朱衛(wèi)衛(wèi)，邱德全，甘　楨，魯義善，簡紀(jì)常(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 //廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 //廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東　湛江　524025)

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溶藻弧菌肽聚糖和vp28-siRNA對凡納濱對蝦白斑綜合征病毒的抑制作用

朱衛(wèi)衛(wèi)，邱德全，甘楨，魯義善，簡紀(jì)常
(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 //廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 //廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江524025)

摘要：對感染白斑綜合征病毒（WSSV）的凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）分別注射0.05和0.10 μg/μL 的vp28-siRNA，干擾效果實(shí)驗(yàn)表明，siRNA最佳濃度為0.10 μg/μL。凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV 24 h時注射0.10 μg/μL 的vp28-siRNA，檢測免疫后不同時間點(diǎn)的干擾效果。結(jié)果表明：在注射vp28-siRNA 6 h后，實(shí)驗(yàn)組與對照組WSSV病毒拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05)；在48 h時實(shí)驗(yàn)組病毒拷貝數(shù)急劇下降，對照組則保持較高水平，可較好干擾WSSV病毒復(fù)制，干擾效果持續(xù)120 h，對凡納濱對蝦的保護(hù)率為40%。凡納濱對蝦用0.10 mg/mL肽聚糖（Peptidoglycan）免疫24 h后感染W(wǎng)SSV，檢測6、12、24 h注射vp28-siRNA的保護(hù)率。結(jié)果顯示：6 h注射組的保護(hù)率為80%，12 h注射組為63.33%，24 h注射組為56.67%。凡納濱對蝦在肽聚糖和vp28-siRNA作用后，可增加其對WSSV抗感染作用，降低死亡率，干擾時間越早，對對蝦的保護(hù)率越高。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦；免疫增強(qiáng)劑；RNA干擾；肽聚糖；vp28-siRNA；白斑綜合征病毒

Key word:Litopenaeus vannamei; immunopotentiating agent; RNA interference; peptidoglycan; vp28-siRNA; White Spot Syndrome Virus

對蝦有成熟的非特異性免疫系統(tǒng)。肽聚糖（Peptidoglycan，PG）[1]、脂多糖（Lipopoly saccharide,LPS）[2]、葡聚糖（Glucan）及藻類多糖[3]等具有促進(jìn)或誘發(fā)宿主防御反應(yīng)，增強(qiáng)生物機(jī)體抗病能力的作用，稱為對蝦免疫增強(qiáng)劑，這些免疫增強(qiáng)劑研究為對蝦養(yǎng)殖中病害防治新型藥物開發(fā)開辟了新思路[4-5]。肽聚糖取自微生物細(xì)胞壁，因此細(xì)菌進(jìn)入機(jī)體時被識別出來，激發(fā)起體內(nèi)的免疫功能，是免疫增強(qiáng)劑的重要成員，可提高機(jī)體多種免疫因子活力，增強(qiáng)抗病力[6]。

白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）是引發(fā)亞洲地區(qū)對蝦病毒性流行病主要病原[7]，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[8-9]。目前，學(xué)界多采用添加中草藥及制劑[10-13]、使用免疫增強(qiáng)劑[14-16]、注射抗體[17-18]或疫苗[19]等方法增強(qiáng)對蝦免疫力，以防治WSSV。此外，細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶可將外源dsDNA剪成siRNA，與核酸酶合成沉默復(fù)合體及解旋雙鏈siRNA，以siRNA為向?qū)нx擇底物降解為與其同源的mRNA序列，這種現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNAi）。對蝦體內(nèi)不存在干擾素相關(guān)基因，不會誘發(fā)先天性免疫反應(yīng)而降解dsRNA和siRNA，因此，可給對蝦注射siRNA進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)[20]。已有研究[21-22]表明，對蝦注射WSSV的相應(yīng)dsRNA[21]或siRNA[22]后，可減少體內(nèi)病毒的復(fù)制。上述研究均為單方面增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力或利用RNAi有效干擾WSSV復(fù)制以防治WSSV，筆者用肽聚糖注射免疫凡納濱對蝦（Litoprnaeus vannamei）后，用WSSV攻毒，再注射vp28-siRNA，研究肽聚糖和siRNA對對蝦的免疫保護(hù)率，為凡納濱對蝦抗WSSV研究提供新的方法和思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用蝦及病毒原液

凡納濱對蝦（L.vannamei），體長（9.5 ± 0.3）cm，體質(zhì)量（11.0 ± 0.6）g，取自湛江市東海島東南庵里湛江騰飛實(shí)業(yè)有限公司對蝦養(yǎng)殖場。經(jīng)PCR檢測，確認(rèn)未攜帶白斑綜合癥病毒。對蝦于1 m × 1 m × 0.8 m的水槽中暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖條件：鹽度24，水溫28～32℃，每日按對蝦體質(zhì)量10%的劑量投喂配合飼料3次，連續(xù)充氣，日換水量約1/3。

