王偉杰

(洛陽市吉利區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南洛陽 471012)

基因芯片技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用

王偉杰

(洛陽市吉利區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南洛陽 471012)

基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一門高新技術(shù),具有高通量、靈敏度高,特異性好等特點(diǎn)。它是通過微陣列技術(shù),將高密度DNA片段陣列,通過點(diǎn)樣或原位合成法的形式,以一定的順序或者排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面,借助堿基互補(bǔ)雜交原理,進(jìn)行大量病原基因表達(dá)系譜分析、檢測(cè)、基因分型等。本文簡要介紹了基因芯片技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用及其發(fā)展前景。

基因芯片;動(dòng)物疫病;診斷

1 基因芯片技術(shù)概述

基因芯片，又稱DNA 芯片，屬于生物芯片中的一種，是綜合微電子學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)及生物學(xué)等高新技術(shù)，把大量DNA 探針或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龍膜等載體上，形成的致密、有序的DNA 分子點(diǎn)陣，因固相載體常用硅玻片或硅芯片，故稱之為基因芯片?；蛐酒夹g(shù)的基本原理是分子生物學(xué)中的核酸分子原位雜交技術(shù)：將短鏈核酸分子固定在固相載體上作為探針，待分析樣品經(jīng)過標(biāo)記后與固定在芯片上的探針雜交?；蛐酒夹g(shù)的分類方法很多，最常用的是按載體上所點(diǎn)探針的長度分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片。根據(jù)芯片的功能可以分為基因表達(dá)譜芯片和DNA測(cè)序芯片；根據(jù)載體也可分為液相芯片、固相芯片。無論哪種芯片，其技術(shù)流程主要包括芯片的制備、待測(cè)樣本的制備和標(biāo)記、雜交反應(yīng)、結(jié)果檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理分析等。與傳統(tǒng)的核酸印跡雜交技術(shù)相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作簡單、重復(fù)性強(qiáng)以及可以反復(fù)利用等諸多優(yōu)點(diǎn)。

2 基因芯片技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用

2.1 基因芯片技術(shù)在豬疫病診斷中的應(yīng)用

豬傳染病中，多種病原體混合感染極其常見，檢測(cè)其病原微生物就顯得尤為重要。張煥容等制備偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒和流行性乙型腦炎病毒檢測(cè)基因芯片。選定靶基因最佳點(diǎn)樣質(zhì)量濃度為200 mg/L，用基因芯片點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)制在氨基化基片上。結(jié)果表明，探針最佳使用質(zhì)量濃度為3 000 μg/L，芯片系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度可3μg/L。姜永厚等建立一種可同時(shí)檢測(cè)區(qū)分豬瘟病毒，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型的核苷酸基因芯片方法，針對(duì)每種病毒設(shè)計(jì)了4-6條寡核苷酸探針。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法對(duì)76個(gè)仔豬樣本進(jìn)行了檢測(cè)，其中25個(gè)樣本（32.9%）同時(shí)感染了2種以上病毒。符芳等用豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型的特異cDNA片段作為探針制備的cDNA微陣列芯片，可以用微量病豬全血一次同時(shí)快速、準(zhǔn)確地對(duì)上述5種病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)，展示了基因芯片技術(shù)在動(dòng)物疾病診斷與防制上有著極高的應(yīng)用價(jià)值。楊若松等建立豬瘟病毒、高致病性豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒2型及豬細(xì)小病毒的基因芯片檢測(cè)方法，該方法對(duì)臨床150份樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，CSFV陽性樣品有25份．高致病性PRRSV陽性樣品有45份，PCV-2陽性樣品有70份，PPV的檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，其中混合感染樣品有18份。結(jié)果表明該法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。肖國生等利用胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌的7個(gè)從3種病菌基因組中擴(kuò)增出不同特異性靶DNA制作基因芯片．并對(duì)芯片的靶DNA和探針濃度、雜交溫度、重復(fù)性、特異性和靈敏度進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果證明，其所研制的基因芯片特異性強(qiáng)、靈敏度高能檢測(cè)到10～50 pg基組DNA，且芯片可重復(fù)利用，是一種能有效用于胸膜肺炎放線桿菌、豬多殺性巴氏桿菌和豬肺炎支原體鑒定和聯(lián)合檢測(cè)的新工具。

2.2 基因芯片技術(shù)在禽病診斷中的應(yīng)用

基因芯片技術(shù)也應(yīng)用于禽的一些常見傳染病的診斷上。田麗娜等將克隆和鑒定的AIV的HA、NA、M、NS、NP基因以及NDV、IBDV 、IBV的保守基因片段作為探針，同時(shí)以克隆的GAPDH基因作為陽性對(duì)照，利用芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)SpotArray-TM24將探針與陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照按照設(shè)計(jì)好的陣列點(diǎn)在基片上，制備了AIV等RNA病毒芯片，該方法對(duì)20份已鑒定的H5N1亞型禽流感病毒的檢出率為100%（20/20）；10份送檢的疑似AIV樣品的檢出率為70%（7/10），檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR和雞胚傳代分離鑒定的符合率為100%。結(jié)果表明，制備的DNA芯片可有效診斷禽流感等病毒。韓雪清等根據(jù)Genbank上已發(fā)表的禽流感病毒不同亞型的基因序列，設(shè)計(jì)合成了25 對(duì)特異性引物和1對(duì)通用引物，然后以各亞型病毒的參考株RNA作為模板，建立擴(kuò)增不同亞型的多重RTPCR方法。參考各亞型病毒靶cDNAs區(qū)域的保守序列設(shè)計(jì)了52條亞型特異 的探針。在此基礎(chǔ) 上，將設(shè)計(jì)好的探針點(diǎn)制到處理好的玻片上，制備了禽流感病毒分型鑒定基因芯片，結(jié)合所建立的擴(kuò)增不同亞型的多重RT-PCR方法，開發(fā)了禽流感病毒亞型鑒定基因芯片試劑。利用收集自49個(gè)地區(qū)的2653份標(biāo)本對(duì)其特異性和敏感性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。證明該病毒分型基因芯片具有良好的特異性、敏感性。

3 結(jié)論及展望

隨著芯片技術(shù)研究的不斷深入，它在醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，受到人們的普遍重視，已呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)前景。目前，人醫(yī)已有10余個(gè)應(yīng)用芯片技術(shù)開發(fā)的檢測(cè)試劑盒被政府批準(zhǔn)使用。隨著基因芯片技術(shù)不斷發(fā)展完善，它將會(huì)成為一種更快速、準(zhǔn)確和簡便的動(dòng)物傳染病診斷方法。在不久的將來，基因芯片技術(shù)將為動(dòng)物傳染病的診斷提供一個(gè)重要的研究和應(yīng)用平臺(tái)。

[1] 葉芬，蔡家利.基因芯片技術(shù)在豬病毒性疾病診斷中的應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，（7）：87-89．

[2] 張煥容，曹三杰，文心田，等.偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒和流行性乙型腦炎病毒檢測(cè)基因芯片的制備[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，27（5）：667-670.