棗樹花藥組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

段元杰，劉海剛，孟富宣，楊玉皎，周 軍

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；2.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224)

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棗樹花藥組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

段元杰1，劉海剛1，孟富宣1，楊玉皎1，周 軍2*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；2.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224)

綜述了棗樹花藥培養(yǎng)的研究進(jìn)展，系統(tǒng)的介紹了影響棗樹花藥培養(yǎng)效率的主要因素，指出了目前棗樹花藥培養(yǎng)中存在的問題，并對棗樹花藥培養(yǎng)的研究前景進(jìn)行了展望。

棗；花藥培養(yǎng)；影響因素；研究進(jìn)展

我國新審定的棗樹品種大部分來源于地方品種選優(yōu)和實生選種，棗樹新品種的創(chuàng)新程度低，因而不能很好地彌補現(xiàn)有棗品種中存在的缺陷[1]。常規(guī)育種方法由于棗樹花小、人工去雄易傷害花器官、花量大而坐果率低、存在胚敗育等都制約著棗樹雜交育種工作的發(fā)展[2]。自1964年毛葉曼陀羅離體花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株以來[3]，在離體條件下培養(yǎng)花藥或花粉，受到廣泛重視，曾被認(rèn)為是植物品種改良的捷徑，并在許多植物上成功應(yīng)用[4]。自20世紀(jì)90年代以來，逐漸出現(xiàn)了棗樹花藥培養(yǎng)的研究報道，王震星等[5]對金絲小棗樹花藥進(jìn)行培養(yǎng)，從愈傷組中分化出植株，獲得單倍體5株。王娜[6]通過對三倍體的贊皇大棗花粉進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得了1株二倍體植株。武曉紅等[7]對贊皇大棗、冬棗、辣椒棗、阜平大棗和月光棗5個供試棗品種進(jìn)行花藥組織培養(yǎng)，獲得冬棗單倍體植株2株和阜平大棗單倍體植株1株。到目前為止棗樹花藥培養(yǎng)中單倍體植株誘導(dǎo)率還比較低，且不可避免地產(chǎn)生體細(xì)胞混雜、植株生長勢弱等問題，且仍未得到有效解決。

1 影響棗樹花藥培養(yǎng)的因素

1.1 基因型

不同基因型植株花藥對培養(yǎng)的反應(yīng)不同，表現(xiàn)在愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率等方面。韓晶等[8]對2種制干棗樹品種花藥愈傷和芽誘導(dǎo)的研究表明，不同基因型的材料在相同培養(yǎng)條件下愈傷情況不同，不定芽的分化也不同，且差異明顯。王敬東等[9]以寧夏3個特色棗樹品種的花藥作為外植體培養(yǎng)，得出相似的結(jié)論，不同棗樹品種的花粉在相同培養(yǎng)基中愈傷誘導(dǎo)率和分化率存在差異，且不同基因型所適合的誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基均不同。郝征[10]以冬棗和月光棗為供試材，建立了棗樹花藥愈傷再生體系，發(fā)現(xiàn)品種不同，其愈傷和芽的誘導(dǎo)率也不同，而且誘導(dǎo)率差異懸殊。武曉紅等[11]選用5個不同基因型的棗樹品種花藥培養(yǎng)，研究不同基因型花藥愈傷組織的生長情況，都獲得愈傷組織并分化出芽，但不同基因型的材料之間愈傷誘導(dǎo)率存在顯著差異，最高為100%，最低的僅為46.67%；阜平大棗的愈傷組織分化率顯著低于其他4個品種。

