李由然， 王珊瑛， 楊韻霏， 顧正華，張 梁， 丁重陽(yáng)， 石貴陽(yáng)*

(1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

嗜熱放線菌海藻糖合成酶在地衣芽孢桿菌中的異源表達(dá)

李由然1，2， 王珊瑛1，2， 楊韻霏1，2， 顧正華1，2，張 梁1，2， 丁重陽(yáng)1，2， 石貴陽(yáng)*1，2

(1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

海藻糖合成酶可將麥芽糖異構(gòu)化為海藻糖，是海藻糖酶法生物轉(zhuǎn)化的中心酶制劑。為了實(shí)現(xiàn)海藻糖合成酶在食品安全型表達(dá)宿主中高效生產(chǎn)，進(jìn)而應(yīng)用于食品級(jí)海藻糖的酶法合成，構(gòu)建了革蘭氏陽(yáng)性菌重組表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入地衣芽孢桿菌。重組質(zhì)粒攜帶了來(lái)自于嗜熱放線菌Thermomonospora curvata海藻糖合成酶的編碼基因，在地衣芽孢桿菌木糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子及其阻遏蛋白的介導(dǎo)下表達(dá)，胞內(nèi)海藻糖合成酶發(fā)酵活力為12.1 U/mL?？疾炝瞬煌囵B(yǎng)條件對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果顯示質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的麥芽糊精和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的豆餅粉分別為產(chǎn)酶適宜的碳源和氮源；菌體培養(yǎng)10 h后加入終質(zhì)量濃度為1 g/dL的誘導(dǎo)劑，于37℃誘導(dǎo)12 h后重組菌產(chǎn)酶最高達(dá)到23.7 U/mL。

海藻糖合成酶；嗜熱放線菌；地衣芽孢桿菌；誘導(dǎo)表達(dá)

海藻糖是麥芽糖的同分異構(gòu)體，它由兩分子葡萄糖通過(guò)α-1，1-糖苷鍵相連而成。海藻糖是化學(xué)性質(zhì)最為穩(wěn)定的糖，不具有還原性，不易被酸水解；α-葡萄糖苷酶也無(wú)法水解其糖苷鍵。結(jié)晶海藻糖的熔點(diǎn)為97℃，當(dāng)溫度進(jìn)一步升高，它通常所結(jié)合的二個(gè)水分子會(huì)與之逐步分離，直至130℃完全脫水并重新凝固；無(wú)水海藻糖的熔點(diǎn)為203℃[9]。海藻糖最為引人注目的方面在于其對(duì)生命過(guò)程穩(wěn)定性的維持作用，這一作用廣泛存在于不同物種；其中對(duì)高溫，嚴(yán)寒和脫水的抵御作用尤為突出。經(jīng)過(guò)多年探索，研究者們已初步揭示了海藻糖這些功能的內(nèi)在機(jī)理。分子模型顯示，海藻糖在脫水和冷凍過(guò)程中可以代替原本結(jié)合于不同生物結(jié)構(gòu)的水分子，從而維持生物大分子的穩(wěn)定性，避免不可逆變性[13]。另一方面，對(duì)水合作用的研究表明，由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，海藻糖較其他寡糖有更高的水合能力，這有助于固定磷脂雙分子膜周?chē)乃肿右约霸诿撍^(guò)程中直接與極性生物大分子建立新的連接[14-15]?；谝陨仙锾匦裕Ｔ逄蔷哂袕V泛應(yīng)用。如在食品領(lǐng)域可作為理想的保鮮劑；在保健品領(lǐng)域可作為活菌制劑的保護(hù)劑；在醫(yī)藥領(lǐng)域可用來(lái)保藏血漿和疫苗等生物活性物質(zhì)。

