李維前，季紅菊，王玉瑩，劉 霞

（徐州醫(yī)科大學(xué)（原醫(yī)學(xué)院）附屬第三醫(yī)院，江蘇 徐州 221003）

原位雜交技術(shù)檢測HPV-DNA的應(yīng)用及體會

李維前，季紅菊，王玉瑩，劉 霞

（徐州醫(yī)科大學(xué)（原醫(yī)學(xué)院）附屬第三醫(yī)院，江蘇 徐州 221003）

目的通過對活檢標(biāo)本檢測HPV-DNA，得出原位雜交的應(yīng)用體會。方法 通過原位雜交檢測，結(jié)合其組織病理鏡下形態(tài)特點作出總結(jié)分析。結(jié)果 降低了原位雜交假陽性和假陰性，得出一系列體會。結(jié)論 值得借鑒推廣在原位雜交操作中的各個細(xì)節(jié)步驟中，應(yīng)用這些體會提高原位雜交結(jié)果滿意度。

原位雜交；技術(shù)；HPV-DNA；應(yīng)用；體會

隨著改革開放，人們一些不良生活方式的流入及社會經(jīng)濟水平的提高，一些疾病如婦科宮頸癌及癌前病變、女陰尖銳濕疣；男性陰莖尖銳濕疣、陰莖癌等在臨床大量出現(xiàn)，這些疾病如果未經(jīng)過系統(tǒng)規(guī)范的治療，而造成病程反復(fù),常常會給患者帶來精神和身體的痛苦，也浪費了金錢時間。所以對這些疾病首先要明確診斷.現(xiàn)已證明這些疾病往往由人類乳頭瘤病毒(HPV)感染而導(dǎo)致。原位雜交技術(shù)是目前國內(nèi)檢測HPV較先進的檢測方法,該法是基于分子水平，檢測人類乳頭瘤病毒DNA。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我科39例活檢標(biāo)本，其中宮頸12例，女陰部5例；男外生殖器16例，男陰部4例；其它部位2例。HPV試劑盒購自福建泰普生物科技公司。主要使用儀器有：上海森信實驗有限公司的GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱；泰普國際生物科學(xué)有限公司的M10061型雜交儀。

1.2 方法

1.2.1 雜交前處理：4um厚的組織切片經(jīng)APES處理，65℃漂烘儀上烤片2h，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10分鐘脫蠟，100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇各5分鐘脫水處理，蒸餾水洗滌3分鐘，然后移入盛有雜交增強液的塑料染色盒內(nèi)、加蓋微波爐高溫處理15min（每隔5min補充雜交增強液，確保有足夠的液體浸沒組織），自然冷卻至室溫，蒸餾水洗滌1min2次，小心擦干組織周圍液體。

1.2.2 原位雜交：（1）每張切片滴加適量雜交液50ul，加蓋玻片于其上（配備專用，以防干片）（2）將切片放于原位雜交儀上95℃變性5min（3）取出切片放入含有30增效液的濕盒中37℃培養(yǎng)箱中過夜（＞16 h）。（4）取出切片，經(jīng)48℃PBS液浸泡，輕微振蕩自動脫掉蓋玻片，再經(jīng)48℃PBS液洗滌5分鐘3次。

1.2.3 信號放大與顯色：（1）在切片上加一抗50ul37℃水濕盒中孵育30min, 37℃PBS洗滌2 min3次（2）加二抗50ul室溫水濕盒中孵育20min, PBS洗滌2 min3次（3）加50ulHRP聚合物室溫水濕盒中孵育30 min ，PBS洗滌2 min3次（4）加50ulDAB顯色液，室溫鏡下控制顯色，PBS洗滌2 min3次（5）流水充分洗滌，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2 結(jié) 果

陽性信號為上皮細(xì)胞核呈棕褐色。39例標(biāo)本（宮頸

12例，女陰部5例；男外生殖器16例，男陰部4例；其它部位2例）HPV檢測結(jié)果：陽性27例(陽性率69%)，陰性

12例。其中宮頸標(biāo)本陽性9例（陽性率75%），男生殖器陽性10例（陽性率62.5%）。女陰部陽性3例（陽性率60%），男陰部陽性2例（陽性率50%）。其它部位陽性2例（陽性率

100%)。

3 討 論

HPV屬于乳多孔病毒科的乳頭瘤病毒屬，是無包膜的20面體對稱的核衣殼結(jié)構(gòu)，表面有72個殼微粒。病毒基因組呈雙股環(huán)狀DNA，主要通過直接或間接污染物品或性傳播感染人類，引起人類皮膚黏膜的多種良性乳頭狀瘤或疣，某些個別感染具有致癌性。根據(jù)病毒促進細(xì)胞癌變能力分為2種：低危型和高危型。低危型主要引起良性外生疣、低度宮頸上皮內(nèi)瘤變；高危型主要引起高度宮頸上皮內(nèi)瘤變、外生殖器癌、宮頸浸潤型鱗癌等。HPV檢測現(xiàn)有多種方法，其中最常用的免疫組化法根據(jù)抗原抗體免疫反應(yīng)的原理檢測抗原，只能有助于確定有無感染；而原位雜交法根據(jù)核酸變性、復(fù)性原理可確定宮頸上皮內(nèi)瘤變的級別，并且準(zhǔn)確定位待測物，兼具半定量的功能[1]，具有敏感性高、特異性強的優(yōu)點，因此，分子水平的原位雜交檢測法優(yōu)于蛋白水平的免疫組化法。

