付慧英，黃　燦,鄢業(yè)鴻，彭小東，張志謙

(1.中國(guó)人民解放軍第94醫(yī)院腫瘤科,南昌 330001； 2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.腫瘤科； b.普外科,南昌 330006; 3.南昌市第三醫(yī)院肝膽外科,南昌330009)

?

CHAF1A在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

付慧英1，黃燦2a,鄢業(yè)鴻2b，彭小東2a，張志謙3

(1.中國(guó)人民解放軍第94醫(yī)院腫瘤科,南昌 330001； 2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.腫瘤科； b.普外科,南昌 330006; 3.南昌市第三醫(yī)院肝膽外科,南昌330009)

摘要：目的研究染色質(zhì)裝配因子1(Chromatin assembly factor 1，CAF-1)的最大亞基p150(CHAF1A)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的性別、年齡、病理分化、門(mén)靜脈癌栓、腫瘤大小、臨床分期、血清HBsAg狀況、肝硬化及血清AFP水平等臨床病理特征的關(guān)系。方法篩選自2010年6月至2014年10月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科行手術(shù)切除，并且全部經(jīng)過(guò)病理診斷證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌的患者80例，取對(duì)應(yīng)患者病灶邊緣2 cm處的正常肝組織80例及因外傷或肝內(nèi)膽管結(jié)石行手術(shù)切除的正常肝組織患者20例分別作為癌旁和正常對(duì)照。應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)CHAF1A在肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織中的表達(dá)，采用χ2檢驗(yàn)分析CHAF1A在這三組中的表達(dá)差異，并分析CHAF1A的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果CHAF1A在正常肝組織和癌旁肝組織的高表達(dá)率顯著高于肝癌組織(P<0.05)。CHAF1A在不同病理分化肝癌組織中的高表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)；在有無(wú)伴門(mén)靜脈癌栓肝臟組織中，高表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CHAF1A在肝癌組織中的表達(dá)與性別、年齡、臨床分期、腫瘤大小、血清HBsAg、肝硬化及血清AFP水平無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論CHAF1A的表達(dá)可能影響肝癌組織分化和侵襲性。但與肝癌患者的性別、年齡、臨床分期、腫瘤的大小、HBsAg狀況、肝硬化及血清AFP水平無(wú)相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：CHAF1A； 原發(fā)性肝細(xì)胞癌； 免疫組化； 門(mén)脈癌栓； 低分化

染色質(zhì)裝配因子1(Chromatin assembly factor 1，CAF-1，一個(gè)由p150、p60、p48三個(gè)亞基組成的異源三聚體復(fù)合物，其主要功能是作為一個(gè)組蛋白分子伴侶能沉積H3和H4到新合成的DNA復(fù)制叉上，以促進(jìn)核小體裝配的第一步[1]。隨后有報(bào)道CAF-1不但參與DNA合成、修復(fù)后染色質(zhì)裝配，而且在調(diào)控異染色質(zhì)的合成和修復(fù)中都扮演著重要的角色[2]。有報(bào)道[3]證實(shí)，CAF-1特別是p150亞基(后統(tǒng)稱(chēng)“CHAF1A”)是負(fù)責(zé)橋接細(xì)胞周期進(jìn)展和激活DNA損傷檢查點(diǎn)的關(guān)鍵基因，CAF-1/CHAF1A故障會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的細(xì)胞增殖，抵抗細(xì)胞死亡，增加基因組的不穩(wěn)定性，最終表現(xiàn)一個(gè)更具侵襲性的癌癥表型。CHAF1A被證實(shí)其的表達(dá)特性和乳腺癌、前列腺癌、舌癌、大腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等[4-12]疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。但目前CHAF1A在肝癌中表達(dá)情況的相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外很少有報(bào)道。

