響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2提取青花椒麻味成分的工藝條件

盧友慶，薛小輝，蒲 彪

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

日常生活中所說(shuō)的青花椒是指的青花椒的干燥果皮[1]?；ń吩谥袊?guó)作為特色辛香料和中藥材有著悠久的歷史，四川漢源的花椒自唐代開(kāi)始就為貢品，因此，被稱為“貢椒”?；ń吩谥袊?guó)具有較大的種植面積，山東泰安、山西運(yùn)城、陜西韓城、四川金陽(yáng)和重慶江津都是花椒的生產(chǎn)基地，已成為各地的主要經(jīng)濟(jì)作物。

青花椒的主要成分有揮發(fā)油、生物堿、酰胺類物質(zhì)、木脂素、香豆素和脂肪酸，另外還有一些含量較少的成分比如烴類、甾醇及黃酮甙類等[2-4]。揮發(fā)油和酰胺類物質(zhì)是花椒的主要風(fēng)味物質(zhì)。酰胺類物質(zhì)為花椒的麻味成分，除了作為調(diào)味品以外，它還具有抑菌殺蟲(chóng)[5-7]、抗氧化作用[8]、抗癌作用[9]、抑制血小板凝固和減少心腦血管疾病等作用。目前多數(shù)研究主要針對(duì)花椒揮發(fā)油的研究，對(duì)花椒麻味成分的研究較少，特別是針對(duì)其高效萃取分離方法的研究更少。分析花椒麻味成分的組分與找出更有效的萃取分離方法對(duì)促進(jìn)花椒麻味成分的研究進(jìn)展具有重要意義?；ń凤L(fēng)味物質(zhì)的總萃取量是實(shí)際生產(chǎn)中衡量花椒萃取工藝好壞的重要指標(biāo)之一，可為花椒麻味成分的萃取提供數(shù)據(jù)參考。本文主要針對(duì)超臨界CO2的高效快速的萃取特點(diǎn)，對(duì)其工藝進(jìn)行研究，此工藝更適合工廠大量萃取分離花椒麻味成分。本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化花椒麻味成分的提取工藝旨在克服傳統(tǒng)提取方法中溶劑殘留、提取率低的問(wèn)題，便于提取物更好的應(yīng)用到食品添加劑和醫(yī)藥等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青花椒 2012年四川金陽(yáng)產(chǎn)的青花椒；CO2氣體 純度大于99%；無(wú)水乙醇 分析純。

UV-3000PC型掃描型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Es-10K型電子天平、FA2004型電子天平、RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHBⅢ型循環(huán)水多用真空泵 菏澤市鑫源儀器儀表有限公司；LX-04型多功能粉粹機(jī) 上海江信科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青花椒麻味成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 本實(shí)驗(yàn)中采用的青花椒麻味成分標(biāo)準(zhǔn)品為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)自制標(biāo)品。將花椒麻味成分的粗提物經(jīng)過(guò)D152樹(shù)脂脫色、硅膠柱層析、聚酰胺層析和凝膠層析，得到的物質(zhì)經(jīng)紅外光譜和質(zhì)譜分析，與現(xiàn)有的花椒酰胺類物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，推斷為羥基-α-山椒素或羥基-β-山椒素。此物質(zhì)是花椒麻味成分的主要組成成分，因此以該物質(zhì)作為花椒花椒麻味成分的標(biāo)品繪制花椒麻味成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 青花椒麻味成分的提取工藝 青花椒→干燥→粉碎→過(guò)篩→稱重（稱取150g）→裝料→控制合適的溫度、壓力等實(shí)驗(yàn)條件→在超臨界狀態(tài)下萃取由分離釜Ⅱ獲得麻味物質(zhì)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取花椒150g按照1.2.2提取花椒麻味物質(zhì)，稱取0.5g麻味物質(zhì)，溶于1mL 70%乙醇中，稀釋20倍后取3mL放入裝有1g D152樹(shù)脂的三角瓶中，保鮮膜封口放在振蕩培養(yǎng)箱中過(guò)夜，取濾液稀釋10000倍后在254nm條件下測(cè)其紫外吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算花椒麻味物質(zhì)的含量，然后換算得到150g花椒中麻味物質(zhì)的質(zhì)量。