海藻糖的早期生產(chǎn)主要從干酵母中提取，由于含量低，提取工藝復(fù)雜，這樣獲得的海藻糖成本極高，使其應(yīng)用僅局限于特殊領(lǐng)域[8]。之后出現(xiàn)了發(fā)酵法，基因重組法，化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化法，其中酶轉(zhuǎn)化法具有轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，作用溫和，無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，因而被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ暮Ｔ逄枪I(yè)生產(chǎn)方法[2]。用海藻糖合成酶通過(guò)轉(zhuǎn)苷作用將廉價(jià)易得的麥芽糖轉(zhuǎn)化生成海藻糖是酶轉(zhuǎn)化法的重要途徑之一。目前，已從 Thermomonospora curvata，Thermobifida fusca， Pimelebacter sp.， Thermus aquaticus，Pseudomonas putida 和 Pseudomonas stutzeri等菌體中克隆和鑒定出海藻糖合成酶基因TreS，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)[1-4]。其中來(lái)自Thermomonospora curvata的海藻糖合成酶不僅可以轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖（轉(zhuǎn)化率70%），當(dāng)以蔗糖為底物時(shí)還可以生成海藻酮糖（轉(zhuǎn)化率80%），同時(shí)該酶的穩(wěn)定性極高，在4℃下保存一年幾乎不損失酶活[3]。由于野生菌的產(chǎn)酶量極低，大腸桿菌重組酶又不適合用于食品行業(yè)，這一性能優(yōu)良的新型酶制劑難以獲得廣泛的應(yīng)用。作為另一大類(lèi)表達(dá)宿主，芽孢桿菌類(lèi)細(xì)菌是諸如酶制劑以及生物殺蟲(chóng)劑等工業(yè)產(chǎn)品的重要生產(chǎn)菌株。其中又以地衣芽孢桿菌尤為突出，這是因?yàn)樗軌蚋咝Ш铣傻鞍祝瑫r(shí)培養(yǎng)條件又較為簡(jiǎn)單。自1972年起，它就已經(jīng)被安全地用于淀粉酶的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。作者所在研究室前期在工業(yè)生產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一株淀粉酶和蛋白酶缺失的地衣芽孢桿菌表達(dá)宿主BL002。作者將Thermomonospora curvata的海藻糖合成酶基因TreS在芽孢桿菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化入于BL002中，實(shí)現(xiàn)了其在地衣芽孢桿菌中的功能表達(dá)，這是該基因首次在芽孢桿菌類(lèi)宿主中的表達(dá)研究。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

Thermomonospora curvata JCM 3096：購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）。Bacillus megaterium CICIM B1514，表達(dá)宿主菌BL002，大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pHY300-PLK：作者所在研究室保藏。芽孢桿菌轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[16]配制。大腸桿菌/芽孢桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基TB和篩選培養(yǎng)基TBT（含四環(huán)素）按照文獻(xiàn)[5]配制。芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基 （/L）：200 g葡萄糖，70 g豆餅粉，7 g玉米漿。重組大腸桿菌培養(yǎng)基中添加100 μg/mL氨芐青霉素，重組芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基中添加20 μg/mL四環(huán)素。

1.2 主要試劑

重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程中所使用的各種限制性?xún)?nèi)切酶，T4DNA連接酶：Thermo Fisher公司產(chǎn)品；DNA聚合酶：TAKARA（大連）有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒以及核苷酸片段純化試劑盒：Axygen（美國(guó)）生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；新霉素和壯觀霉素：生工公司（上海）產(chǎn)品；其它所使用的藥品和試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

首先提取Bacillus megaterium CICIM B1514基因組DNA，使用pfu DNA聚合酶及引物BmP-F（5'-GCCAGATCTTAACTAACTTATAGGGGT -3'） 和BmP-R（5'-CGCCCCGGGTTGTCATTTCCCCCTTT-3'）擴(kuò)增獲得啟動(dòng)子序列Pb。反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性5 min后進(jìn) 入下一循環(huán)：95℃變性10 s，54℃退火10 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min，4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后經(jīng)BglII和BamHI雙酶切，連接至同樣酶切的載體pHY300-PLK上，獲得重組質(zhì)粒 pHY-Pb。然后提取Thermomonospora curvata JCM 3096的基因組DNA，使用 pfu DNA聚合酶及引物 TreS-F （5'-TTAAGATCTACCGGGGACCCCATCCCC -3'） 和TreS-R（5'-CTTCGCCGTCTGCCGGGT-3'）擴(kuò)增獲得TreS。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min后進(jìn) 入下一循環(huán)：95℃變性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后克隆至載體pMD18-T-simple送樣測(cè)序。提取驗(yàn)證無(wú)誤的轉(zhuǎn)化子后用BamHI和SmaI雙酶切并膠回收基因片段，再亞克隆至經(jīng)同樣酶切的載體pHY-Pb上，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pHY-Pb-TreS。

