陳碧?馬天仲?宋麗君?荊霞?張?jiān)粕?/p>

【摘要】 目的 探討自身精子冷凍保存（自精保存）在輔助生殖技術(shù)中的意義。方法 ①對(duì)進(jìn)行自精凍存的73例患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析， 包括精子凍存原因、凍存精子使用率、復(fù)蘇成功率等。②另選同期在本中心接受自精保存作為體外受精（IVF）治療周期患者314例（A組）， 以及夫精人工授精（AIH）術(shù)前未行任何干預(yù)患者341例（B組）， 觀察兩組取精困難發(fā)生率及手術(shù)取消率。結(jié)果 ①梗阻性無(wú)精子癥是自精冷凍的最常見(jiàn)原因， 而且使用率也最高， 為57.9%；其次是嚴(yán)重少弱精子癥及取精困難者。但取精困難及嚴(yán)重少弱精子癥患者的凍精使用率均較低， 分別為16.7%及6.7%。精子復(fù)蘇成功率均>90%， 僅2例梗阻性無(wú)精子癥患者精子復(fù)蘇后無(wú)足夠可用精子而再次穿刺取新鮮精子。②A組患者采卵日發(fā)生取精困難者2例， 發(fā)生率0.64%， 手術(shù)取消率為0；B組患者手術(shù)日發(fā)生取精困難者8例， 發(fā)生率2.35%， 手術(shù)取消率為1.17%。結(jié)論 自身精子冷凍保存在輔助生殖技術(shù)中有重要意義， 特別是在避免梗阻性無(wú)精子癥患者遭受不必要的反復(fù)侵入性操作及降低因男性取精困難造成的輔助生殖治療周期取消率方面有重要意義。

【關(guān)鍵詞】 精子；低溫保存；輔助生殖

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.08.007

Analysis of clinical effect by autologous sperm preservation in assisted reproductive technology CHEN Bi， MA Tian-zhong， SONG Li-jun， et al. Reproduction Center， Affiliated Hospital of Guangdong Medical College， Zhanjiang 524001， China

【Abstract】 Objective To investigate significance of autologous sperm cryopreservation in assisted reproductive technology. Methods ① A retrospective analysis was made on clinical data of 73 patients receiving autologous sperm cryopreservation， including their reasons for autologous sperm cryopreservation， usage rate of cryopreserved sperm， and successful recovery rate. ② There were 314 patients receiving autologous sperm cryopreservation as in-vitro fertilization （IVF） treatment （group A） and 341 patients receiving artificial insemination by husband （AIH） without any preoperative intervention （group B）. Their incidences of semen retrieval difficulty and operation cancellation rates were observed. Results ① As the most common reason in autologous sperm cryopreservation， obstructive azoospermia had the highest usage rate as 57.9%， followed by severe oligoasthenozoospermia and semen retrieval difficulty. However， the usage rates in oligoasthenozoospermia and semen retrieval difficulty were as low as 16.7% and 6.7%. The successful recovery rates in patients were all > 90%， and there were only 2 cases with obstructive azoospermia received puncture semen retrieval. ② There were 2 cases with semen retrieval difficulty in group A， with incidence as 0.64% and operation cancellation rate as 0. There were 8 cases with semen retrieval difficulty in group B， with incidence as 2.35% and operation cancellation rate as 1.17%. Conclusion Autologous sperm cryopreservation shows important significance in assisted reproductive technology， especially for avoiding unnecessary repeated invasive operation in obstructive azoospermia patients and reducing assisted reproductive technology treatment cancellation rate due to semen retrieval difficulty.