選取花椒粒度、萃取時(shí)間、萃取溫度、萃取壓力、分離器Ⅰ溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以麻味物質(zhì)的萃取率為指標(biāo)，指標(biāo)的計(jì)算如下：

1.2.4 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間作自變量，進(jìn)行三因素三水平的Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)，固定花椒粒度為200目；分離器溫度Ⅰ為30℃、壓力為12MPa；分離器Ⅱ壓力為8MPa，溫度為37℃；精餾柱壓力5MPa，溫度依次為35、40、45、50℃；CO2流量為19L/h。以花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量為響應(yīng)值，優(yōu)化提取工藝，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼如表1所示。

表1 花椒麻味物質(zhì)提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Coded variables and their coded levels in response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Design Expert 8.0分析軟件及Excel程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒麻味成分標(biāo)準(zhǔn)曲線

將花椒麻味成分標(biāo)品進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.02936X，R2=0.9999，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 花椒麻味成分標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of spicy component

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 花椒粒度的影響 萃取壓力為32MPa、溫度為55℃；分離器Ⅰ壓力為12MPa，溫度為30℃；分離器Ⅱ壓力為8MPa，溫度為37℃；精餾柱壓力5MPa，溫度分別為35、40、45、50℃；CO2流量為19L/h?？疾?0、20、40、60、80目花椒萃取2h后花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 花椒粒度對(duì)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量的影響Fig.2 The effect of finness of pulverization spicy compenent weight and the extraction gross

由圖2可知，目數(shù)對(duì)麻味物質(zhì)和萃取總量的影響趨勢(shì)大致相同，隨著目數(shù)的增加兩者含量都出現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量在20目的時(shí)候達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)急劇的下降趨勢(shì)，40目以后兩者的下降明顯減少趨于穩(wěn)定。隨著粉碎程度的增加，對(duì)花椒的破壞越大，越有利于CO2溶解花椒中的麻味成分和其他有效成分，但是在高壓下CO2對(duì)花椒具有壓實(shí)作用，粒度過(guò)小高壓下會(huì)將原料壓實(shí)，減少原料之間的空隙，因此也減少了CO2與原料的接觸，從而降低萃取效果。因此20目是最佳的花椒粉碎粒度，此粒度下CO2會(huì)充分的經(jīng)過(guò)原料內(nèi)部細(xì)小的空隙，CO2與花椒的接觸面積達(dá)到最大。

2.2.2 萃取時(shí)間的影響 萃取壓力為32MPa、溫度為55℃；分離器Ⅰ壓力為12MPa，溫度為30℃；花椒目數(shù)為20目。考察萃取時(shí)間1.0、1.5、2.0、2.5、3h對(duì)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量的影響Fig.3 The effect of extraction time spicy compenent weight and the extraction gross

由圖3可以看出，隨著萃取時(shí)間的增加，花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量在1.5h時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，2h和2.5h的花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量基本相同，但在3h的時(shí)候花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量又得到增加，這可能是因?yàn)?.5h正好是一個(gè)分離周期，在1.5～3h內(nèi)又進(jìn)行了一次分離，將萃取釜和精餾柱中及循環(huán)系統(tǒng)中的花椒麻味物質(zhì)分離出來(lái)，但是相比較第一個(gè)分離周期分離得到的花椒麻味物質(zhì)還是有所減少，這可能是因?yàn)檫€有部分花椒麻味物質(zhì)存在CO2循環(huán)系統(tǒng)中。時(shí)間太短不能充分的提取出所有麻味物質(zhì)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)花椒麻味物質(zhì)會(huì)隨著CO2進(jìn)入氣體循環(huán)系統(tǒng)，從而減少其得量。萃取總量隨著萃取時(shí)間的增加而增加，但是增長(zhǎng)比較緩慢。結(jié)合兩者選擇1.5h為最佳萃取時(shí)間。

