湯秦，王利民(四川醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000；四川綿陽(yáng)四○四醫(yī)院 川北醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

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人類呼出氣檢測(cè)在肺結(jié)核診斷及療效、預(yù)后判斷中的應(yīng)用進(jìn)展

湯秦1，王利民2(1四川醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000；2四川綿陽(yáng)四○四醫(yī)院 川北醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

摘要：肺結(jié)核是威脅人類健康的主要傳染病之一，快速、準(zhǔn)確的診斷對(duì)于肺結(jié)核的管理和控制尤為重要。正常人呼出氣中主要包括揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)和呼出氣冷凝液(EBC)，通過呼出氣檢測(cè)可檢出肺結(jié)核特異性VOCs，并作為診斷肺結(jié)核的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺結(jié)核的快速診斷，而EBC檢測(cè)在肺結(jié)核診斷中的研究較少。通過檢測(cè)EBC中H2O2和NO含量可在一定程度上反映肺結(jié)核的療效及判斷預(yù)后，而目前關(guān)于呼出氣VOCs檢測(cè)與肺結(jié)核療效、預(yù)后判斷的關(guān)系仍處于空白階段，需進(jìn)一步研究證實(shí)。呼出氣檢測(cè)具有快速、無創(chuàng)、靈敏度高等特點(diǎn)，其在肺結(jié)核的診斷及療效、預(yù)后判斷等方面具有較高的臨床價(jià)值。

關(guān)鍵詞：肺結(jié)核；呼出氣；揮發(fā)性有機(jī)化合物；呼出氣冷凝液

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌侵入人體后引起的一種慢性消耗性疾病，是致命的傳染病之一。2014年我國(guó)新發(fā)肺結(jié)核患者約93萬(wàn)，位列全球第三位?？焖佟?zhǔn)確的診斷技術(shù)對(duì)于結(jié)核病的管理和控制尤為重要，而目前應(yīng)用的涂片鏡檢和培養(yǎng)等傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法分別存在靈敏度低和檢測(cè)周期過長(zhǎng)等缺點(diǎn)[1]，可能導(dǎo)致結(jié)核病檢出率低甚至延誤病情等。呼出氣檢測(cè)具有快速、無創(chuàng)、靈敏度高等特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸應(yīng)用于臨床，有望成為診斷肺結(jié)核及評(píng)價(jià)病情的重要方法?，F(xiàn)對(duì)呼出氣檢測(cè)在肺結(jié)核診斷及療效、預(yù)后判斷中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1人類呼出氣成分

1.1揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)正常人呼出氣中的VOCs成分非常復(fù)雜，目前已檢測(cè)到的VOCs共3 000多種，每個(gè)人呼出氣中的VOCs為150～200種，主要成分為烴類、氧烴類、含鹵烴類、氮烴類及硫烴類[2]。人體細(xì)胞代謝脂質(zhì)氧化過程的最終產(chǎn)物是碳?xì)浠衔铮湓谘褐械娜芙舛葮O低，但可通過血液循環(huán)進(jìn)入呼吸系統(tǒng)，最終由呼吸系統(tǒng)排出體外[3]。因此，通過檢測(cè)人體呼出氣中特定的VOCs，可以對(duì)機(jī)體生理、病理狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。人體呼出氣中VOCs水平很低，通常在nmol/L～pmol/L的數(shù)量級(jí)之間，所以其成分檢測(cè)所需要的方法和技術(shù)要求均很高。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已發(fā)現(xiàn)檢測(cè)VOCs的多種方法，如氣相色譜、選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜、質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜等[3～6]。

1.2冷凝液呼出氣通過冷凝裝置可以收集到水和可溶于水的各種物質(zhì)，即呼出氣冷凝液(EBC)。EBC中許多成分來源于下呼吸道液體，而氣道內(nèi)襯液體是呼吸道的防御屏障，可以抵御吸入性氧化物、病原微生物以及過敏原等對(duì)呼吸道的侵襲。因此，檢測(cè)EBC的成分及其濃度變化可評(píng)價(jià)呼吸道疾病的治療效果。

2呼出氣檢測(cè)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

2.1VOCs檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌代謝產(chǎn)物及結(jié)核桿菌感染宿主氧化應(yīng)激能產(chǎn)生VOCs，可通過被動(dòng)擴(kuò)散從血液穿過肺泡進(jìn)入呼吸氣中。呼出氣檢測(cè)可檢出肺結(jié)核特異性VOCs，并作為診斷肺結(jié)核的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺結(jié)核的快速診斷。

