黎李平 張容容 雷含珺 王曉玲

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靈芝三萜液體發(fā)酵技術(shù)研究進展

黎李平 張容容 雷含珺 王曉玲*

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410004）

靈芝三萜是靈芝的重要藥效成分，液體發(fā)酵技術(shù)是大量獲取靈芝三萜的重要途徑。概述靈芝發(fā)酵產(chǎn)三萜的菌株篩選，培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵技術(shù)，三萜液體發(fā)酵動力學(xué)，三萜生物合成的相關(guān)酶和基因表達調(diào)控等，綜述靈芝三萜液體發(fā)酵的最新研究進展，并對今后的相關(guān)研究進行了展望。

靈芝；靈芝三萜；液體發(fā)酵；發(fā)酵動力學(xué)；研究進展

靈芝藥用價值很高，自古以來被人們視為延年益壽的藥材，特定的靈芝種又名赤芝（學(xué)名，過去曾一直用）[1]。三萜和多糖是靈芝最主要的兩大類活性成分。靈芝三萜化學(xué)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，分子量一般為400～600。依據(jù)結(jié)構(gòu)和官能團不同，靈芝三萜包括靈芝酸、靈芝孢子酸、靈芝內(nèi)酯、靈芝醇、靈芝醛、赤靈酸、靈赤酸、赤芝酮等約20類化合物?，F(xiàn)代藥理研究證明，三萜類化合物具有抗腫瘤、防止動脈硬化、保肝、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、提高免疫力、抗衰老等多種功能[2～6]。傳統(tǒng)栽培的靈芝，子實體形成周期長，勞動強度大。發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展使其成為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)活性物質(zhì)的主要方法[7，8]。通過發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)靈芝三萜已成為國內(nèi)外的研究熱點。本文從靈芝發(fā)酵菌種的篩選，液體發(fā)酵工藝的優(yōu)化以及三萜發(fā)酵動力學(xué)、三萜合成調(diào)控等方面，對液體發(fā)酵合成和獲取靈芝三萜的最新研究進展進行綜述。

1 靈芝三萜發(fā)酵菌株的研究

靈芝屬的種質(zhì)資源十分豐富，僅在我國就發(fā)現(xiàn)98種，但目前對靈芝的研究主要集中在赤芝和松杉靈芝（）兩個種。楊曉彤等對5個種的20多個菌株的液體發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，除藥典批準的和2個種外，其余3個種也可在發(fā)酵過程中產(chǎn)生含量與之接近并有抑瘤活性的靈芝三萜[8～10]。研究還發(fā)現(xiàn)，就同一種而言，菌株差異也顯著影響三萜的產(chǎn)量。在發(fā)酵中選用經(jīng)過篩選的特定菌株是提高三萜產(chǎn)量的有效途徑之一。如余素萍等已在種內(nèi)篩選出三萜高產(chǎn)菌株31[11]。

在菌株誘變選育方面，李剛等通過原生質(zhì)體紫外誘變，成功獲得了2株代謝產(chǎn)物含量和產(chǎn)量明顯高于原始菌株的誘變株[12]。陸正清等采取原生質(zhì)體融合等方法打破靈芝菌絲體的正常代謝，使之失去自我保守性的調(diào)節(jié)控制，從而得以快速生長并大量積累目標代謝產(chǎn)物靈芝酸等[13]。

迄今，靈芝菌株的研究仍停留在傳統(tǒng)的菌株篩選，采用基因工程手段改良菌株的相關(guān)研究尚未見報道。

2 靈芝三萜液體深層發(fā)酵工藝

2.1 培養(yǎng)基及其優(yōu)化

目前，已有許多學(xué)者對靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化研究，但是由于研究的供試菌株及原材料不同，培養(yǎng)基優(yōu)化的結(jié)果也不盡相同，難以相互比較。