2.2.3 萃取溫度的影響 分離器Ⅰ壓力為12MPa、分離器Ⅰ溫度為30℃、萃取壓力為32MPa、萃取時(shí)間1.5h、花椒目數(shù)20目條件下，考察萃取溫度分別為35、40、45、50、55℃對(duì)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量在45℃時(shí)都達(dá)到最大值。溫度太低CO2的溶解力較低，隨著溫度的升高溶解力增加，但是萃取溫度達(dá)到45℃以后CO2的密度降低，萃取率也會(huì)降低。因此45℃為最佳萃取溫度。

圖4 萃取溫度對(duì)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量的影響Fig.4 The effect of extraction temperature spicy compenent weight and the extraction gross

2.2.4 分離器Ⅰ溫度的影響 萃取壓力為32MPa、萃取溫度為45℃、分離器Ⅰ壓力為12MPa、萃取時(shí)間1.5h條件下，考察分離器Ⅰ溫度分別為30、35、40、45、50℃對(duì)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 分離器Ⅰ溫度對(duì)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量的影響Fig.5 The effect of separatorⅠtemperature spicy compenent weight and the extraction gross

由圖5可以看出，分離器Ⅰ溫度在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最小值時(shí)兩者的量最高，隨著溫度升高反而減小，花椒麻味物質(zhì)的分離主要在分離器Ⅰ中進(jìn)行，分離器溫度太高，花椒麻味物質(zhì)會(huì)隨著CO2進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，得量降低。設(shè)備分離器Ⅰ的最低設(shè)定溫度為30℃，因此30℃為最佳的分離溫度。

圖6 萃取壓力對(duì)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量的影響Fig.6 The effect of extraction press spicy compenent weight and the extraction gross

2.2.5 萃取壓力的影響 萃取溫度為45℃、分離器Ⅰ壓力為12MPa、分離器Ⅰ溫度為30萃取溫度為45℃、分離器Ⅰ壓力為12MPa、萃取時(shí)間1.5h條件下，萃取時(shí)間1.5h條件下，考察萃取壓力分別為22、25、28、31、34MPa對(duì)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，萃取壓力在28MPa時(shí)麻味物質(zhì)的質(zhì)量和萃取總量最高。萃取壓力與CO2的溶解力和CO2與花椒的接觸面積有著復(fù)雜的關(guān)系，并不是壓力越大越好。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化超臨界CO2提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 由Design Expert（8.0版）統(tǒng)計(jì)分析軟件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)功能可知，三因素三水平的中心組合設(shè)計(jì)包括15個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，具體的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 花椒麻味物質(zhì)提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2.3.2 回歸方程的建立檢驗(yàn) 據(jù)表2結(jié)果，建立花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量與萃取壓力A、萃取溫度B、萃取時(shí)間C的三因素三水平回歸方程為：Y=2.51+0.19A-0.27B-8.087E-0.03C-0.33AB+0.11AC+0.091BC-0.47A2+0.43B2-0.15C2。方差分析見(jiàn)表3。

由表3的方差分析可知，回歸方程的失擬性檢驗(yàn)p=0.1124，差異不顯著，表明所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)?；回歸方程的顯著性檢驗(yàn)p=0.0002，差異極顯著，說(shuō)明該模型的擬合程度較好，模型成立。

各因素對(duì)花椒麻味物質(zhì)質(zhì)量的影響程度大小依次為：萃取溫度（B）＞萃取壓力（A）＞萃取時(shí)間（C），其中萃取溫度、萃取壓力呈極顯著影響，萃取時(shí)間影響不顯著?？疾煲蛩亻g的交互作用，由方差分析表可知，AB存在極顯著的交互作用，AC存在顯著的交互作用。綜上，在α=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化后的方程為：Y=2.51+0.19A-0.27B-0.33AB+0.11AC-0.47A2+0.43B2-0.15C2。

用Design Expert 8.0軟件根據(jù)響應(yīng)方程繪制AB和AC的響應(yīng)曲面分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。

由圖7可以看出，花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量隨著萃取溫度的升高而降低，45℃以后又升高，但是趨勢(shì)不是很明顯，與單因素時(shí)萃取溫度的走勢(shì)有一定的差異，這可能是由于萃取壓力與萃取溫度之間存在極顯著交互作用。