1.4 地衣芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化

將過(guò)夜培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌BL002接種于25 mL 416#培養(yǎng)基中（接種量3%），于37℃，200 r/min培養(yǎng)8 h。冷凍離心（2 000 g，8 min）收集菌體，用10 mL SMMP重懸，加溶菌酶至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，37℃，100 r/min培養(yǎng)至85%的細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體。離心收集制備好的原生質(zhì)體，加入1~5 μg的質(zhì)粒及等體積的緩沖液，再加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%PEG6000，輕輕顛倒混勻后，加5 mL SMMP混勻；4℃，2 000 g離心8 min，棄上清后再加入500 μL的SMMP，30℃，100 r/min培養(yǎng)130 min，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48~72 h后驗(yàn)證長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子。

1.5 重組海藻糖合成酶的誘導(dǎo)表達(dá)

過(guò)夜培養(yǎng)攜帶表達(dá)質(zhì)粒pHY-Pb-TreS的重組地衣芽孢桿菌作為種子，以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，首先在37℃，250 r/min條件下培養(yǎng)6 h；接著，加入木糖至終質(zhì)量濃度為1 g/L繼續(xù)培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體，經(jīng)磷酸-檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.0）重懸后用超聲波破碎細(xì)胞 （功率為400 W，每破碎1 s停3 s，共破碎10 min）。細(xì)胞破碎液經(jīng)高速離心（10 000 g，20 min）后取上清液即為酶液。

1.6 海藻糖合成酶活力檢測(cè)

向100 μL使用20 mmol/L pH 6.5的磷酸緩沖液配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%麥芽糖溶液中加入100 μL稀釋至合適濃度的酶液，于40℃反應(yīng)2 h。使用沸水浴終止反應(yīng)后使用高效液相系統(tǒng)HPLC測(cè)定海藻糖含量。檢測(cè)條件為：層析柱，XBridge Amide氨基柱（美國(guó)Waters）；流動(dòng)相，v（乙腈）∶v（水）=80∶20；流量0.8 mL/min；示差檢測(cè)器。酶活定義為每小時(shí)生成1 μmoL海藻糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

1.7 重組酶的分離純化

重組海藻糖合成酶的分離純化分三步進(jìn)行。粗酶液首先經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀濃縮除雜，所獲得的蛋白沉淀用pH 8.0的Tris-HCl緩沖液重懸后上樣至連接于 AKTA Purifier 100層析系統(tǒng)的疏水柱HiTrap Phenyl FF（high sub，GE，瑞典），A液為50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）；B液為A液中加入2 mol/L（NH4）2SO4。層析方法為在20個(gè)柱體積的時(shí)間內(nèi)從體積分?jǐn)?shù)100%的B液變化至0%B液，流量1 mL/min，使用紫外檢測(cè)器在260 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)蛋白的分離情況。所收集的活性組分再上樣至Sephacryl S-200分子篩凝膠柱（GE，瑞典），緩沖液為50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5），其中加入0.1 mol/L的NaCl以防止非特異性吸附，流量為0.5 mL/min，所獲得活性組分即為純酶。

1.8 不同溫度對(duì)酶活力和酶穩(wěn)定性的影響

以麥芽糖為底物分別在10~70℃檢測(cè)重組酶純酶活力，考察不同作用溫度對(duì)酶活的影響。進(jìn)一步地，將酶液分別在10~70℃下保溫1 h后使用標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定殘余酶活，考察重組海藻糖合成酶在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.9 不同pH對(duì)酶活力和酶穩(wěn)定性的影響