1資料與方法

選自2010年6月至2014年10月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科行手術(shù)切除，并且全部經(jīng)過(guò)病理診斷證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌的患者80例，取對(duì)應(yīng)患者病灶邊緣約2 cm處的正常肝組織80例及因外傷或肝內(nèi)膽管結(jié)石行手術(shù)切除的正常肝組織患者20例分別作為癌旁和正常對(duì)照。病例入組標(biāo)準(zhǔn)：1)所有患者術(shù)前均未接受其他治療(包括放療、化療及介入治療等)；2)所選患者都是第1次行肝癌根治性切除術(shù)，并且全部經(jīng)過(guò)病理診斷證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌；3)術(shù)前均行包括三大常規(guī)、生化常規(guī)、血清AFP、血清HBsAg狀況、胸腹部CT(肝增強(qiáng)掃描)、心電圖等術(shù)前常規(guī)檢查；4)20例正常肝組織患者手術(shù)前都行上述常規(guī)檢查，結(jié)果都未見(jiàn)異常。

1.1臨床病理資料

80例肝癌患者中：男72例，女8例；年齡19～72歲，中位年齡為50.72，其中<50歲的30例，≥50歲的50例；按腫瘤的大小分，其中<5 cm的36例，≥5 cm的44例；其中按高、中、低病理分化程度劃分，依次為7、66、7例；按有無(wú)伴門(mén)靜脈癌栓的劃分，伴有者15例，不伴有者65例；按臨床分期[13]劃分，Ⅰ期18例，Ⅱ期21例，Ⅲ期41例，分為Ⅰ～Ⅱ期 39例和Ⅲ～Ⅳ期 41例2組；按是否伴有肝硬化劃分，伴有者36例，不伴有者44例； AFP<400 ng·mL-1患者50例，AFP≥400 ng·mL-130例；按血清HBsAg表達(dá)狀況劃分，陽(yáng)性者57例，陰性者23例。

本實(shí)驗(yàn)中按Edmondson4級(jí)分法[14]把肝細(xì)胞癌分3個(gè)等級(jí)：Ⅰ級(jí)為高分化，Ⅱ、Ⅲ級(jí)為中分化，Ⅳ級(jí)為低分化。

1.2免疫組化

CHAF1A兔抗人單克隆一抗[EPR5576(2)](ab126625)購(gòu)自英國(guó)abcam生物科技公司。多聚賴(lài)氨酸、即用型通用二抗sp-9000(sp-9000)、DAB(zli-9032)顯色試劑，都是購(gòu)自河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,一抗稀釋度為1：200。以檸檬酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù),4e孵育過(guò)夜,DAB顯色,以胞漿染為棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)3組標(biāo)本的陰性對(duì)照都以PBS代替CHAF1A兔抗人單克隆一抗。

1.3結(jié)果判斷

由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師采取雙盲法對(duì)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果評(píng)分均采用雙評(píng)分半定量法。具體判斷方法和標(biāo)準(zhǔn)如下：

1)染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞膜或(和)胞漿上呈現(xiàn)棕黃色顆粒定，不顯色定0分，呈現(xiàn)淡黃色定1分，呈現(xiàn)棕黃色定2分，呈現(xiàn)棕褐色定3分。

2)陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：每張切片上隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的比例進(jìn)行評(píng)分，<5%為0分，5～25%為1分，25～50%為2分，>50%為3分。

3)免疫組化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：將兩分相乘，0分為“-”，1～2分為“+”，3～5分為“”，6分以上為“”。

4)表達(dá)水平判斷標(biāo)準(zhǔn)：表達(dá)水平為“-～+”定為低表達(dá)，表達(dá)水平“～”歸類(lèi)為高表達(dá)，高表達(dá)比率為表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，CHAF1A在肝癌組織與相應(yīng)癌旁肝組織及正常肝組織中高表達(dá)率之間的差異分別進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；并分別對(duì)CHAF1A在肝癌組織中表達(dá)與肝癌各臨床病理特征之間的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1CHAF1A分別在肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織中表達(dá)的比較

