古正賢

(四川省內(nèi)江市威遠(yuǎn)縣高石鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，四川內(nèi)江 642450)

基于間接ELISA檢測(cè)方法新生仔豬流行性腹瀉病探析

古正賢

(四川省內(nèi)江市威遠(yuǎn)縣高石鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，四川內(nèi)江 642450)

本文為探析新生豬仔的流行性腹瀉病毒，構(gòu)建豬流行性腹瀉病毒蛋白間接的ELISA檢測(cè)方法，從新分離PEDV流行毒株中擴(kuò)增其N基因，并將N基因克隆至DNA原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)過誘導(dǎo)的重組蛋白呈可溶性表達(dá)。將純化的N蛋白作為包被抗原建立ELISA檢測(cè)方法，并且對(duì)各種檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化優(yōu)化后確定N蛋白最佳包被條件為37度，該間接ELISA方法為PEDV診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有益參考。

新生仔豬；流行性腹瀉；病理；DNA原核

1 前言

在國內(nèi)，盡管導(dǎo)致新生仔豬腹瀉的病因很多，但2011年至今以來，學(xué)者從表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、迅速脫水、高死亡率為特征的新生仔豬樣品中分離到了PEDV。因此，我們可以認(rèn)為：PEDV是近年來引起新生仔豬腹瀉最重要病原。PEDV的N蛋白具有良好的抗原反應(yīng)性，是制備診斷試劑的主要蛋白。PEDV抗體檢測(cè)有血清中和試驗(yàn)、免疫電鏡觀察（IEM）、間接血凝試驗(yàn)（IHA）、免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫熒光、原位雜交法、RTPCR、ELISA等。目前市面上尚無商品化的PEDV ELISA檢測(cè)試劑盒，因此建立PEDV抗體ELISA檢測(cè)方法具有一定現(xiàn)實(shí)意義。

2 實(shí)驗(yàn)方法

提取病毒基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用引物N．F、N．R擴(kuò)增全長N基因，PCR體系方法參照第二章。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收膠產(chǎn)物后，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的產(chǎn)物與用XhoI酶切后載體pCold-I DNA 各100 ng，用5xIn-FusionHD Enzyme Premix 50℃連接15 min后轉(zhuǎn)化DE3感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：（1）將連接產(chǎn)物全部加入在冰上剛剛?cè)芙獾母惺軕B(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min；（2） 再放入4℃水浴鍋中，熱激45 S，再冰浴3 min；（3）在無菌操作臺(tái)中，將冰浴后的產(chǎn)物加入裝有1 ml無抗的LB培養(yǎng)基的管中。置于搖床中，200rpm/min37℃震蕩1 h；（4）取出EP管，于離心機(jī)中4000 rpm離心2 min，棄液保留100L液體；（5） 用槍吹打均勻，于無菌操作臺(tái)中均勻涂布于含氨芐抗性的LB瓊脂平板上。37℃培養(yǎng)14～16 h挑取菌落置于含有氨芐的2YT培養(yǎng)基中，搖菌，PCR鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒否正確，提取PCR鑒定正確的質(zhì)粒，具體步驟：選取N基因克隆陽性菌液，按OMEGA公司質(zhì)粒抽提試劑盒的說明抽提質(zhì)粒。

3 間接Elisa方法的建立及實(shí)驗(yàn)結(jié)果探析

3.1 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定

將N蛋白稀釋成不同濃的度進(jìn)行包被，PEDV陽性血清和陰性血清分別從50倍到400倍稀釋，方陣滴定結(jié)果顯示，抗原的最佳包被量為 200 mg/L，血清的稀釋度為1：200，此時(shí)的陽性血清與陰性血清的OD450 11121值相差最大（P/N=9.736）。

3.2 最佳包被液、最佳封閉液及封閉時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

用不同包被液以包被酶標(biāo)板，用不同的封閉液對(duì)包被的酶標(biāo)板按不同時(shí)間進(jìn)行封閉，試驗(yàn)結(jié)果表明，用O．05 M碳酸鹽包被液包被抗原，5%脫脂乳37度封閉2 h時(shí)，P/N值最大。此時(shí)為最佳條件。

3.3 血清與酶標(biāo)二抗的最佳作用時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

按上述確定條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將血清按20 min、30 min、45 min、60 min四個(gè)時(shí)間段作用，洗三次后，將稀釋好的酶標(biāo)二抗按20 min、30 min、45 min、60 min四個(gè)時(shí)間段作用，根據(jù)OD450測(cè)定結(jié)果，計(jì)算P/N值，確定最佳血清孵育時(shí)間為20 min，最佳二抗孵育時(shí)間為60 min。

3.4 顯色溫度與時(shí)間的優(yōu)化

按上述條件實(shí)驗(yàn)，最后顯色時(shí)，分別用室溫和37℃，顯色時(shí)間為5 min，10 min，15 min，進(jìn)行ELISA測(cè)定，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，37℃顯色15 min，為最佳底物顯色溫度時(shí)間，此時(shí)P/N值可達(dá)21.760。

4 結(jié)果與討論

PEDVN蛋白是一種磷酸化的核衣殼蛋白，它與基因組RNA緊密結(jié)合，是PEDV中所占比例最大的一種結(jié)構(gòu)蛋白，且其高度保守，具有良好的抗原反應(yīng)性和特異性。能誘導(dǎo)機(jī)體快速產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，可作為PEDV早期感染的診斷依據(jù)。在文中我們成功分離到了一株P(guān)EDV流行毒株SH6，由于目前國內(nèi)外對(duì)PEDV研究尚不深入，對(duì)該病的準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)仍存在技術(shù)難關(guān)，因此，建立實(shí)用的PEDV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法迫在眉睫。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種常用的經(jīng)典血清學(xué)檢測(cè)方法，它操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，特異性強(qiáng)。目前市面上有一些以全病毒抗原為基礎(chǔ)的商品化PEDV檢測(cè)試劑盒，但該病毒不易分離培養(yǎng)，因此難以制備大量抗原。此外，這些ELISA試劑盒還可能存在排散病毒的隱患。本研究擴(kuò)增其N基因，以pCold．I DNA作為原核表達(dá)載體，構(gòu)建pCold-I-N重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），目的蛋白在上清液中高效表達(dá)。采用NioNTA柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，得到濃度為1.5 mg／mL的目的蛋白。Westernblot分析表明該蛋白具有良好的抗原反應(yīng)性。利用純化的重組蛋白，初步建立問接ELISA檢測(cè)方法，優(yōu)化各項(xiàng)反應(yīng)條件。問接ELISA優(yōu)化后條件為：最佳包被液O.05 M碳酸鹽緩沖液（pH 9.6），最佳抗原包被量為200 ng/孔，最佳包被條件為374C包被2 h，最佳封閉條件為5%脫脂乳37度封閉2 h，最佳血清稀釋度為1：200，血清最佳孵育時(shí)間為37度孵育20 min，二抗最適稀釋度為1：2x104，二抗最佳孵育時(shí)間為40 min，臨界值為＞0.394時(shí)判定為陽性，OD450 rim_＜0.345時(shí)判定為陰性，0.345～0.394為可疑。并對(duì)50份已知背景血清進(jìn)行檢測(cè)，符合率達(dá)94%。

[1] 呂茂杰，陳建飛，時(shí)洪艷，等.豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白與感染細(xì)胞核磷蛋白的共定位分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2011，51 （5）：643-647.