分別在不同pH的緩沖體系下（pH 4.0-5.8 0.05 mol/L乙酸鈉緩沖液，pH 5.8-7.8 0.05 mol/L磷酸緩沖液，pH 7.8-9.0 Tris-HCl緩沖液）檢測(cè)重組海藻糖合成酶純酶的活力，考察不同作用溫度對(duì)酶活的影響。進(jìn)一步地，將酶液分別在不同pH的緩沖體系中于室溫（20℃）保溫1 h后使用標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定殘余酶活，考察重組海藻糖合成酶在不同pH下的穩(wěn)定性。

1.10 不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活力的影響

為了探索重組海藻糖合成酶的激活劑及抑制劑，在酶液中加入不同的化學(xué)物質(zhì)后，于室溫靜置10 min，再于標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定酶活。

1.11 重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

使用不同濃度的麥芽糖（2~10 mg/mL）作為底物在標(biāo)準(zhǔn)條件下反應(yīng)，檢測(cè)產(chǎn)物生成量從而計(jì)算重組海藻糖合成酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax。

1.12 重組酶的底物特異性與水解產(chǎn)物分析

在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用重組海藻糖合成酶作用于不同的底物，包括麥芽糖，海藻糖，可溶性淀粉，糊精，乳糖，麥芽三糖。使用HPLC連接氨基柱Waters XBridge Amide分析產(chǎn)物，所用層析條件同活力檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以 Bacillus megaterium CICIM B1514基因組DNA為模板，使用引物BmP-F和BmP-R擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物大小為1.4 kb，與NCBI上登記的木糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子連同其調(diào)控原件的大小一致。將其連接至穿梭克隆載體 pHY300-PLK。 接 下來(lái) 以Thermomonospora curvata JCM 3096的基因組DNA為模板，使用引物TreS-F和TreS-R擴(kuò)增獲得大小為1.8 kb的產(chǎn)物，與預(yù)期大小一致。將其連接至克隆載體pMD18-T-simple，測(cè)序結(jié)果表明所獲得片段的核苷酸序列與 NCBI中來(lái)自 Thermomonospora curvata DSM 43183的海藻糖合成酶基因同源性為100%。然后，將已驗(yàn)證的編碼基因片段從克隆載體上經(jīng)BamHI和SmaI雙酶切并膠回收后連入載體pHY-Pb。所獲得重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和BglII雙酶切后在電泳上顯示出3.2 kb和4.8 kb的DNA片段，表明重組質(zhì)粒pHY-Pb-TreS構(gòu)建成功（圖1）。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒在地衣芽孢桿菌BL002中的表達(dá)

地衣芽孢桿菌的細(xì)胞壁由一層肽聚糖組成，適合使用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入外源DNA。將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期（8 h）時(shí)用溶菌酶制備原生質(zhì)體，結(jié)果顯示在100 μg/mL的酶質(zhì)量濃度條件下處理30 min時(shí)原生質(zhì)體數(shù)最高，達(dá)到1010個(gè)/mL，此時(shí)的原生質(zhì)體形成率超過(guò)80%，且再生率達(dá)到17%。在此條件下，質(zhì)粒pHY-Pb-TreS對(duì)地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化率為15 cfu/μgDNA。該轉(zhuǎn)化率低于電擊轉(zhuǎn)化所得到的轉(zhuǎn)化率[11]，但獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的幾率遠(yuǎn)高于電擊轉(zhuǎn)化方法（>90%），可減少后期驗(yàn)證的工作量。

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中250 r/min培養(yǎng)6 h，加入終質(zhì)量濃度為1 g/L的木糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束時(shí)的菌體量（A600nm）為26.3.收集菌體破碎后，上清液中海藻糖合成酶活力為12.1 U/mL，攜帶空載體的宿主菌株BL002胞內(nèi)未檢測(cè)到酶活，SDS-PAGE顯示重組蛋白的亞基相對(duì)分子質(zhì)量大小約為70 000（圖2（a）），與根據(jù)氨基酸序列計(jì)算得到的理論大小69 000相符。