檢測(cè)CHAF1A在肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織的表達(dá)，結(jié)果顯示陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞漿中呈彌散或散在分布，細(xì)胞核染色為陰性。其中在80例肝癌組織中，有4例胞漿中未見(jiàn)著色，76例標(biāo)本中CHAF1A呈現(xiàn)不同的陽(yáng)性表達(dá)；而CHAF1A在所有的另外2組組織中都呈現(xiàn)不同的陽(yáng)性表達(dá)。CHAF1A在上述3類(lèi)組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為95%(76/80)、100%(80/80)、100%(20/20)，高表達(dá)率分別為47.5%(38/80)、87.5%(70/80)、95%(19/20)。(見(jiàn)封四圖1)結(jié)果顯示CHAF1A在上述3類(lèi)組織中的陽(yáng)性表達(dá)率呈上升趨勢(shì)；肝癌組織和癌旁肝組織及肝癌組織和正常肝組織之間的高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2CHAF1A在肝癌組織表達(dá)與各臨床病理特征之間的關(guān)系

2.2.1CHAF1A在肝癌組織表達(dá)與患者性別、年齡的關(guān)系

在本實(shí)驗(yàn)80例肝癌患者中男性72例，女性8例，CHAF1A在2組中的高表達(dá)率分別是48.6%(35/72)、37.5%(3/8)，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.55)。所選80例患者中年齡在19～72歲之間，平均年齡為(50.72±11.48)歲，其中<50歲的30例，≥50歲的50例，CHAF1A在2組中的高表達(dá)率分別為36.7%(11/30)、54.0%(27/50)，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.133)。見(jiàn)表1。

2.2.2CHAF1A在肝癌組織中表達(dá)與臨床分期及腫瘤大小的關(guān)系

80例肝癌患者分為Ⅰ～Ⅱ期39例和Ⅲ～Ⅳ期41例2組，高表達(dá)率分別是48.7%(19/39)、46.3%(19/41)，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.832)。80例肝癌患者腫瘤大小<5 cm的36例，≥5 cm的44例，高表達(dá)率分別是52.8%(19/36)、43.2%(19/44)，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.393)。見(jiàn)表1。

2.2.3CHAF1A在肝癌組織中表達(dá)與病理分化及門(mén)靜脈癌栓與否的關(guān)系

80例肝癌患者按高、中、低病理分化程度分為3組，CHAF1A在3組中的高表達(dá)率分別是85.7%(6/7)、47.0%(31/66)、14.3%(1/7)，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)。按有無(wú)伴門(mén)靜脈癌栓的分組，伴有者15例，不伴有者65例，CHAF1A在2組的高表達(dá)率分別是20.0%(3/15)、53.8%(35/65)，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)。見(jiàn)表1。

2.2.4CHAF1A在肝癌組織中表達(dá)與肝硬化、血清AFP水平及血清HBsAg的關(guān)系

80例肝癌患者按是否伴有肝硬化分組，其中伴有者36例，不伴有者44例(表1)，CHAF1A在2組的高表達(dá)率分別是41.7%(15/36)、52.3%(23/44)，2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.345)。80例肝癌患者中AFP≥400 ng·mL-1患者50例，AFP>400 ng·mL-130例，CHAF1A在2組的高表達(dá)率分別是52.0%(26/50)、40.0%(12/30)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.298)。按血清HBsAg表達(dá)狀況分組，陽(yáng)性者57例，陰性者23例，CHAF1A在2組高表達(dá)率分別是47.4%(27/57)、47.8%(11/23)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.970)。見(jiàn)表1。

3討論

年齡、腫瘤大小、肝硬化等臨床病理特征是原發(fā)性肝癌的預(yù)后評(píng)價(jià)因素 。在本研究中筆者檢測(cè)CHAF1A在80例肝癌組織及其相應(yīng)癌旁肝組織、20例正常肝組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞漿中呈彌散或散在分布，細(xì)胞核染色為陰性。正常肝組織高表達(dá)率>癌旁組織>肝癌組織，提示在肝癌的發(fā)生過(guò)程中同時(shí)伴隨著CHAF1A表達(dá)量的下降。有研究證實(shí)，CHAF1A在人類(lèi)結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核，并指出CHAF1A在人類(lèi)結(jié)腸癌組織普遍為過(guò)表達(dá)[4]，這與本實(shí)驗(yàn)中肝癌組織的表達(dá)不同。