1.2 取材時間

在花藥培養(yǎng)時，接種花粉所處的發(fā)育時期是影響培養(yǎng)效果的重要因素。就多數(shù)植物而言，單核中期和單核靠邊期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織。王震星等[12]經(jīng)多次取材試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金絲小棗花蕾和花粉為綠色和黃綠色時，多為花粉的單核靠邊期，此時接種培養(yǎng)，較易誘導(dǎo)出愈傷組織。從采集時間來看，以5月中旬至5月下旬采集的花藥較易獲得愈傷組織。吳麗萍[13]研究了冬棗花蕾的形態(tài)特征與花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的相關(guān)性，結(jié)果表明：冬棗黃綠色和淡黃色時期的花蕾愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于其他顏色時期愈傷組織的誘導(dǎo)率。牛瑜菲[14]指出了培養(yǎng)的最佳時期為單核靠邊期，此期花蕾為黃綠色，五角逐漸變圓，花藥為淡黃色；并指出了不同品種之間單核靠邊期花蕾大小略有差異，酸棗花蕾橫徑1.9 mm左右，縱徑1.0 mm左右；蘋果棗和駿棗花蕾橫徑為2.0 mm左右，縱徑1.1～1.8 mm之間；贊皇大棗花蕾橫徑2.7 mm左右，縱徑1.6 mm左右。然而以外部形態(tài)來確定小孢子發(fā)育時期并不是十分準(zhǔn)確。周林等[15]認(rèn)為花蕾外部形態(tài)容易受到品種、植株的年齡、生長狀況、外部環(huán)境條件、季節(jié)和人為管理的影響。武曉紅[7]研究了不同顏色的花蕾對愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響，并對不同發(fā)育時期的花粉進(jìn)行鏡檢，結(jié)果表明：由于品種的不同，小孢子在適宜離體培養(yǎng)的單核靠邊期所對應(yīng)的花蕾外部形態(tài)會有所差異，但該時期花蕾一般為綠色到黃綠色。韋鵬霄等[16]研究了番茄花蕾外部形態(tài)與花粉發(fā)育時期的相關(guān)性認(rèn)為，在以番茄花蕾外部形態(tài)(如花蕾長度)為花藥培養(yǎng)取材依據(jù)時，還應(yīng)該配合采用鏡檢鑒定的方法來確定花粉發(fā)育時期，以利于增強(qiáng)對接種材料的選擇性，提高番茄花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)率。由于受諸多因素的影響，棗樹相似的花蕾外部形態(tài)下單核靠邊期花粉細(xì)胞占總花粉細(xì)胞的比例可能有很大差異，外部形態(tài)觀察結(jié)合鏡檢鑒定是一種可提高對接種材料選擇性的方法[17-22]。

1.3 預(yù)處理

在花藥培養(yǎng)中，接種培養(yǎng)之前對花藥進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，能誘發(fā)花藥內(nèi)源激素、mRNA、蛋白質(zhì)及糖類物質(zhì)的含量發(fā)生變化[23-25]，提高小孢子的生活力，延長花粉的壽命，使藥壁細(xì)胞和絨氈層逐漸退化，小孢子孤立[26]，促使花藥內(nèi)小孢子完成從活體內(nèi)配子體發(fā)育轉(zhuǎn)為類似離體下的孢子體發(fā)育，顯著地提高小孢子發(fā)育成為單倍體植株的誘導(dǎo)率[13]。

武曉紅[7]研究發(fā)現(xiàn)，阜平大棗和贊皇大棗的花藥經(jīng)甘露醇預(yù)處理后愈傷組織誘導(dǎo)率均有提高，以0.1 mol/L甘露醇處理3 d時的出愈率達(dá)到最大。處理天數(shù)對出愈率的影響已達(dá)到顯著水平且明顯大于不同濃度對出愈率的影響。吳麗萍[13]在冬棗樹花藥培養(yǎng)中用甘露醇進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)甘露醇處理后花藥愈傷組織誘導(dǎo)率得到顯著提高，在濃度為0.4～0.6 mol/L時的誘導(dǎo)率達(dá)到最大。另外低溫預(yù)處理在棗樹花藥培養(yǎng)中也是比較常見的方法。王震星等[12]以金絲小棗離體花藥為試材進(jìn)行5 ℃低溫預(yù)處理使得愈傷組織誘導(dǎo)率明顯提高，以處理5 d時達(dá)到最高，但不同處理時間之間的誘導(dǎo)率無顯著差異。王艷[20]發(fā)現(xiàn)低溫預(yù)處理不但有利于花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，而且對花藥愈傷組織的分化有促進(jìn)作用。武曉紅等[27]則持不同觀點，他以贊皇大棗、冬棗、月光棗、阜平大棗和辣椒棗樹花藥進(jìn)行試驗，得出低溫預(yù)處理對棗樹花藥愈傷組織的誘導(dǎo)沒有產(chǎn)生正面影響，甚至有些品種的誘導(dǎo)率明顯下降。牛瑜菲[14]也證實了不是所有的棗樹品種在低溫處理后誘導(dǎo)愈傷組織時都會表現(xiàn)正向的促進(jìn)作用。低溫處理后駿棗沒有明顯變化，贊皇大棗誘導(dǎo)率反而下降。不同的棗樹品種花藥在相同的預(yù)處理之后呈現(xiàn)出表現(xiàn)型上的差異，也間接地反映了基因型在花藥培養(yǎng)中的決定作用。