WSSV病毒粗提液由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（下稱本實(shí)驗(yàn)室）-80℃超低溫保存。

1.2肽聚糖提取和溶液配制

參照謝警鴻[23]和劉春曉[24]方法提取溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）（本實(shí)驗(yàn)室保存）細(xì)胞壁的肽聚糖，用分析天平稱量0.1 g的肽聚糖（純度98.5%），溶入10 mL的BSS緩沖液（NaCl 18.0 g/L，KCl 0.7 g/L，NaHCO30.5 g/L，KH2PO40.54 g/L，調(diào)pH至7.2），用超聲波溶解配制成0.1 mg/mL的肽聚糖溶液。

1.3siRNA選擇與合成和熒光定量引物設(shè)計(jì)

siRNA來自WSSV主要囊膜蛋白vp28基因，李詠梅[25]等已在倉鼠腎（Baby hamster kidney，BHK）細(xì)胞中驗(yàn)證3條siRNA的有效性。選用其中一條siRNA和陰性對照siRNA（Negative control siRNA，nc-siRNA）。登陸NBCI搜索得WSSV vp28基因（GenBank登錄號DQ681069）的全mRNA序列，引物W120和vp28用Premier 5軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1　siRNA和熒光定量引物Table 1　siRNA and quantitative real-time PCR primers

vp28-siRNA和nc-siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。合成的vp28-siRNA用BSS緩沖液（DEPC水處理）配制成0.10和0.05 μg/μL溶液，nc-siRNA配制成0.05 μg/μL溶液。

1.4熒光定量PCR及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用程曉燕等[26]的方法制備vp28重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸分析儀測定重組質(zhì)粒的DNA 濃度，計(jì)算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，公式如下。

重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)=質(zhì)粒質(zhì)量濃度(μg/μL)× 10?6× 6.02 ×1023/重組質(zhì)粒相對分子質(zhì)量。

熒光定量PCR的反應(yīng)體系：SYBR PremixEx Taq TM(2×)12.5 μL，模板1 μL，0.2 μmol/L引物2.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR結(jié)束后，利用Rotor-Gene軟件查看擴(kuò)增曲線，計(jì)算Ct(Cyclethreshold)值，以及計(jì)算重組質(zhì)粒不同稀釋度（拷貝數(shù)）與Ct值的相關(guān)性，從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5siRNA最佳濃度的確定

實(shí)驗(yàn)分4組，記為DZ、SR1、SR2、CZ組，每組對蝦5尾，每尾分別肌肉注射100 μL稀釋104倍的病毒粗提液。24 h時，SR2組注射100 μL的0.05 μg/μL vp28-siRNA，SR1組注射100 μL的0.10 μg/μL vp28-siRNA，DZ組僅注射100 μL的BSS緩沖液（陰性對照組），CZ組注射100 μL的nc-siRNA（陽性對照）。48 h時，分別取對蝦的鰓組織提取DNA用于半定量PCR檢測WSSV。反應(yīng)體系（25 μL）含10×ExTaq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，病毒粗提液1.0 μL，Ex Taq(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O 17.3 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 45 s，30循環(huán)；72℃ 1 min，72℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后每組（5平行組）PCR產(chǎn)物合成一管，取其中的10 μL作10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳。

1.6siRNA對凡納濱對蝦WSSV抗感染效果

設(shè)3個實(shí)驗(yàn)組，記為WS、SR、BS組，每組設(shè)置3個平行組，每個平行組對蝦10尾。WS和SR實(shí)驗(yàn)組每尾各注射稀釋104倍的病毒粗提液100 μL，BS組注射BSS緩沖液100 μL。24 h時，SR組注射100 μL vp28-siRNA（濃度為1.5節(jié)結(jié)果）。觀察7 d，記錄每天對蝦死亡數(shù)，計(jì)算免疫保護(hù)率。

設(shè)實(shí)驗(yàn)組、對照組，每組設(shè)置3個平行組。每平行組對蝦30尾，每尾各注射100 μL稀釋104倍的病毒粗提液。24 h時，實(shí)驗(yàn)組每尾注射100 μL vp28-siRNA（濃度為1.5節(jié)的最佳濃度）。在注射后0、6、12、24、48、72、96、120 h時采集各組對蝦鰓組織，每組每個時間點(diǎn)各取3尾，用熒光定量PCR檢測WSSV變化情況。