筆者檢測(cè)到CHAF1A在肝癌高、中、低分化的細(xì)胞中表達(dá)逐漸減少甚至不表達(dá)。伴有門(mén)靜脈癌栓患者的組織CHAF1A的高表達(dá)率低于無(wú)癌栓者，從另外一個(gè)方面提示CHAF1A在一定程度上具有影響肝癌分化和侵襲能力的作用。Staibano等[10]應(yīng)用免疫組化檢測(cè)CAF-1的兩大亞基p60，p150在舌鱗癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示CAF-1/p150下調(diào)提示不良預(yù)后，可以作為判斷預(yù)后指標(biāo)之一，這和肝癌中的結(jié)果較吻合。CHAF1A可能是抑癌基因或者通過(guò)間接作用抑制肝癌和其他一些腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示CHAF1A表達(dá)下調(diào)與肝癌患者的性別、年齡、血清HBsAg的狀況、肝硬化、血清AFP值、腫瘤大小及臨床分期臨床特征之間無(wú)明顯相關(guān)性。目前已經(jīng)很明確肝癌的發(fā)生與HBV感染及肝硬化密切相關(guān)，而HBV致癌機(jī)理與HBV基因組引起宿主細(xì)胞基因受傷有關(guān)。結(jié)果顯示CHAF1A表達(dá)與HBsAg陽(yáng)性與否及有無(wú)伴肝硬化無(wú)相關(guān)性，此結(jié)果可能需要更深入的研究來(lái)證實(shí)。而血清AFP在臨床上是用來(lái)診斷和評(píng)價(jià)肝癌預(yù)后的重要標(biāo)志物。AFP在正常人體內(nèi)表達(dá)很低，而肝癌細(xì)胞自身可產(chǎn)生AFP[13]，癌變時(shí)有可能升高。但是其濃度與腫瘤的大小有關(guān)，而且并非所有肝癌細(xì)胞都分泌這種蛋白，尤其在早期和小細(xì)胞肝癌時(shí)，AFP的升高并不明顯，容易造成漏診[14]。CHAF1A有潛力成為不依賴(lài)于AFP的肝癌標(biāo)記物。這些結(jié)果顯示CHAF1A表達(dá)可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。

參考文獻(xiàn)：

[1]Luger K,Mader A W,Richmond R K,et al.Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Aresolution[J].Nature,1997,389:251-260.

[2]Monson E K,de Bruin D,Zakian V A.The yeast Cac1 protein is required for the stable inheritance of transcriptionally repressed chromatin at telomeres[P].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(24):13081-13086.

[3]Kadyrova L Y,Blanko E R,Kadyrov F A.CAF-I-dependent control of degradation of the discontinuous strands during mismatch repair[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108：2753-2758.

[4]Wu Z H,Cui F F,Yu F D,et al.Up-regulation of CHAF1A,a poor prognostic factor,facilitates cell proliferation of colon cancer[J].Biochem and Biophy Res Com,2014，449：208-215.

[5]Glinsky G V,Glinskii A B,Stephenson A J,et al.Gene expression profiling predicts clinical outcome of prostate cancer[J].J Clin Invest，2004，113：913-923.

[6]E Barbieri K,De Preter M.Capasso Z,et al.Histone chaperone CHAF1A inhibits differentiation and promotes aggressive neuroblastoma[J].Cancer Res，2014，74：765-774.

[7]De Preter K.Capasso M,et al.A p53 drug response signature identifies prognostic genes in high-risk neuroblastoma[J].PLoS One,2013，8：e79843.

[8]L.Bethke E.Webb A.Murray M.et al,Comprehensive analysis of the role of DNA repair gene polymorphisms on risk of glioma[J],Hum.Mol.Genet.，2008，17：800-805.[9]Lo Muzio L,Nocini P,Mignogna M D et al.Immunocytochemical,detection of hMSH2 and hMLH1 expression in oral SCC[J].Anticancer Res，1999，19：933-940.