1.4 基本培養(yǎng)基及其附加成分

1.4.1 基本培養(yǎng)基 木本植物花藥培養(yǎng)所采用的基本培養(yǎng)基有MS、Nitsch、B5、BN、BH、MB、N6、Miller、H。較為常用的是MS、BN、H、MB培養(yǎng)基[17]。王娜等[18]將冬棗未成熟花蕾接種在MS、B5、MT、WPM培養(yǎng)基上，結(jié)果表明：MS基本培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，添加適當(dāng)?shù)募に睾螳@得較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，并誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。韓晶等[8]比較了MS、1/2MS培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果表明：這2種基本培養(yǎng)基對誘導(dǎo)長紅棗樹花藥愈傷組織的出愈率影響差異不顯著。

1.4.2 碳源 糖作為碳源，為接種的材料提供能量，并且可以調(diào)節(jié)滲透壓，在組織培養(yǎng)中起重要作用。王震星等[12]在添加3%蔗糖的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出金絲小棗樹花藥的愈傷組織，并且進(jìn)一步分化獲得再生植株。王艷[20]通過綜合分析也認(rèn)為3%的蔗糖濃度普遍適用于棗樹花藥愈傷組織的誘導(dǎo)和愈傷組織分化獲取再生植株。韓晶等[8]比較了以蔗糖和麥芽糖為碳源時愈傷組織的誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)添加麥芽糖時，花藥愈傷組織褐化、死亡率低，出愈率高，更適合用作棗樹花藥愈傷組織誘導(dǎo)的碳源。王娜等[18]比較了蔗糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖在冬棗樹花藥培養(yǎng)中的效果，認(rèn)為麥芽糖在冬棗樹花藥愈傷組織誘導(dǎo)中的作用優(yōu)越于其他碳源。吳麗萍[13]綜合評價愈傷質(zhì)量和培養(yǎng)過程中的褐化情況認(rèn)為3%麥芽糖適合冬棗樹花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。武曉紅[7]通過試驗得出相似的結(jié)論，認(rèn)為在誘導(dǎo)花藥愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化出苗2個階段，在麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上愈傷組織生長旺盛，增殖迅速，芽點分化快，效果明顯優(yōu)于蔗糖和葡萄糖。

1.4.3 激素 花藥愈傷組織的生長情況很大程度上取決于培養(yǎng)基中激素的種類、濃度和配比。棗樹花藥離體培養(yǎng)中最常使用的是NAA、6-BA、2，4-D。對于誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基，王震星等[19]在金絲小棗樹花藥培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)2，4-D和NAA是誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵，且兩者適當(dāng)?shù)呐浔缺葐我桓郊?，4-D或NAA的誘導(dǎo)率高，并指出最佳的配比是2，4-D 1.0 mg/L和NAA 0.4 mg/L。這一結(jié)論一直被后來的學(xué)者所借鑒并得到證實。郝征[10]發(fā)現(xiàn)不同的植物生長調(diào)節(jié)劑對棗樹花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率以2，4-D最高，其次是NAA、TDZ，而GA3不適合誘導(dǎo)棗樹花藥愈傷組織。武曉紅[7]也提到GA3對試驗材料愈傷組織的發(fā)生沒有作用。牛瑜菲[14]指出TDZ和NAA的組合有利于花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。王艷[20]在試驗后也認(rèn)為TDZ和NAA對愈傷組織的誘導(dǎo)有普遍的積極作用，有利于花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。王敬東等[9]在花藥愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中以生長素2，4-D和NAA、IBA的組合均未能誘導(dǎo)出愈傷組織，添加細(xì)胞分裂素6-BA后誘導(dǎo)效果明顯改善，認(rèn)為6-BA對愈傷組織的誘導(dǎo)具有重要作用。武曉紅等[11]認(rèn)為TDZ、2，4-D、NAA均可誘導(dǎo)出花藥愈傷組織，只是不同的品種對激素的敏感度不同。對于分化培養(yǎng)基，武曉紅等[11]發(fā)現(xiàn)棗樹花藥愈傷組織的分化在分裂活性較強(qiáng)的TDZ的刺激下能分化出再生植株，在添加三十烷醇的培養(yǎng)基上能得到較高的分化率。韓晶等[8]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高6-BA的添加量有利于愈傷組織不定芽的分化。王震星等[19]認(rèn)為6-BA是金絲小棗愈傷組織分化成小植株的決定因素。王艷[20]試驗后得出6-BA和IBA的組合適合棗樹花藥愈傷組織的分化，有利于獲得再生植株。王敬東等[9]認(rèn)為6-BA和IBA低濃度配比所獲得的分化率高于高濃度配比的分化率。