2.3 重組酶的分離純化

為了研究重組海藻糖合成酶的酶學(xué)性質(zhì)，首先需要對(duì)粗酶純化，分3步分離得到重組酶純酶，純化結(jié)果如表1和圖2（b）所示。首先采用鹽析處理粗酶液。高濃度的鹽離子在溶液中可以破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子從而降低其溶解度。由于各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，可以控制溶液中的鹽濃度而分離不同蛋白質(zhì)。鹽析通常使用硫酸銨，這是因?yàn)槠鋵?duì)多數(shù)蛋白質(zhì)的活力沒(méi)有影響，同時(shí)溶解度大，溫度系數(shù)小。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定的除雜條件為質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%飽和度的硫酸銨，重組酶的收集條件為質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%飽和度的硫酸銨。鹽析回收的酶經(jīng)緩沖液重懸后直接上樣至疏水層析柱在高鹽濃度條件下富集，再通過(guò)鹽濃度逐漸降低的線性梯度進(jìn)行洗脫。所獲得的活性組分經(jīng)冷凍干燥濃縮后在上樣至凝膠分子篩層析，最終獲得了電泳純的重組海藻糖合成酶，比酶活為9.39 U/mg，收率為47.8%。

2.4 重組酶的溫度適應(yīng)性

在10~70℃的范圍內(nèi)研究了純化后的重組海藻糖合成酶的最適作用溫度和溫度穩(wěn)定性。以最適溫度下或穩(wěn)定性最高溫度下的酶活為100%作圖，結(jié)果如圖3所示。重組酶的最適作用溫度為35℃，且當(dāng)溫度低于15℃或高于50℃時(shí)活力大幅度減弱。其在40℃以下具有較高的穩(wěn)定性，保溫1 h后仍能保留80%以上的酶活。而在60℃以上的環(huán)境中保溫1 h酶活幾乎全部喪失。日本林原酶制劑公司是國(guó)際上海藻糖生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的先行者，許多微生物海藻糖合成酶都由其篩選并報(bào)道。根據(jù)其發(fā)表的研究論文，大多數(shù)細(xì)菌來(lái)源的海藻糖合成酶最適作用溫度均在30℃左右，僅有少數(shù)放線菌或古細(xì)菌來(lái)源的海藻糖合成酶的最適作用溫度高于60℃[2，4]。盡管在許多領(lǐng)域高溫酶因其生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的高效率和高穩(wěn)定性備受青睞，但是林原公司最終選擇了一株來(lái)自細(xì)菌的低溫海藻糖合成酶進(jìn)行海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)。這是由于低溫酶較高溫酶的副產(chǎn)物（葡萄糖）較少，在產(chǎn)物提純的工藝方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

2.5 重組酶的pH適應(yīng)性

在pH 4~9的范圍內(nèi)研究了純化后的重組海藻糖合成酶的最適作用溫度和溫度穩(wěn)定性。以最適溫度下或穩(wěn)定性最高溫度下的酶活為100%作圖，結(jié)果如圖4所示。重組酶的最適作用pH為6.5，且在pH 6.5~7.5的范圍內(nèi)均能顯示出最高活力，在pH 5以下或pH 8以上的環(huán)境中酶活下降顯著。同時(shí)，重組酶在pH 5.5~8.0的條件下較為穩(wěn)定，保溫1 h后仍能保留80%以上的酶活。該酶的以上特性與已報(bào)道的微生物海藻糖合成酶的pH適應(yīng)性無(wú)顯著差異。

