second（FEV1）（r＝-0.529，P＜0.01；r＝-0.385，P＜0.05；r＝-0.627，P＜0.01）.Conclusion：The serum level of MMP-2，MMP-9，MMP-12 in COPD patients are obviously higher，and they are positively correlated with the severity of the disease.

收稿日期：（2015-07-17） （本文編輯：歐麗）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.02.013

通信作者：李敏