（1）碳源。劉冬等對15種常用碳源進行篩選研究，發(fā)現(xiàn)最適碳源為葡萄糖[14]。Fang Q.H.等研究表明，靈芝以葡萄糖為碳源時，其最適濃度為2%～5%[15]。白芳靜等的試驗結(jié)果與其一致，葡萄糖濃度過高（如8%），不利于菌絲生長和產(chǎn)物形成[16]。Xu Peng等研究碳源對靈芝菌絲體生物量和三萜酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖有利于菌絲體生長，而玉米粉則有利于三萜酸的積累，當以兩者作為復(fù)合碳源時菌絲體生物量和三萜酸產(chǎn)量均可顯著提高，分別比對照組提高了18%和64%[17]。以上研究均表明靈芝菌株較適宜的碳源多為葡萄糖。葡萄糖的成本較高，Zapata P.等為降低培養(yǎng)基成本，試驗以大麥粉和NH4Cl為主要基質(zhì)同時發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲體、多糖和靈芝酸（靈芝三萜），結(jié)果表明，靈芝菌絲體可達23.49 g/L，靈芝酸的產(chǎn)量也達到較高水平，為299.67±11.63 mg/L[18]。

（2）氮源。靈芝的較適宜的氮源多為有機氮源，如蛋白胨或酵母浸粉[7,15,17,19]。Fang Q.H.研究表明當碳源不變，以酵母浸粉和蛋白胨混合作為復(fù)合氮源發(fā)酵培養(yǎng)，添加量各為5 g/L時靈芝酸產(chǎn)量最高[19]。此外，碳氮比對菌絲生長和三萜產(chǎn)物的形成具有重要影響。楊焱等研究發(fā)現(xiàn)靈芝發(fā)酵過程的C/N比值在18～25之間對多糖的生成最為有利。根據(jù)C源的合適濃度，N源在培養(yǎng)基中的比例應(yīng)為0.1%～0.2%[20]。

（3）無機鹽離子。靈芝在液體發(fā)酵過程中添加少量的無機鹽有利于目標產(chǎn)物的產(chǎn)生。分析已有文獻發(fā)現(xiàn)，通常Mg2+、K+和P5+是靈芝菌絲體正常生長的必要條件[15,17,19]。劉東等研究表明K+、Mg2+、P5+的缺乏尤其是K+的缺乏對菌絲體生長影響較大[14]。胡志斌等探討不同水平的亞硒酸鈉對靈芝菌絲體生長的影響，發(fā)現(xiàn)硒對靈芝菌絲生長有促進作用，在濃度為250 μg/mL時其生物量最大[21]。姚強等試驗發(fā)現(xiàn)，適當質(zhì)量濃度的稀土元素可以顯著提高靈芝多糖和三萜的產(chǎn)量，其中鐠元素對多糖和胞內(nèi)三萜的合成效果較明顯，而鑭元素對胞外三萜合成的誘導(dǎo)效果較好[22]。

2.2 發(fā)酵條件

（1）pH。pH對菌絲體生長影響極大，過酸過堿都不利于其生長。靈芝菌絲體在偏酸性條件下生長較好，一般培養(yǎng)靈芝的適宜pH范圍為5.0～6.5。但針對生產(chǎn)不同產(chǎn)物的最適初始pH并不相同。Fang Q.H.等研究表明以菌絲體生物量和靈芝酸為目標時，初始pH最佳為6.5左右，即為培養(yǎng)基的自然pH[23]。Leandro P.等發(fā)現(xiàn)pH為3.5時胞外多糖產(chǎn)量高[24]。衛(wèi)軍等研究發(fā)現(xiàn)pH為6.5時其菌絲體生物量大[25]。pH梯度或階段控制有利于重要產(chǎn)物如靈芝酸的形成。Tang Y.J.等在靈芝液體發(fā)酵過程中，通過兩階段pH控制技術(shù)，即發(fā)酵的前4天控制pH 3.0，后6天控制pH 4.5時，靈芝酸的產(chǎn)量提高到321.6mg/L，效果顯著[26]。