2.6 不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活力的影響

不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)重組海藻糖合成酶純酶活力的影響如表2所示。Mn2+，F(xiàn)e3+和K+等金屬陽(yáng)離子對(duì)酶具有顯著的激活作用，最高可達(dá)對(duì)照組酶活的131%；而Cu2+，Hg2+等重金屬離子則可以完全抑制酶活。由于EDTA可與堿金屬及大部分過(guò)渡金屬絡(luò)合成穩(wěn)定的螯合物，通?？勺鳛殍b定金屬酶的化學(xué)試劑；本研究中，EDTA的添加對(duì)酶活無(wú)影響，表明該海藻糖合成酶的催化無(wú)需金屬離子作為輔基。同時(shí)，檸檬酸鹽和常用的蛋白酶抑制劑PMSF對(duì)酶活無(wú)影響，SDS和脲可不同程度地抑制酶活。

2.7 重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

Thermomonospora curvata來(lái)源的海藻糖合成酶催化了麥芽糖和海藻糖之間的可逆反應(yīng)，同時(shí)還具備催化蔗糖生成海藻酮糖的能力。因此分別選取了麥芽糖、海藻糖和蔗糖作為底物，測(cè)定了該重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示該酶以麥芽糖為底物時(shí)的Km值約為以海藻糖或蔗糖為底物時(shí)的一半，表明其對(duì)麥芽糖的親和力遠(yuǎn)大于另兩種底物。同時(shí)，以麥芽糖為底物時(shí)的最大反應(yīng)速率Vmax也較海藻糖或蔗糖為大。

2.8 重組酶的底物特異性及水解產(chǎn)物分析

使用純化后的重組海藻糖合成酶分別于最適條件下作用于1%的麥芽糖，海藻糖，可溶性淀粉，糊精，乳糖，麥芽三糖，2 h后取反應(yīng)液上樣至HPLC分析水解產(chǎn)物。結(jié)果顯示，該海藻糖合成酶僅可以麥芽糖或海藻糖為底物，催化這兩種二糖之間的可逆轉(zhuǎn)化，而對(duì)其它所選底物無(wú)作用。進(jìn)一步定量分析的結(jié)果顯示（圖5），該酶作用于最適底物麥芽糖，達(dá)到平衡后反應(yīng)液中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%的海藻糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%的麥芽糖以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的副產(chǎn)物葡萄糖。已報(bào)道的用于海藻糖生物轉(zhuǎn)化的微生物酶主要分兩種類(lèi)型。第一類(lèi)以脂肪桿菌屬（Pimelobacter.sp）來(lái)源的海藻合成酶為代表[6-7]，其特征是催化麥芽糖和海藻糖之間的可逆轉(zhuǎn)化，而對(duì)聚合度大于二的麥芽寡糖無(wú)作用；第二類(lèi)是以嗜酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）等古細(xì)菌來(lái)源的麥芽寡糖基海藻糖合成酶 （maltooligosyltrehalose synthase）[10]，其特征是作用于聚合度3及以上的麥芽寡糖，通過(guò)轉(zhuǎn)糖基作用將末端的α-1，4鍵轉(zhuǎn)化為α-1，1鍵而形成海藻糖基麥芽寡聚糖。嗜熱放線菌來(lái)源的海藻糖合成酶屬于第一類(lèi)海藻糖合成酶，該酶經(jīng)純化后作用于麥芽糖，在生成海藻糖的同時(shí)還釋放出少量葡萄糖，Nisshimoto認(rèn)為這一類(lèi)海藻糖合成酶還具有微弱的水解酶活力，因此會(huì)水解部分麥芽糖生成葡萄糖[12]，且這一水解酶活力會(huì)隨溫度升高而增加。

[1]羅鋒，段緒果，宿玲恰，等.Thermobifida fusca海藻糖合成酶基因的克隆表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化[J].中國(guó)生物工程雜志，2013，33（8）：93-99. LOU Feng，DUAN Xuguo，SU Lingqia，et al.Cloning，expression and fermentation optimization of Thermobifida fusca trehalose synthase gene in E．coli[J].China Biotechnology，2013，33（8）：93-99.（in Chinese）

[2]梁甲元.海藻糖合成酶活性中心的定點(diǎn)突變及其制備海藻酮糖的研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2013.

[3]Liang J，Huang R，Huang Y，et al.Cloning，expression，properties，and functional amino acid residues of new trehalose synthase from Thermomonospora curvata DSM 43183[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2013，90：26-32.