【Key words】 Sperm； Cryopreservation； Assisted reproductive technology

隨著人類輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology， ART）的發(fā)展， 單精子卵胞漿內(nèi)注射（intracytoplasmic single sperm injection， ICSI）已漸趨成熟， 理論上只要有一條活動(dòng)精子， 就能使成熟卵子受精， 使患者受孕。而精子冷凍技術(shù)日益成熟， 特別是極少量精子冷凍技術(shù)的發(fā)展， 使患者因各種因素需要冷凍自身精子用于后續(xù)ART治療成為可能。部分男性患者在妻子取卵日由于精神緊張無(wú)法取出精液， 導(dǎo)致需行穿刺術(shù)取精或冷凍卵子；部分嚴(yán)重少弱精及隱匿精子癥患者取卵日無(wú)可用精子；梗阻性無(wú)精癥患者在門診穿刺檢查時(shí)有精子， 但取卵日附睪或睪丸穿刺取精時(shí)卻找不到可用精子， 患者除了需忍受兩次穿刺的手術(shù)創(chuàng)傷， 還要承受卵子冷凍或取消周期的治療費(fèi)用的增加；有些患者因自身職業(yè)關(guān)系， 如海員或執(zhí)行任務(wù)的軍人在取卵日無(wú)法到場(chǎng)。因?yàn)檫@些種種因素， 患者要求冷凍自身精子。在2013年4月～2015年4月， 本中心對(duì)行輔助生殖技術(shù)前因各種因素需行精液冷凍保存的部分患者行自精保存。本文對(duì)本中心患者進(jìn)行回顧性分析， 探討自精保存在輔助生殖技術(shù)中的臨床意義， 以及在行人類輔助生殖技術(shù)過(guò)程中男方取精困難的預(yù)防措施， 從而確保助孕順利進(jìn)行?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2013年4月～2015年4月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心行自體精子凍存的男性患者73例。另選同期在本中心接受IVF患者314例（A組）， 其中12例（3.8%）在進(jìn)入治療周期前表現(xiàn)有明顯取精困難傾向的患者接受主動(dòng)干預(yù)治療；AIH術(shù)前未行任何干預(yù)的患者341例（B組）， 其中6例（1.8%）手術(shù)日突發(fā)取精困難的患者接受被動(dòng)干預(yù)治療。精液標(biāo)本分為射出精子及穿刺精子兩種。射出精子來(lái)源于患者手淫或用專用取精套同房取精。精液凍存前需做精液常規(guī)分析（參照世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第5版）， 包括精液量、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、正常形態(tài)精子百分率及存活率等；所有患者均進(jìn)行染色體檢查及傳染病篩查。

1. 2 方法

1. 2. 1 標(biāo)本收集 手淫取精患者禁欲2～7 d， 取精前排尿， 清潔會(huì)陰， 手淫法完整采集。標(biāo)本采集在本中心指定的取精室進(jìn)行。手淫取精困難者， 可采用特制的避孕套同房進(jìn)行精液采集。精液需收集到一次性無(wú)菌無(wú)毒的專用取精杯內(nèi)。附睪或睪丸穿刺取精者常規(guī)消毒鋪巾， 用7號(hào)頭皮針穿刺附睪或睪丸， 附睪液加入裝有1 ml精子洗滌培養(yǎng)基（美國(guó)Quinns）的培養(yǎng)皿中；睪丸穿刺取精需在解剖鏡下用1 ml注射器針頭撕碎曲細(xì)精管， 再置于倒置顯微鏡下觀察有無(wú)精子。

1. 2. 2 精子冷凍 逐滴把1份精子冷凍培養(yǎng)基（Quinns AdvantageTM Sperm Freezing Medium）加進(jìn)1份液化好的精液樣本。每滴培養(yǎng)基加入時(shí)， 要不斷混合以確保精子細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基能徹底平衡?；旌虾蠓跤?0 min。標(biāo)記冷凍用的精液貯存管（包括患者姓名和日期）， 分裝孵育過(guò)的精液到冷凍管， 每份約1～2 ml， 蓋緊。將冷凍管平放在離液氮面10～20 cm高度20～30 min， 把冷凍管放在鋁架上， 然后移至液氮罐保存。

1. 2. 3 精子解凍 找出需要解凍的精液標(biāo)本， 雙人核對(duì)確認(rèn)后， 把冷凍管取出， 35℃水浴直至完全溶解。把解凍后的精子溶液倒進(jìn)試管， 一滴一滴緩慢地在30 s內(nèi)把3份精子沖洗培養(yǎng)基與精子溶液徹底混合以確保精子冷凍培養(yǎng)基已被稀釋。根據(jù)解凍后的精子質(zhì)量采用相應(yīng)精液優(yōu)選方法獲有活力精子。附睪或睪丸穿刺取精者如果未找到活動(dòng)精子或活動(dòng)精子過(guò)少， 則重新睪丸或附睪穿刺取精；手淫取精者當(dāng)天先留取新鮮精液， 如無(wú)法取出精液或當(dāng)天精液中未找到活動(dòng)精子或活動(dòng)精子過(guò)少， 則復(fù)蘇精液。

2 結(jié)果

2. 1 自2013年4月～2015年4月， 73例男性患者在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心行自體精子凍存。精液凍存原因分布、冷凍前精液質(zhì)量、使用率、復(fù)蘇成功率見(jiàn)表1。梗阻性無(wú)精子癥是自精冷凍的最常見(jiàn)原因， 而且使用率也最高， 為57.9%；其次是嚴(yán)重少弱精子癥（15例）， 由于擔(dān)心女方取卵日無(wú)法取到足夠可用精子而要求冷凍精液；12例取精困難患者因擔(dān)心取卵日無(wú)精子可用又不愿意選擇凍卵或穿刺術(shù)取精要求凍精。但取精困難及嚴(yán)重少弱精子癥患者的凍精使用率均較低， 分別為16.7%及6.7%。73例患者的精子復(fù)蘇成功率均>90%， 僅2例梗阻性無(wú)精子癥患者精子復(fù)蘇后無(wú)足夠可用精子而再次穿刺取新鮮精子。