（2）溫度。靈芝發(fā)酵的生長溫度范圍較廣，考慮到菌株差異及其他發(fā)酵因素的影響，選擇合適的溫度極其重要。適合菌絲生長的溫度為25～28 ℃，而宋景平等研究表明，稍高于此范圍的溫度（27～30 ℃）能提高目的三萜的產(chǎn)量[27]。衛(wèi)軍等研究表明菌絲體在28 ℃時生長迅速，生物量達到最大[25]。而Chang M.Y.等研究發(fā)現(xiàn)菌株生長最適溫度為34 ℃[28]。

（3）培養(yǎng)時間。靈芝搖瓶培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程的產(chǎn)物形成時間的順序依次為：胞外多糖，三萜。選擇合適的培養(yǎng)時間是關(guān)鍵。余素萍等收取不同培養(yǎng)時間的菌絲，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)前期的三萜類成分少，含量低，活性低，只有在培養(yǎng)96 h時生物量最大，且到達培養(yǎng)后期各組分不再增加，只在含量上發(fā)生改變[11]。徐濟責(zé)等研究發(fā)現(xiàn)，最佳培養(yǎng)時間為5天，此時菌絲密度和生物轉(zhuǎn)化率最大[29]。而王曉玲等在研究靈芝三萜酸分批發(fā)酵的非結(jié)構(gòu)動力模型時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)到3～7天時胞內(nèi)三萜酸大量合成，而胞外三萜則于4～7天時大量合成，并都在第7天時達到最大[30]。在實際生產(chǎn)中應(yīng)當按照對不同產(chǎn)物的要求選擇恰當?shù)呐囵B(yǎng)時間。

（4）溶氧。靈芝是好氧性真菌，氧在靈芝三萜發(fā)酵過程中比較重要。李平作等發(fā)現(xiàn)，在25 L發(fā)酵罐內(nèi)選擇1︰0.75 v/（v·m）的通風(fēng)量和180 r/min的轉(zhuǎn)速效果較好。通風(fēng)可增加最終生物量，較低的溶氧環(huán)境可促進靈芝酸的產(chǎn)量[31]。Xu J.W.等采用先通氣振蕩，后靜置培養(yǎng)的方法培養(yǎng)菌絲體，結(jié)果顯示靈芝酸產(chǎn)量明顯提升[32]。因此，控制好溶氧量是靈芝發(fā)酵的重要調(diào)控策略之一。

（5）添加外源物質(zhì)對三萜發(fā)酵的影響。靈芝發(fā)酵過程參數(shù)的優(yōu)化和調(diào)控是常用于提高三萜產(chǎn)量的方法，但有時在其發(fā)酵體系中加入一些外源物質(zhì)干預(yù)其代謝途徑，也能獲得高產(chǎn)量的目標產(chǎn)物。

已有研究結(jié)果表明，不同種類真菌激發(fā)子的不同濃度及添加時間都會對三萜類的產(chǎn)生發(fā)生不同的影響：頂頭孢激發(fā)子在發(fā)酵初期以120 μg/mL的濃度加入培養(yǎng)物中，三萜類物質(zhì)的積累提高了5.2倍；木霉木素激發(fā)子在后期（第5天）以80 μg/mL的濃度加入培養(yǎng)物中，三萜類物質(zhì)的積累提高了4.0倍[33]。2012年畢澎洋考察了薏苡仁酯不同添加量及添加時間對靈芝深層發(fā)酵的影響，顯示在發(fā)酵24 h時添加0.2%薏苡仁酯對促進靈芝酸的產(chǎn)生效果顯著[34]。我們實驗室曾將蜣螂添加到靈芝發(fā)酵體系中，結(jié)果靈芝胞外三萜的總含量顯著增加，其產(chǎn)量從對照的220.2±9.7 mg/L提高到304.3±11.8 mg/L，且合成一個EGT-1新組分，鑒定為四環(huán)三萜化合物 lucitone C[35～37]。

3 靈芝三萜發(fā)酵動力學(xué)