[4]劉俊梅，李琢偉，聶海彥，等.水生棲熱菌FL-03海藻糖合酶基因克隆及原核表達(dá)[J].食品科技，2011，36（7）：7-10. LIU Junmei，LI Zhuowei，NIE Haiyan，et al.Cloning of trehalose synthase gene from Thermus aquaticus FL-03 and prokaryotic expression[J].Food Science and Technology，2011，36（7）：7-10.（in Chinese）

[5]李永仙，鄭飛云，李崎，等.重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a（＋）-bgl誘導(dǎo)表達(dá)β-葡聚糖酶的條件優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，28（2）：250-255. LI Yongxian，ZHENG Feiyun，LI Qi，et al.Optimization of fermentation conditions of recombinant E.coli BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl producing β-glucanase[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（2）：250-255.（in Chinese）

[6]李鐳，丁宏標(biāo)，余曉斌，等.恥垢分枝桿菌海藻糖合成酶基因TreS的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007（6）：69-73. LI Lei，DING Hongbiao，YU Xiaobin，et al.Cloning and expression of treS gene from Mycobacterium smegmatis in Escherichia coli[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2007（6）：69-73.（in Chinese）

[7]尚宏麗，陳紅漫.一株產(chǎn)海藻糖合成酶嗜中溫芽孢桿菌的鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（6）：34-36. SHANG Hongli，CHEN Hongman.Studies on screening of trehalose synthase-producing strain and its enzymology properties[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2006，25（6）：34-36.（in Chinese）

[8]ELBEIN A D，PAN Y T，PASTUSZAK I，et al.New insights on trehalose：a multifunctional molecule[J].Glycobiology，2003，13（4）：17R-27R.

[9]RICHARDS A B，KRAKOWKA S，DEXTER L B，et al.Trehalose：a review of properties，history of use and human tolerance，and results of multiple safety studies[J].Food and Chemical Toxicology，2002，40（7）：871-898.

[10]GUEGUEN Y，ROLLAND J L，SCHROECK S，et al.Characterization of the maltooligosyl trehalose synthase from the thermophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius[J].Fems Microbiology Letters，2001，194（2）：201-206.

[11]XUE G P，JOHNSON J S，DALRYMPLE B P.High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis[J].Journal of Microbiological Methods，1999，34（3）：183-191.

[12]NISHIMOTO T，NAKANO M，NAKADA T，et al.Purification and properties of a novel enzyme，trehalose synthase，from Pimelobacter sp R48[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1996，60（4）：640-644.

[13]LESLIE S B，ISRAELI E，LIGHTHART B，et al.Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying[J].Applied and Environmental Microbiology，1995，61（10）：3592-3597.

[14]KAWAI H，SAKURAI M，INOUE Y，et al.Hydration of oligosaccharides：Anomalous hydration ability of trehalose[J]. Cryobiology，1992，29（5）：599-606.

[15]CROWE J H，CARPENTER J F，CROWE L M，et al.Are freezing and dehydration similar stress vectors?A comparison of modes of interaction of stabilizing solutes with biomolecules[J].Cryobiology，1990，27（3）：219-231.

[16]THORNE C B，STULL H B.Factors affecting transformation of Bacillus licheniformis[J].Journal of Bacteriology，1966，91（3）.

會(huì)議信息

會(huì)議名稱(chēng)(中文)：第六屆全國(guó)植物蛋白質(zhì)研究大會(huì)

所屬學(xué)科：動(dòng)植物微生物學(xué),細(xì)胞生物學(xué)

開(kāi)始日期：2016-12-17 結(jié)束日期：2016-12-20

所在城市：海南省 ?？谑?主辦單位：中國(guó)植物學(xué)會(huì)

協(xié)辦單位：中國(guó)細(xì)胞學(xué)會(huì)染色質(zhì)與蛋白質(zhì)組專(zhuān)業(yè)委員會(huì)

承辦單位：海南大學(xué) 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 海南師范大學(xué)