圖7 萃取壓力與萃取溫度的交互作用Fig.7 The effects of extraction press and extraction temperature

表3 花椒麻味物質(zhì)提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis variance of the constructed regression equation for the weight of spicy compenent

圖8 萃取壓力與萃取時(shí)間的交互作用Fig.8 The effects of extraction press and extraction time

由圖8可知，花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量隨著萃取壓力增加的變化趨勢(shì)是先升高后降低，隨著萃取時(shí)間增加的變化趨勢(shì)是增加速率逐漸減少的增加過(guò)程，這與萃取時(shí)間、萃取壓力的單因素實(shí)驗(yàn)比變化趨勢(shì)有一定差異，可能原因是萃取壓力與萃取時(shí)間之間存在顯著交互作用。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由軟件分析得最優(yōu)條件為：萃取壓力為28.8MPa、萃取溫度45℃、萃取時(shí)間89.1min，此時(shí)花椒麻味物質(zhì)的理論萃取質(zhì)量為3.35g?？紤]到工廠實(shí)際操作，修正萃取壓力為29MPa，萃取時(shí)間為89min。在分離器Ⅰ壓力為12MPa、分離器Ⅰ溫度為30℃、分離器Ⅱ壓力為8MPa、分離器Ⅱ溫度為37℃、精餾柱壓力5MPa、精餾柱溫度依次為35、40、45、50℃，CO2流量為19L/h下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際萃取質(zhì)量為3.3g，相對(duì)誤差為1.49%，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論與討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)建立的超臨界CO2提取花椒麻味物質(zhì)的條件優(yōu)化數(shù)學(xué)回歸模型為：Y=2.51+0.19A-0.27B-0.33AB+0.11AC-0.47A2+0.43B2-0.15C2，采用此模型在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量。

3.2 通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析可知，在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)各因素的影響程度依次為：萃取溫度（B）＞萃取壓力（A）＞萃取時(shí)間（C），其中萃取溫度、萃取壓力呈極顯著影響，萃取時(shí)間無(wú)顯著影響，AB之間存在極顯著的交互作用，AC之間存在顯著的交互作用。確定的最佳工藝條件為萃取壓力為29MPa，萃取溫度45℃，萃取時(shí)間89min，分離器Ⅰ壓力為12MPa，分離器Ⅰ溫度為30℃、分離器Ⅱ壓力為8MPa、分離器Ⅱ溫度為37℃、精餾柱壓力5MPa，精餾柱溫度依次為35、40、45、50℃，此時(shí)花椒麻味物質(zhì)的萃取質(zhì)量為3.3g，萃取率為2.2%。

3.3 目前，對(duì)花椒麻味物質(zhì)提取的研究一般只以得到的萃取物的總量作為參考指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室自制的花椒麻味物質(zhì)標(biāo)品所得標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)一步得到萃取物中花椒麻味物質(zhì)的準(zhǔn)確含量，能更為準(zhǔn)確和全面地考察實(shí)驗(yàn)因素的影響，得到的回歸模型和工藝參數(shù)可信度高，能較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)實(shí)際值。響應(yīng)實(shí)驗(yàn)所得到的150g花椒麻味物質(zhì)含量比單因素實(shí)驗(yàn)高，表明響應(yīng)面優(yōu)化超臨界CO2提取花椒麻味物質(zhì)的工藝具有可行性，可為實(shí)際生產(chǎn)研究提供一定的數(shù)據(jù)參考。

3.4 目前在工業(yè)上，花椒風(fēng)味物質(zhì)的提取主要是植物油浸提法、超臨界CO2萃取，但是目前的研究超臨界CO2萃取物大部分都是花椒精油與花椒麻味物質(zhì)的混合物[10]，沒(méi)有將二者有效的分離開(kāi)，不能充分的應(yīng)用到醫(yī)藥等方面。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)設(shè)備具有精餾柱達(dá)到了多級(jí)分離的效果，使花椒麻味物質(zhì)與花椒所含的其他物質(zhì)得到很好的分離。

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