2. 2 自精保存對(duì)取精困難患者的效果評(píng)估 A組314例IVF患者采卵日發(fā)生取精困難者2例， 發(fā)生率0.64%（2/314）， 需解凍凍存精子， 手術(shù)取消率為0。B組341例AIH患者手術(shù)日發(fā)生取精困難者8例， 發(fā)生率2.35%（8/341）， 患者接受被動(dòng)干預(yù)治療， 仍有4例未能成功取精而取消人工授精， 手術(shù)取消率為1.17%。

3 討論

隨著ICSI技術(shù)的發(fā)展， ICSI技術(shù)已作為常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于輔助生殖臨床治療， 給越來(lái)越多的不孕癥患者帶來(lái)福音。而精液冷凍結(jié)合ICSI技術(shù)更進(jìn)一步拓寬了不孕不育的治療范圍。精子的質(zhì)量及來(lái)源不影響ICSI治療的受精及早期妊娠結(jié)局[1]。目前對(duì)小鼠冷凍精子的胚胎發(fā)育和表觀遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)， 與新鮮精子組相比， 冷凍精子的胚胎的表觀遺傳重組動(dòng)態(tài)進(jìn)程并沒(méi)有改變[2]。目前精子冷凍方法主要有慢速冷凍和玻璃化冷凍， 兩種冷凍方法之間精子活動(dòng)率下降及DNA損傷無(wú)顯著差異[3]。但是常規(guī)精子冷凍方案卻不適用于稀少精子冷凍， 解決稀少精子冷凍技術(shù)將在很大程度上改善臨床治療少、弱精子癥和無(wú)精子癥患者的不育問(wèn)題。尋找合適冷凍載體是目前稀少精子冷凍的研究重點(diǎn)之一。目前稀少精子不同載體冷凍方法有：空卵膜載體冷凍法、微滴冷凍法及其他微型載體冷凍法[4]。在國(guó)內(nèi)一些人類精子庫(kù)已開展腫瘤患者的精液凍存[5]， 拓寬了不孕不育的治療范圍， 給越來(lái)越多不孕癥患者帶來(lái)福音。

在本院行自精保存的患者中， 梗阻性無(wú)精子癥是自精冷凍的最常見(jiàn)原因， 而且使用率也最高， 與張靜雯等[6]報(bào)道一致。與自精保存避免了梗阻性無(wú)精癥患者在門診穿刺檢查時(shí)有精子， 但取卵日附睪或睪丸穿刺取精時(shí)卻找不到可用精子。患者不需忍受兩次穿刺的手術(shù)創(chuàng)傷， 以及因卵子冷凍或取消周期而導(dǎo)致治療費(fèi)用的增加， 減輕了患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但因附睪或睪丸穿刺取出的精子量較少， 目前極少量精子的冷凍技術(shù)仍處于研究階段， 在臨床上尚未能常規(guī)應(yīng)用。目前仍使用傳統(tǒng)的慢速冷凍方法， 考慮到慢速冷凍法中精子的復(fù)蘇存活率<50%， 因此要求活動(dòng)精子的數(shù)量要≥10條， 才能保證復(fù)蘇后有足夠的精子用于ICSI。

部分男性患者在妻子取卵日由于精神緊張無(wú)法取出精液， 導(dǎo)致需行穿刺術(shù)取精或冷凍卵子。為確保助孕順利進(jìn)行， 在妻子進(jìn)入助孕周期后， 丈夫取精行精液凍存有助于消除患者緊張及不安情緒。采取主動(dòng)干預(yù)措施使取精困難發(fā)生率極低， 而且萬(wàn)一患者手術(shù)日無(wú)法取出精液， 仍可冷凍精子可用。自精保存對(duì)縮短該類患者的助孕周期， 減少助孕費(fèi)用有積極意義。

總之， 自精保存在行人類輔助生殖技術(shù)過(guò)程中作為男方取精困難的主動(dòng)干預(yù)措施是有效的， 可確保助孕順利進(jìn)行。

參考文獻(xiàn)

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[5] 平萍， 朱曉斌， 劉勇， 等. 上海地區(qū)男性生殖保險(xiǎn)6年回顧性分析. 中國(guó)男科學(xué)雜志， 2009， 23（8）：41-44.

[6] 張靜雯， 馬文敏， 趙軍， 等. 自精保存在輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用和意義.中國(guó)婦幼保健， 2014， 29（12）：1885-1888.

[收稿日期：2015-11-03]