主題：從組學(xué)到蛋白質(zhì)生物學(xué)功能研究

會(huì)議主席：朱玉賢 中國(guó)科學(xué)院院士 武漢大學(xué)（國(guó)內(nèi)主席）Steven Briggs美國(guó)科學(xué)院院士 加州大學(xué)（國(guó)際主席）

聯(lián)系人：王丹

E-MAIL：plantprotein_wd@163.com

會(huì)議網(wǎng)站：http://www.plantprotein.org.cn/

會(huì)議背景介紹：隨著人類(lèi)基因組及各種生物基因組計(jì)劃的完成，生物學(xué)研究隨之從基因組研究時(shí)代進(jìn)入后基因組時(shí)代即蛋白質(zhì)組研究時(shí)代，功能蛋白的深入研究，是后基因組時(shí)代的重要研究方向。人類(lèi)蛋白質(zhì)組草圖的完成，掀起了蛋白質(zhì)組及蛋白功能研究的新熱潮，這也將是全球科學(xué)家關(guān)注的新焦點(diǎn)和新熱點(diǎn)。無(wú)論是那種研究技術(shù)，最終的研究目標(biāo)都聚焦在蛋白生物學(xué)功能，整合各種生物學(xué)研究技術(shù)，深入解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能將是近年研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。植物組學(xué)研究已經(jīng)得到了人們的關(guān)注，各種植物全基因組測(cè)序的完成，為植物蛋白質(zhì)組展開(kāi)提供了條件。 在蛋白質(zhì)研究飛速發(fā)展的今天，擬召開(kāi)為期3天的第六屆全國(guó)植物蛋白質(zhì)研究大會(huì)，以及為期7天的第二屆植物蛋白質(zhì)組最新研究技術(shù)免費(fèi)培訓(xùn)班。大會(huì)的主題是從組學(xué)到蛋白功能，內(nèi)容將會(huì)包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組及生物信息等研究?jī)?nèi)容。我們熱烈邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)外從事植物蛋白質(zhì)研究專(zhuān)家學(xué)者，冬季匯聚海南，進(jìn)行深度學(xué)術(shù)交流，共同探討植物蛋白質(zhì)合作發(fā)展大計(jì)。

Heterologous Expression of Trehalose Synthase from a Thermophilic Actinomyces in Bacillus licheniformis

LI Youran1，2， WANG Shanying1，2， YANG Yunfei1，2， GU Zhenghua1，2，ZHANG Liang1，2， DING Zhongyang1，2， SHI Guiyang*1，2
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Trehalose synthase could transform maltose to trehalose via isomerization,which is a crucial enzyme in the process of trehalose biotransformation with enzymatic method.Recombinant expression plasmid was constructed in order to effectively produce food-grade trehalose synthase in food safety host. The plasmid harbored a trehalose synthase encoding gene from Thermomonosporacurvata,which was expressed under the control of a xylose operon from Bacillus megaterium.The enzyme activity yield of intracellular trehalose synthase reached to 12.1 U/mL after fermentation when expressed by xylose isomerase promoter and its repressor protein in Bacillus licheniformis.Furthermore,the effect of different cultural conditions on the enzyme production wasinvestigated and the optimal condition was determined with 4%maltodextrin,0.4%soybean powder, and 1%inducer added after 10 h incubation.The maximal yield was 23.7 U/mL after 12 h induction at 37℃.The study would contribute to the industrial application of trehalose synthase from both theoretical and experimental aspects.

Trehalosesynthase，Thermomonosporacurvata，Bacilluslichenifotmis，inducibleexpression

Q 814

A

1673—1689（2016）11—1148—08

2015-02-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401674）；江南大學(xué)自主科研重點(diǎn)項(xiàng)目（JUSRP51503）。

李由然（1985—），男，河南鄭州人，工學(xué)博士，講師，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：liyouran@jiangnan.edu.cn

*通信作者：石貴陽(yáng)（1963—），男，浙江紹興人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：gyshi@jiangnan.edu.cn