王曉玲等利用Sigmoid函數(shù)構(gòu)建靈芝細胞生長、底物消耗、胞內(nèi)和胞外三萜酸的非結(jié)構(gòu)動力學(xué)模型，通過Boltzmann擬合求解出各模型參數(shù)[38]。結(jié)果表明，各模型預(yù)測值較好地吻合實驗值。靈芝細胞生長速率在第2.5天達到最大值（max），為0.700 d?1；葡萄糖比消耗速率在第2.4天達到最大值（qS, max）為1.060 d?1；胞內(nèi)三萜酸比合成速率在第4.7天達到最大值（qITA, max），為11.345 mg/（g·d）；胞外三萜酸比合成速率在第5天達到最大值（qETA, max），為10.077 mg/（g·d）。這與徐鵬等的實驗結(jié)果基本一致：細胞最大比生長速率μ為4.63×10-2h-1，葡萄糖最大比消耗速率qS, max為6.70×10-2h-1，靈芝酸最大比合成速率qGA, max為9.09×10-4h-1；靈芝酸的合成與細胞的生長呈現(xiàn)偶聯(lián)關(guān)系，偶聯(lián)系數(shù)αGA為0.020 4 g g-1[39]。

以上研究結(jié)果表明，Sigmoid模型在靈芝真菌生長和胞內(nèi)外三萜酸形成規(guī)律的擬合方面有較好的適應(yīng)性，研究結(jié)果為分批發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝三萜酸提供了理論依據(jù)。另據(jù)靈芝發(fā)酵動力學(xué)的規(guī)律，控制發(fā)酵過程中的一些重要影響因子，將會顯著改變發(fā)酵結(jié)果。靈芝三萜（靈芝酸）在發(fā)酵后期才迅速合成，根據(jù)這個特點，方慶華等[40]提出兩階段培養(yǎng)模式，即在4天搖床培養(yǎng)之后再接以12天的靜置培養(yǎng)，相對于連續(xù)搖瓶7天的培養(yǎng)結(jié)果，靈芝酸產(chǎn)量大為提高（3.19 mg /100 mg干菌絲）。

4 靈芝三萜生物合成的相關(guān)酶和基因

三萜作為靈芝的重要藥效成分，其提取、分離和藥理作用方面已有大量研究，但靈芝三萜在靈芝細胞中是如何合成的，其合成途徑怎樣，涉及的相關(guān)合成酶和基因是什么等基礎(chǔ)科學(xué)問題至今仍不明晰。目前國內(nèi)外三萜合成的研究大多集中在植物中三萜的合成，對植物三萜合成前體的途徑比較清楚，但最終三萜產(chǎn)物合成的具體途徑和相對應(yīng)的復(fù)雜的酶系統(tǒng)尚不明了。靈芝三萜的前期合成與其他植物中三萜的合成類似，都是從甲羥戊酸（MVP）開始，三萜前體至羊毛甾醇階段的合成途徑也與其他植物中三萜的合成途徑類似。如Shang C.H.等經(jīng)克隆其中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因，表達分析表明，HMGR與靈芝重要三萜（靈芝酸）的生物合成呈正相關(guān)，且認為HMGR是甲羥戊酸（MVP）的限速酶[41]。對另外兩個靈芝合成前體的重要酶鯊烯合成酶（SQS）基因和2,3-環(huán)氧角鯊烯羊毛甾醇環(huán)化酶（OSC）基因的研究發(fā)現(xiàn)，這兩個基因可以在靈芝菌絲生長階段表達，但形成原基后的表達量顯著提高，靈芝三萜含量分析也表明，在原基階段的含量比菌絲體階段的含量高[42，43]。說明這兩個酶是靈芝三萜合成的關(guān)鍵酶。另據(jù)法呢基焦磷酸合酶（FPPS）基因表達的分析結(jié)果，F(xiàn)PPS基因也可以在靈芝菌絲生長階段表達，但形成原基后的表達量顯著提高。靈芝三萜含量分析還表明，在原基階段的含量比菌絲體階段的含量高[44]?？梢奆PPS也是靈芝三萜合成的關(guān)鍵酶。