1.4.4 硝酸銀 王敬東等[9]在以特色棗樹為試材的分化培養(yǎng)基中添加適量硝酸銀，獲得的分化率普遍高于未添加硝酸銀的培養(yǎng)基。吳麗萍[13]在冬棗樹花藥組織培養(yǎng)研究中添加10 μmol/L的硝酸銀溶液，提高了愈傷組織的增殖率，并對褐化的減輕起到了比較明顯的作用。韓晶[21]以月光棗為試材開展試驗則認(rèn)為：硝酸銀溶液的添加會使得愈傷組織增殖緩慢，褐化嚴(yán)重，總體來說不利于花藥愈傷的生長與再生出芽。由于樹種不同，硝酸銀在花藥愈傷誘導(dǎo)效果上表現(xiàn)出很大的差異，間接地反映了基因型在花藥培養(yǎng)中的決定性作用。

1.4.5 活性炭和PVP 劉曉光等[22]發(fā)現(xiàn)在材料容易褐化的培基中添加適量的活性炭或PVP，可以提高所形成愈傷組織的質(zhì)量，避免愈傷因褐化而死亡。吳麗萍[13]在冬棗樹花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在增殖培養(yǎng)基中添加0.2～0.4 g/L的活性炭，能有效減輕愈傷組織的褐化程度，同時有利于愈傷組織增殖。

2 培養(yǎng)條件

在花藥組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)時的溫度和光照也是重要的影響因素。通常離體培養(yǎng)的花藥對溫度十分敏感[28]。棗樹花藥組織培養(yǎng)一般分為2個階段，即光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)，武曉紅等[7]發(fā)現(xiàn)與光照培養(yǎng)相比，暗培養(yǎng)更有利于棗樹花藥愈傷組織的發(fā)生。王震星等[5]曾指出棗樹花藥離體培養(yǎng)的所需溫度為(26±2)℃，在黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織；在光照條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)，每日光照12 h，光照強(qiáng)度為2500 lx。這一結(jié)論為后來的學(xué)者提供了切實可行的指導(dǎo)，并在不斷的探索中細(xì)化、完善。

3 倍性研究

育種工作的目的是使獲得的單倍體植株經(jīng)過染色體加倍而成為純合的二倍體可育植株，植物的花粉是由花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂而來，其染色體數(shù)為體細(xì)胞的一半。理論上講，由花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織細(xì)胞應(yīng)為單倍體。但從眾多學(xué)者的研究結(jié)果中可以看出，在誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織中，大多數(shù)為二倍體、混倍體，單倍體僅占很少的量，主要是受花藥誘導(dǎo)頻率和分化成苗率低所限。王震星等[29]對金絲小棗樹花藥誘導(dǎo)的愈傷組織分化出的綠芽生長點細(xì)胞進(jìn)行倍性檢測發(fā)現(xiàn)，每一塊愈傷組織上都有不同倍性細(xì)胞的存在。其中單倍體較少，只占到5%左右，二倍體接近80%，另外也有少量的三倍體和四倍體。愈傷組織分化形成的小植株中單倍體5株，占11.1%；二倍體14株，占31.1%；四倍體4株，占8.9%；各種混倍體22株，占48.9%。陳海媛等[30]認(rèn)為在花粉培養(yǎng)的愈傷組織階段，染色體的穩(wěn)定性較差，單倍體頻率低的原因可能是自然加倍和有絲分裂過程不正常所致。在花藥培養(yǎng)中還存在著體細(xì)胞產(chǎn)生的愈傷組織干擾的情況，比如藥壁細(xì)胞、藥隔細(xì)胞或殘存花絲細(xì)胞等生成的再生植株也不會出現(xiàn)單倍體。