Wilson等[7]使用14個(gè)導(dǎo)電聚合物傳感器電子鼻檢測(cè)了35份體外培養(yǎng)細(xì)菌的VOCs，結(jié)果顯示能夠100%從其他細(xì)菌中識(shí)別出結(jié)核桿菌，且能區(qū)分痰液標(biāo)本中是否含有結(jié)核分枝桿菌、鳥結(jié)核分枝桿菌、綠膿桿菌或混合感染。2007年，Phillips等[8]發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者呼出氣中VOCs與體外培養(yǎng)結(jié)核桿菌檢測(cè)到的VOCs有相似的成分；該研究采用12種VOCs診斷肺結(jié)核，其敏感性和特異性均為100%，并且可以通過特異性VOCs標(biāo)志物區(qū)分痰培養(yǎng)陽(yáng)性和陰性患者。2010年，Phillips等[9]又對(duì)226例有癥狀的高風(fēng)險(xiǎn)肺結(jié)核患者進(jìn)行呼出氣VOCs檢測(cè)，以4-甲基十二烷、2-己基環(huán)己烷、十三烷等10種VOCs作為活動(dòng)性肺結(jié)核標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)其診斷高風(fēng)險(xiǎn)活動(dòng)性肺結(jié)核的陽(yáng)性準(zhǔn)確率達(dá)85%，敏感性為84%、特異性為64.7%。2012年，Phillips等[10]以萘的衍生物、苯和烷烴作為肺結(jié)核和結(jié)核分枝桿菌代謝產(chǎn)物的VOCs標(biāo)記物，使用6分鐘床旁呼出氣檢測(cè)VOCs，發(fā)現(xiàn)該方法能準(zhǔn)確識(shí)別活動(dòng)性肺結(jié)核，其準(zhǔn)確率可達(dá)80%，敏感性為71.2%、特異性為72%。以上研究均證實(shí)，呼出氣VOCs檢測(cè)可快速、準(zhǔn)確地診斷肺結(jié)核。

通過對(duì)肺結(jié)核患者呼出氣VOCs成分的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)許多診斷肺結(jié)核的呼出氣VOCs標(biāo)志物[11～13]，其中具有較高診斷價(jià)值的有煙酸甲酯、對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯和鄰苯基苯甲醚等。Syhre等[14]通過固相微萃取和氣相色譜/質(zhì)譜法確認(rèn)了4個(gè)化合物(煙酸甲酯、甲氧基苯甲酸甲酯、甲基苯乙酸和鄰苯基苯甲醚)是結(jié)核分枝桿菌和體外培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，并發(fā)現(xiàn)痰菌陽(yáng)性的肺結(jié)核患者煙酸甲酯水平明顯高于不吸煙的健康對(duì)照人群。為了明確這些生物標(biāo)記物的來源，Syhre等[15]分別檢測(cè)了食品、化妝品、肺結(jié)核治療藥物等中的VOCs，認(rèn)為煙酸甲酯和鄰苯基苯甲醚更適合作為診斷結(jié)核桿菌感染的揮發(fā)性標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，煙酸在結(jié)核分枝桿菌代謝的氧化還原過程中起重要作用，對(duì)甲氧基苯甲酸的前體是水楊酸，而水楊酸已被證實(shí)是對(duì)結(jié)核分枝桿菌的鐵攝取有重要意義[16,17]。因此，煙酸甲酯和對(duì)甲氧基苯甲酸甲酯可能成為肺結(jié)核患者呼出氣VOCs的診斷標(biāo)記物。鄰苯基苯甲醚是結(jié)核分枝桿菌通過甲氧基-2-羥基苯基生物脫硫的產(chǎn)物[18]，可能是肺結(jié)核診斷的另一個(gè)呼出氣VOCs標(biāo)記物。

呼出氣VOCs檢測(cè)可快速分辨痰菌陽(yáng)性患者，是診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的一個(gè)快速、準(zhǔn)確、無創(chuàng)的新方法。但在目前研究中存在以下幾個(gè)問題：①以上研究?jī)H以健康人群作為對(duì)照，結(jié)核合并細(xì)菌或其他病菌感染也可以引起氧化應(yīng)激，不能排除其導(dǎo)致的呼出氣VOCs升高；②結(jié)核分枝桿菌代謝及肺結(jié)核患者氧化應(yīng)激產(chǎn)生VOCs的機(jī)制尚不明確；③缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的VOCs收集及檢測(cè)方法，導(dǎo)致其檢測(cè)結(jié)果差異較大；④研究結(jié)果多來自較小的試點(diǎn)研究，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究，以確認(rèn)VOCs在肺結(jié)核中的診斷價(jià)值。

2.2EBC檢測(cè)EBC檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、無創(chuàng)、患者易接受等優(yōu)點(diǎn)，在肺癌、支氣管哮喘、肺炎等疾病中的研究較多，但在肺結(jié)核病診斷中的相關(guān)性研究較少。Adams等[19]采用單顆粒氣溶膠質(zhì)譜法對(duì)EBC進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示可以從其他分枝桿菌中區(qū)分結(jié)核分枝桿菌，提示單顆粒氣溶膠質(zhì)譜法有望成為快速篩查肺結(jié)核病EBC的新技術(shù)。Jain等[20]在初診活動(dòng)性肺結(jié)核患者EBC中未檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌的IS6110 DNA重復(fù)元件，認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌不能在EBC中生長(zhǎng)。