但原位雜交技術(shù)檢測HPV步驟多，操作要求高，常常出現(xiàn)掉片，假陰性、假陽性、背景染色過重等現(xiàn)象。對此，（1）用防脫片撈取切片并65℃烤片2h，使組織與玻片充分粘附，時間不能過短，并且操作每一步都要動作輕輕，做到謹(jǐn)小慎微以防掉片。（2）切片脫蠟、脫水、雜交增強液微波爐高溫處理要充分徹底；一抗、二抗、HRP聚合物、DAB量要足夠，時間和溫度要達要求，以免假陰性或陽性不足（3）切片要保證4um厚，不能過厚,否則易脫片或者染色過強；雜交液、一抗、二抗、HRP聚合物、DAB等的量不能多，反應(yīng)時間不能過長，否者造成假陽性或背景深陽性過強；并嚴(yán)格洗滌時間和次數(shù)，保證洗滌干凈以免非特異性著色造成染色過重甚至假陽性。（4）切片經(jīng)過高溫處理，多次洗滌等許多步驟容易掉片。（5）雜交過程使用30%增強液的濕盒而不是盛有水的濕盒，目的是降低水分對探針稀釋的可能，同時避免了因水分蒸發(fā)而致濃度過高造成背景染色過重[2]（6）雜交后PBS洗滌溫度不能過低，應(yīng)保證48℃，否則不能充分去除非特異性雜交。建議用恒溫箱，保證洗滌溫度[3]恒溫箱設(shè)定溫度應(yīng)大于48℃，溫箱里放置溫度計以便測量實際箱溫，保證切片不低于48℃。（7）蓋玻片大小要匹配，加雜交液不能過多或過少，過多蓋玻片會滑動而使雜交液蒸發(fā)；過少會產(chǎn)生氣泡，不能完全覆蓋組織，雜交效果不理想。（8）雜交前預(yù)處理非常重要，微波處理中應(yīng)保持足夠的雜交增強液幷加蓋，每隔5min添加增強液防止干片。（9）DAB顯色時，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，鏡下控制顯色時間，達到最佳效果。（10）雜交后的切片經(jīng)48℃PBS液浸泡，輕微振蕩自動脫掉蓋玻片，不得用鑷子剝掉以防組織脫掉。（11）切片不能厚于4um，否則易脫片或者染色太重。[4]（12）蘇木精復(fù)染要淡染，以免染色深遮蓋了DAB的顯色。（13）操作人員帶一次性手套、口罩等，避免RNA酶污染。[5]（14）標(biāo)本固定及時充分，越早固定越好，防止標(biāo)本變性自溶、HPV-DNA丟失而致假陰性或陽性減弱。新鮮標(biāo)本立即入4%中性緩沖甲醛內(nèi)固定，防止基因降解，出現(xiàn)無雜交信號或信號微弱。

原位雜交技術(shù)檢測HPV可以明確病變組織是否是由HPV感染引起，如果是HPV感染，臨床就必須有針對性的對患者長期、系統(tǒng)、規(guī)范治療，以便于患者了解疾病情況做好有針對性的配合，避免治療的盲目性和花冤枉錢，更為重要的是有效切斷癌變進程，防止進一步發(fā)展成癌癥（如陰莖癌、宮頸癌等）。因為人乳頭瘤病毒（HPV)與一些良性疾病（如生殖器疣，尖銳濕疣）和腫瘤性病變（如上皮內(nèi)瘤變，宮頸癌、陰莖癌）密切相關(guān)[1]，HPV感染是這些疾病發(fā)生的必要條件。而不是不問青紅皂白，見疣、見瘤一燒了之，或切掉大吉，不做常規(guī)病理，更不查HPV，等疣復(fù)發(fā)后再切，對患者不負(fù)責(zé)任，造成患者不必要的痛苦[4]。但也不要見HPV色變，如果只是一過性的感染或者低危型HPV感染且個人身體免疫力強經(jīng)過規(guī)范治療則會康復(fù)，因為只有HPV多次長期持續(xù)感染則會致瘤致癌。

但該項目要以常規(guī)病理的形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)是否有空泡等形態(tài)異常來確定是否做原位雜交檢測HPV，以防濫用原位雜交而增加患者不必要的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。本法是基于病因?qū)W，是查疾病的致病源。常規(guī)病理和原位雜交檢測HPV要相結(jié)合，有時還要進行DNA倍體分析等檢測來診斷。

[1] 楊 彬.HPV檢測及分子標(biāo)記在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志,2009,16(4):320.

[2] 周 偉,耿建祥,韓惦梅.原位雜交HPVDNA檢測技術(shù)應(yīng)用及體會[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2009,25(4):446-447.

[3] 熊紅梅,邱曉明.原位雜交HPVDNA制片技術(shù)常見問題分析[J].診斷病理學(xué)雜志,2011,18(1):70.

[4] 鄧國華,張 洵.人乳頭瘤病毒與宮頸癌[J].診斷病理學(xué)雜志, 2009,16(6):469.

[5] 王 穎,陳定寶,沈丹華.常規(guī)病理診斷中應(yīng)用原位雜交和免疫組化方法檢測EB病毒的體會[J].診斷病理學(xué)雜志,2011,18(2):160.

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ISSN.2095-8803.2016.10.029.02