[10]Staibano S,Mignogna C,Lo M,et al.Chromatin assembly factor-1 (CAF-1)-mediated regulation of cell proliferation and DNA repair:a link with the biological behaviour of squamous cell carcinoma of the tongue[J].Histopathology，2007,50,911-919.[11]Peng H,Du B,Jiang H,et al.Over-expression of CHAF1A promotes cell proliferation and apoptosis resistance in glioblastoma cells via AKT/FOXO3a/Bim pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，22，469(4):1111-1116.

[12]Wee A,Nilsson B.Combined hepatocellular-cholangiocarcinoma.diagnostic challenge in hepatic fine needle aspiration biopsy[J].Acta Cytol,1999,43(2):131-138.

[13]徐向勇，劉為邦，中建維，等.CAl9-9、AFP水平對(duì)慢性乙型肝炎的關(guān)系研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10(12)：1578-1579.

[14]張淑琴，李洪娥，王燕，等.超聲 CT、MRI 和血清AFP對(duì)原發(fā)性肝癌診斷的對(duì)比研究[J].放射免疫學(xué)雜志，2008，21(2):112.

(責(zé)任編輯：劉大仁)

The Expression and Clinical Value of CHAF1A in Hepatocellular Carcinoma

FU Hui-ying1,HUANG Can2a,Yan Ye-hong2b,PENG Xiao-dong2a,ZHANG Zhi-qian3

(1.DepartmentofOncology，the94thHospitaloftheChinesePeople’sLiberationArmy,Nanchang330001,China； 2a.DepartmentofOncology；2b.DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China； 3.DepartmentofLiverSurgery,theThirdNanchangHospital,Nanchang330009,China)

ABSTRACT：ObjectiveResearch the expression of largest subunit p150 of Chromatin assembly factor 1 (CAF-1) (CHAF1A) in hepatocellular carcinoma (HCC),and analyze the ralativity between its expression and clinical pathological characteristics of HCC patients.such as age,gender,pathological differentiation,portal venous tumor emboli,tumor size,clinical stage,HBsAg situation,cirrhosis of the liver and serum AFP.MethodsScreening 80 patients,all of them from June 2010 to October 2014 have accepted surgical resection in the first affiliated hospital of Nanchang university general surgery,and are confirmed by pathological diagnosis to be HCC.Tumor tissues and normal liver tissues 2 cm far near the cancer and normal liver tissues of 20 patients due to trauma or intrahepatic biliary calculi surgical resection of tissues are collected.Expression of CHAF1A in liver cancer are detected by immunohistochemistry.The differences of CHAF1A expression in the three groups and the relationship between expression of CHAF1A with clinical pathological characteristics of patients.ResultsThe high expression rate of CHAF1A in paraneoplastic and normal liver tissue was significantly higher than that in liver cancer tissue(P<0.05).CHAF1A expression in poorly differentiation liver cancer tissue or liver cancer tissue associated with portal venous tumor emboli is lower than high differentiation liver cancer tissue(P=0.027) or no portal venous tumor emboli (P<0.05).The expression of CHAF1A in liver cancer tissue is not related with gender,age,clinical stage,tumor size,HBsAg,cirrhosis of the liver and serum AFP Of patients(P>0.05).ConclusionCHAF1A expression maybe affect differentiation and invasiveness of liver cancer .The expression of CHAF1A in liver cancer tissue is not related with gender,age,clinical stage,tumor size,HBsAg,cirrhosis of the liver and serum AFP Of patients.

KEY WORDS：CHAF1A; hepatocellular carcinoma; Immunohistochemistry;portal vein tumor thrombosis; poorly differentiated

收稿日期：2015-10-20

作者簡(jiǎn)介：付慧英 (1979—)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)惡性腫瘤的綜合診治研究。

通信作者：彭小東，主任醫(yī)師，E-mial:pxddhbb@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1009-8194(2016)01-0005-05

DOI:10.13764/j.cnki.lcsy.2016.01.002