2.3NO檢測(cè)呼出氣NO(eNO)檢測(cè)在哮喘中的應(yīng)用已被美國(guó)胸科學(xué)會(huì)和歐洲呼吸協(xié)會(huì)認(rèn)同[21]，而在結(jié)核病中是否具有同樣的診斷價(jià)值尚不明確。Van Beek等[22]發(fā)現(xiàn)，eNO檢測(cè)對(duì)于肺結(jié)核的直接診斷價(jià)值比較有限，但是其篩查潛在肺結(jié)核的敏感性(84%)和特異性(67%)均較高。因此，eNO檢測(cè)有望成為潛在肺結(jié)核的篩查方法。

3呼出氣檢測(cè)在肺結(jié)核療效、預(yù)后判斷中的應(yīng)用

3.1EBC檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)呼吸道具有強(qiáng)烈的刺激作用，促使單核巨噬細(xì)胞破裂，產(chǎn)生大量活性氧和氮中間體。其中H2O2和NO可以從肺泡襯液中蒸發(fā)，EBC中H2O2和NO含量可反映呼吸道炎癥反應(yīng)和局部氧化應(yīng)激情況，由此判斷肺結(jié)核的療效和預(yù)后。Kwiatkowska等[23]檢測(cè)了16例活動(dòng)性肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療前及治療后2個(gè)月EBC中H2O2含量及血清IL-18水平，發(fā)現(xiàn)患者氣道氧化應(yīng)激反應(yīng)在成功抗結(jié)核治療2個(gè)月后降低。Ralph等[24]研究發(fā)現(xiàn)，EBC中NO的降低不利于肺結(jié)核的治療，其含量與肺結(jié)核患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)。因此，通過檢測(cè)EBC中H2O2和NO的含量可在一定程度上反映療效及判斷預(yù)后，但這方面的研究較少，需進(jìn)一步研究。

3.2同位素標(biāo)記檢測(cè)穩(wěn)定的同位素標(biāo)記檢測(cè)是肺結(jié)核患者呼出氣檢測(cè)中的另一個(gè)研究方向。Mirbagheri等[25]研究發(fā)現(xiàn)，尿素14C呼氣試驗(yàn)可以作為評(píng)估肺結(jié)核治療效果一種手段。Jassal等[26]使用結(jié)核桿菌動(dòng)物模型，在異煙肼治療后2個(gè)月直接用13C標(biāo)記的尿素氮進(jìn)行肺內(nèi)灌注，13C尿素氮通過結(jié)核菌脲酶活性在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為13CO2，能夠通過呼吸測(cè)試檢測(cè)出來。結(jié)核分枝桿菌中存在一定數(shù)量的CO脫氫酶，CO可被其轉(zhuǎn)化為CO2排出。Maiga等[27]通過檢測(cè)感染結(jié)核分枝桿菌動(dòng)物模型中被標(biāo)記的CO2，可快速識(shí)別出感染動(dòng)物模型。異煙肼是通過結(jié)核分枝桿菌katG基因酶活化為乙酰異煙肼自由基，進(jìn)而發(fā)揮抗結(jié)核作用。Choi等[28]使用15N標(biāo)記異煙肼，并通過質(zhì)譜儀檢測(cè)被感染動(dòng)物呼出氣體中是否有標(biāo)記過的氮?dú)?，證實(shí)該方法可以快速檢測(cè)出對(duì)異煙肼敏感的結(jié)核病。呼出氣中同位素檢測(cè)可能會(huì)成為肺結(jié)核診斷和評(píng)估療效的一個(gè)快速檢測(cè)手段，但目前研究仍停留于小樣本的細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)階段，要實(shí)現(xiàn)真正的臨床應(yīng)用還需擴(kuò)大樣本，進(jìn)一步驗(yàn)證肺結(jié)核呼出氣同位素檢測(cè)的可重復(fù)性、準(zhǔn)確性和特異性。

3.3VOCs檢測(cè)目前，關(guān)于呼出氣VOCs檢測(cè)與肺結(jié)核病治療療效、預(yù)后判斷的關(guān)系尚無相關(guān)研究[29]，可作為未來重點(diǎn)研究的方向之一。

綜上所述，呼出氣檢測(cè)具有快速、無創(chuàng)、特異性高、取樣方便等特點(diǎn)，有很好的發(fā)展前景。雖然呼出氣檢測(cè)在疾病診斷中已有20多年發(fā)展歷史，但在肺結(jié)核方面的研究還處于初步階段，國(guó)內(nèi)尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，而國(guó)際上關(guān)于肺結(jié)核呼出氣檢測(cè)缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的采集方法、分析方法以及參考值。因此，臨床上仍需對(duì)肺結(jié)核患者的呼出氣檢測(cè)進(jìn)行深入研究。

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(收稿日期：2015-07-25)

中圖分類號(hào)：R473.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)12-0099-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.038

通信作者：王利民(E-mail: wlm404@aliyun.cn)

基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金資助項(xiàng)目(150170)；綿陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)局科研基金資助項(xiàng)目(13S001-11)。