1.7肽聚糖和vp28-siRNA 對凡納濱對蝦抗WSSV的影響

根據(jù)劉春曉[24]的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)用肽聚糖質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，所用病毒為稀釋104倍的WSSV粗提液[14]，vp28-siRNA濃度為1.5節(jié)的濃度結(jié)果。設(shè)5個實(shí)驗(yàn)組，分別記為PS、WS、PS6、PS12、PS24組，每組設(shè)置3個平行組，每平行組對蝦30尾。各組處理如表2所示。

實(shí)驗(yàn)連續(xù)充氣，日換水量約為1/3，定時吸出排泄物，及時取出死亡對蝦。記錄各組感染后 7 d的凡納濱對蝦死亡數(shù)。

1.8數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較，用Excel作圖。

表2　實(shí)驗(yàn)分組Table 2　The experiment designs the different groups

2　結(jié) 果

2.1絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用核酸分析儀測定vp28重組質(zhì)粒的DNA 濃度為27.7 ng/μL，根據(jù)計(jì)算公式得到質(zhì)粒中的目的基因拷貝數(shù)為3.93×109copies/μL，將其進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋得到3.93×108、3.93×107、3.93×106、3.93×105、3.93×104、3.93×103和3.93×102copies/μL，進(jìn)行熒光定量測定。結(jié)果見圖1，其中R2=0.999 9，說明該方程線性相關(guān)性較佳，可用于計(jì)算病毒拷貝數(shù)。

2.2siRNA最佳濃度確定

圖2可見，SR1條帶亮度低于其他實(shí)驗(yàn)組，表明注射100 μL 0.10 μg/μL vp28-siRNA實(shí)驗(yàn)組病毒數(shù)量最少。用熒光定量PCR檢測攻毒48 h時各組病毒的拷貝數(shù)見圖3。圖3表明，SR1組病毒拷貝數(shù)最少，與其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。表明注射0.10 μg/μL的vp28-siRNA干擾WSSV效果較好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1　WSSV基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of WSSV gene fluorogenic quantitative real-time PCR

圖2　WSSV半定量PCR鑒定結(jié)果Fig.2　Semi-quantitative PCR identification of WSSV

圖3　攻毒48 h時凡納濱對蝦攜帶WSSV拷貝數(shù)Fig.3　Copy number of WSSV in Litopenaeus vannamei at 48 h after challenged with WSSV

2.3vp28-siRNA對凡納濱對蝦的抗WSSV存活率影響及WSSV攜帶情況

用質(zhì)量濃度為0.10 μg/μL vp28-siRNA免疫感染W(wǎng)SSV 24 h的凡納濱對蝦，各組對蝦存活率如表3所示。表3可見，對照組WS組7 d內(nèi)死亡率達(dá)到100%；經(jīng)vp28-siRNA免疫的SR組對蝦死亡率為60%，保護(hù)率為40%。

表3　vp28-siRNA對凡納濱對蝦的抗WSSV存活率的影響Table 3　Effects of vp28-siRNA on Litopenaeus vannamei infected WSSV

注射vp28-siRNA后各時間點(diǎn)病毒的DNA熒光定量PCR檢測結(jié)果如圖4所示。圖4表明，在0 至24 h之間，病毒不斷繁殖，其拷貝數(shù)快速倍增，但實(shí)驗(yàn)組低于對照組（P ＜ 0.05）；24 h后實(shí)驗(yàn)組病毒拷貝數(shù)急劇下降，48 h時， 實(shí)驗(yàn)組病毒拷貝數(shù)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01），一直持續(xù)到120 h，而對照組則保持高水平的病毒拷貝數(shù)。

圖4　vp28-siRNA對凡納濱對蝦攜帶WSSV拷貝數(shù)的影響Fig.4　Effects of vp28-siRNA on the WSSV copy number in Litopenaeus vannamei

2.4肽聚糖和vp28-siRNA對凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV存活率的影響

先用0.10 mg/mL肽聚糖對凡納濱對蝦免疫24 h，感染W(wǎng)SSV之后不同時間點(diǎn)注射vp28-siRNA，各組對蝦存活率如表4。對照組和陰性對照組對蝦的死亡率都為100%，PS6組的保護(hù)率為80%，PS12組的保護(hù)率為63.33%，PS24的保護(hù)率為56.67%。結(jié)果顯示，注射vp28-siRNA時間點(diǎn)越后，凡納濱對蝦的保護(hù)率越低，仍有56.67%的保護(hù)率。

表4　肽聚糖和 vp28-siRNA對凡納濱對蝦的抗WSSV存活率的影響Table 4　Effects of peptidoglycan and vp28-siRNA on Litopenaeus vannamei against WSSV