4 棗樹組織培養(yǎng)研究展望

4.1 提高單倍體的誘導(dǎo)率

單倍體細(xì)胞的自然加倍和有絲分裂過程不正常，以及花藥壁細(xì)胞的干擾等因素直接導(dǎo)致所獲得的單倍體細(xì)胞比例較小，而且培養(yǎng)過程中單倍體細(xì)胞的生長很容易被生長旺盛的多倍體細(xì)胞所掩蓋，所以花藥組織培養(yǎng)獲得單倍體植株較困難。比較有效地提高單倍體誘導(dǎo)率的方法是直接進(jìn)行花粉培養(yǎng)，排除體細(xì)胞干擾。另外，在培養(yǎng)過程中，對何時單倍體細(xì)胞所占比例最大、何時擴(kuò)大繁殖以及分化成苗等問題，還有待進(jìn)一步研究。

4.2 培養(yǎng)過程充分考慮不同因素的相互作用

在棗樹花藥培養(yǎng)的眾多研究中，研究各種外界因素對花藥培養(yǎng)的性狀表現(xiàn)居多，基本都建立在經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，而對引發(fā)試材特定性狀的特定因素作用機(jī)理研究較少，單從性狀表現(xiàn)來確定各因素的作用受到客觀條件的制約，容易出現(xiàn)偏差，不利于揭示各因素的作用機(jī)理。研究過程中需要結(jié)合植物生理學(xué)層面知識來研究各因素對試材的作用，更全面、更準(zhǔn)確地把握因素在花藥培養(yǎng)中的作用機(jī)理，得出普遍性的規(guī)律。另外，花藥誘導(dǎo)、分化是眾多因素作用的結(jié)果，然而在已有的研究中，各個因素之間的相互作用關(guān)系還不清楚，交互作用考慮不足，在研究單一因素的影響時，也需要考慮各個因素之間的相互作用，以及交互作用對花藥培養(yǎng)的影響等，這些尚有待于加強(qiáng)篩選工作，并找出合適的培養(yǎng)方法，以提高花培效率。

4.3 與基因工程相結(jié)合

棗樹的花藥培養(yǎng)對基因型依賴性較強(qiáng)，部分基因型離體培養(yǎng)不發(fā)育，有的發(fā)生率太低而沒有應(yīng)用價值?？梢砸罁?jù)對花藥植株利用目的的不同，選擇具有代表性的品種進(jìn)行花藥培養(yǎng)，或者結(jié)合遺傳機(jī)理對花藥培養(yǎng)進(jìn)行基礎(chǔ)性研究，使花藥培養(yǎng)與基因工程相結(jié)合，從根本上解決因基因型導(dǎo)致的花藥培養(yǎng)效率低等問題，為棗樹花藥培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用開創(chuàng)一個新的局面。

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[25] 張綠萍，陳紅.低溫預(yù)處理對刺梨花藥培養(yǎng)小孢子發(fā)育的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，32(1)：61-66.

[26] 黃斌.大麥花藥培養(yǎng)中低溫預(yù)處理對花粉愈傷組織成的影響[J].植物學(xué)報，1985，27(3)：439-443.

[27] 武曉紅，王玖瑞，劉孟軍，等.不同預(yù)處理對棗花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，2008，23(增刊)：43-45.

[28] 王萬奇，李文龍，王媛媛，等.植物花藥組織培養(yǎng)技術(shù)的研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015(10)：177-179.

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[30] 陳海媛，乜蘭春，張學(xué)英，等.蘆筍花藥培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].北方園藝，2010(18)：219-221.

(責(zé)任編輯：曾小軍)

Research Progress in Tissue Culture of Chinese Jujube Anther

DUAN Yuan-jie1, LIU Hai-gang1, MENG Fu-xuan1, YANG Yu-jiao1, ZHOU Jun2*

(1. Institute of Tropical Ecological Agricultural Sciences, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yuanmou 651300, China; 2. Faculty of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

The tissue culture of Chinese jujube anther was reviewed in this paper. The main factors affecting the efficiency of Chinese jujube anther culture were systematically introduced. In addition, the existent major problems in the research of Chinese jujube anther culture were pointed out, and the prospects of this research were discussed.

Chinese jujube; Anther culture; Influencing factor; Research progress

2016-05-24

云南省科技計劃項目“云南高原低緯度高海拔地區(qū)鮮食棗優(yōu)良品種的選育”(2014BB001)。

段元杰(1991─)，男，云南楚雄人，研究實習(xí)員，從事果樹栽培研究。*通訊作者：周軍。

Q943.1

A

1001-8581(2016)11-0047-04