上述研究初步了解了靈芝三萜合成前期的相關(guān)酶和基因，但迄今對于靈芝三萜最終產(chǎn)物的合成途徑，即后期基因修飾和轉(zhuǎn)化途徑仍不清楚。近兩年，靈芝的全基因組測序已完成：靈芝基因組大小約43.3 Mb，由13條染色體組成，編碼16 113個預(yù)測基因。序列分析結(jié)果對靈芝三萜合成的有關(guān)基因有了初步了解，編碼細胞色素P450（CYPs）的基因中有78 個CYP基因與靈芝三萜重要前體羊毛甾醇的合成酶（LSS）共表達，提示這些CYP可能與靈芝三萜的合成有關(guān)[45]。進一步分析，有280個基因被成功注釋，其中包括3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因和24個編碼細胞色素P450（CYPs）基因[46]。

5 展 望

目前，研究者們在優(yōu)良菌株的選育、培養(yǎng)基的篩選、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、發(fā)酵工藝的改良等方面進行了大量的探索，提高了靈芝三萜發(fā)酵的技術(shù)水平。但在研究和生產(chǎn)中仍存在許多問題，如在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中發(fā)酵培養(yǎng)基成本相對較高，需要不斷尋找較廉價的新的培養(yǎng)基質(zhì)，在保持發(fā)酵產(chǎn)量不顯著降低的情況下，降低生產(chǎn)成本。在實驗室階段試驗成功的一些較復(fù)雜的過程控制策略和技術(shù)，如連續(xù)發(fā)、補料分批分階段發(fā)酵等技術(shù)在放大試驗或者在實際規(guī)模化生產(chǎn)中會存在較大困難，一些技術(shù)環(huán)節(jié)很難實現(xiàn)，同時較復(fù)雜的技術(shù)過程還易染菌等問題均有待解決。因此，研究和開發(fā)適合規(guī)模化生產(chǎn)的靈芝三萜發(fā)酵技術(shù)是十分必要的。

在基礎(chǔ)研究方面，國內(nèi)外對靈芝三萜的研究主要集中在三萜組分的分離、結(jié)構(gòu)鑒定、藥理作用及其作用機制等方面。但對靈芝三萜合成的途徑，以及合成途徑的調(diào)控方面的研究還十分薄弱。此外，適合絲狀真菌靈芝發(fā)酵生產(chǎn)三萜的相對柔和的生物反應(yīng)器（發(fā)酵罐）的設(shè)計和試驗研究也有待加強。隨著靈芝三萜合成途徑及合成調(diào)控基礎(chǔ)研究的不斷深入，相應(yīng)高效定向發(fā)酵技術(shù)的不斷成熟，以及各種相應(yīng)大型生物反應(yīng)器的研制成功，必將提高靈芝三萜的發(fā)酵水平和生產(chǎn)效率，推進靈芝三萜工業(yè)化生產(chǎn)的進程。

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Advances on triterpenes ofproduction by submerged fermentation

Li Liping Zhang Rongrong Lei Hanjun Wang Xiaoling*

（College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha, Hunan 410004, China）

Triterpenes is the key pharmacologically active ingredient of. Submerged fermentation is viewed as a promising alternative for efficient production of triterpenes of. In this paper, the research progress on the strain screening, fermentation media, process technology, fermentation kinetics, the related key enzyme and genes of triterpenes biosynthesis were reviewed. In addition, the future relevant research on triterpenes oflingzhi produced by fermentation is prospected.

; triterpenes; submerged fermentation; fermentation kinetics

S646

A

2095-0934（2016）05-294-06

湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項目（12K069）

黎李平（1991—），男，漢族，在讀碩士生，主要從事食用真菌發(fā)酵技術(shù)研究

王曉玲，E-mail：cathy8311@163.com