3　討 論

vp28是WSSV的一個高豐度的囊膜蛋白，在病毒初始感染對蝦中起關(guān)鍵作用[27]，抑制vp28的轉(zhuǎn)錄與翻譯，對對蝦WSSV的抗感染效果較好。李詠梅等[25]發(fā)現(xiàn)，siRNA在BHK細(xì)胞中對vp28基因的干擾效率維持在50%～70%。Xu等[28]把siRNA注射到體內(nèi)后可成功抑制VP28在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)，抑制病毒的復(fù)制，提高對蝦對病毒的抵抗力。Zhu等[29]證明，把siRNA注射凡納濱對蝦體內(nèi)也有同樣效果，其免疫保護(hù)率約為40%。本研究表明，凡納濱對蝦注射vp28-siRNA后，其保護(hù)率為40%，與文獻(xiàn)[29]結(jié)果一致，間接說明干擾WSSV病毒vp28可有效控制WSSV的感染。

本研究以WSSV囊膜蛋白vp28為模板設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)用siRNA，確定vp28-siRNA質(zhì)量濃度為0.10 μg/μL時干擾WSSV效果最佳。有研究證明，在凡納對蝦體內(nèi)注射10 μg siRNA的干擾病毒效果最佳[30]，與本研究相符。在對蝦注射vp28-siRNA 48 h時（圖4），實(shí)驗(yàn)組對蝦體內(nèi)病毒拷貝數(shù)與對照組相比急劇降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01），說明干擾效果明顯，效果可持續(xù)到120 h，這是RNAi信號擴(kuò)增機(jī)制的作用結(jié)果，即在機(jī)體內(nèi)以siRNA為引物，靶mRNA為模板，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRP）作用下通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成新的長的dsRNA，新生dsRNA再進(jìn)入下一個RNAi循環(huán)。有研究證明導(dǎo)入的雙鏈RNA可誘導(dǎo)RNA干擾，其抑制效應(yīng)可穩(wěn)定存在5 d以上[31]，與本實(shí)驗(yàn)干擾效果維持時間相符。在通過肽聚糖免疫后，再用siRNA注射到對蝦體內(nèi)，獲得免疫保護(hù)率最高可達(dá)80%（表4），高于單注射肽聚糖（46.67%）和單注射siRNA（40%）的免疫保護(hù)率。說明一方面通過siRNA來干擾WSSV復(fù)制，導(dǎo)致WSSV不能大量繁殖；另一方面由于機(jī)體前期受肽聚糖免疫刺激后，免疫功能增強(qiáng)，把WSSV病毒顆粒快速消除，從而減少對蝦在感染W(wǎng)SSV后死亡。但肽聚糖提取和siRNA制備費(fèi)用昂貴，無法大量應(yīng)用于對蝦養(yǎng)殖，可為對蝦抗病毒研究提供新的思路。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Effects of Vibrio alginolyticus Peptidoglycn and vp28-siRNA on Litopenaeus vannamei Against White Spot Syndrome Virus

ZHU Wei-wei,QIU De-quan,GAN Zhen,LU Yi-shan,JIAN Ji-chang
（College of Fisheries,Guangdong Ocean University //Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals //Key Laboratory of Control for Disease of Aquatic Animals of Guangdong Higher Education Institutes,Zhanjiang 524025,China）

Abstract：Vp28-siRNA at the concentration of 0.05 and 0.10 μg/μL was injected into Litopenaeus vannamei suffered from White Spot Syndrome(WSS),respectively.The optimum concentration of vp28-siRNA was 0.10 μg/mL by interference effect experiment.L.vannamei was challenged with White Spot Syndrome Virus(WSSV),and was stimulated by vp28-siRNA at 24thday after infection.The effects of vp28-siRNA interference at different times were detected.The results showed that the experimental group had statistical differences from the control group(P ＜ 0.05)at the 6th hour,and WSSV copy number had a rapid decline at 48th hour and the good interference replication of WSSV lasted until the 120th hour.The protection rate was 40%.L.vannamei immuned by peptidoglycan(0.1 μg/mL)was infected with WSSV.Then vp28-siRNA was injected at the differentbook=58,ebook=61times(6 h,12 h and 24 h)into the shrimps and the protection rate was measured.The results revealed that the protection rate of group 6 h,12 h and 24 h was 80%,63.33% and 56.67%,respectively.It is more effective to interfere with WSSV so that it can reduce shrimp mortality,after L.vannamei immuned with peptidoglycan and vp28-siRNA,and the earlier interference,the higher rate of protection.

中圖分類號：S945.4+9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-9159（2016）01-0057-06

通信作者：邱德全，男，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物免疫與病害控制。E-mail：qmsld@163.com

基金項(xiàng)目：廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)項(xiàng)目(A201100D03)，廣東省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)項(xiàng)目(GD2012-A03-012)，湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013A03021)
第一作者：朱衛(wèi)衛(wèi)（1986－），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物免疫與病害控制。E-mail：zhuweiwei320@163.com

收稿日期：2013-06-30

doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.010