呂　超， 劉保國(guó)，　鄭海萍，　劉　青，　李志峰，　顧　靜，　周　萌

(1. 承德醫(yī)學(xué)院研究生院，承德，河北 067000；2. 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，邯鄲，河北056002)

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研究報(bào)告

DMBA/巴豆油二階法聯(lián)合NB-UVB照射構(gòu)建小鼠皮膚鱗癌模型

呂超1， 劉保國(guó)2，鄭海萍2，劉青2，李志峰2，顧靜1，周萌1

(1. 承德醫(yī)學(xué)院研究生院，承德，河北 067000；2. 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，邯鄲，河北056002)

【摘要】目的用二甲基苯并蒽(DMBA)/巴豆油二階法聯(lián)合NB-UVB 照射，構(gòu)建皮膚鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型。方法將50只BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組：A組外涂DMBA/巴豆油；B組照射NB-UVB；C組外涂DMBA/巴豆油，聯(lián)合NB-UVB照射。實(shí)驗(yàn)過程中定期觀察小鼠的一般情況和實(shí)驗(yàn)部位皮膚的變化，于第5、10、15、20周統(tǒng)計(jì)各組小鼠的存活率及成瘤率。第20周時(shí)取小鼠皮損組織進(jìn)行病理檢查。結(jié)果第5周末，部分C組小鼠出現(xiàn)直徑≥1 mm的丘疹，第20周后，三組成瘤率分別為86.67%，7.14%，94.12%；SCC發(fā)生率分別為：13.34%，0%，70.59%。結(jié)論DMBA/巴豆油二階法聯(lián)合NB-UVB構(gòu)建小鼠皮膚鱗癌模型較單獨(dú)應(yīng)用DMBA/巴豆油二階法或NB-UVB照射成瘤時(shí)間短，成瘤率和SCC發(fā)生率高。

【關(guān)鍵詞】鱗狀細(xì)胞癌；二甲基苯并蒽；巴豆油；模型，動(dòng)物

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是人類皮膚較為常見的腫瘤之一，其發(fā)生與紫外線中的UVB誘導(dǎo)[1]、病毒感染、接觸焦油衍生物、放射線、砷劑等物質(zhì)有關(guān)，探討鱗癌的發(fā)生機(jī)制、防治以及預(yù)后都具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過探討如何建立一個(gè)成瘤速度快，荷瘤率高，穩(wěn)定性好，可行性高的小鼠皮膚鱗癌模型，為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

BALB/c小鼠50只，SPF級(jí)，雌、雄各半，6～8周齡，體重在16～18 g左右，從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司引進(jìn)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]，由河北省邯鄲市康業(yè)制藥有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心負(fù)責(zé)飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(冀)2012-0001]。本單位動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)號(hào)為20150406。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)周圍環(huán)境1周，動(dòng)物飼養(yǎng)室為清潔級(jí)，室溫20～24℃，給予BALB/c小鼠專用飼料和普通水飼養(yǎng)。

1.2儀器與試劑

脫毛劑：硫化鈉、洗衣粉、淀粉按3∶1∶7的比例混合，并加水兌成乳膠狀；誘癌劑：二甲基苯并蒽(DMBA，Sigma公司)與丙酮液配制成0.75 g/L的DMBA丙酮液，巴豆油(Sigma公司)與丙酮液配制成0.25%的巴豆油丙酮液。 SH-4 B型紫外線光療儀(產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：YZB/滬4663-26-2012)，輻照強(qiáng)度值13.4 mW/cm2，波長(zhǎng)311～313 nm，上海希格瑪公司產(chǎn)品。

1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1動(dòng)物分組：各組小鼠的體重及周齡的平均值通過方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)小鼠以數(shù)字編碼隨機(jī)分成3組：A組(15只)：僅外涂DMBA/巴豆油；B組(15只)：僅照射NB-UVB；C組(20只)：外涂DMBA/巴豆油聯(lián)合NB-UVB照射。

1.3.2模型構(gòu)建階段：A組小鼠在實(shí)驗(yàn)的第1、5、10 天，分別將200 μL DMBA丙酮液涂抹于背部脫去毛發(fā)處，每次涂藥前1 d進(jìn)行皮膚脫毛處理，從第3周開始每周四、周日涂抹200 μL巴豆油丙酮液。B組從第3周開始進(jìn)行NB-UVB照射，每周進(jìn)行脫毛1次，照光時(shí)將小鼠固定于底徑10 cm的敞口密閉器具內(nèi)，照射距離20 cm，分別于每周一、二、三、五、六5 d進(jìn)行，起始劑量為0.5 J/cm2，逐次遞增，每周增加0.1 J/cm2，至第20周照射劑量為2.2 J/cm2時(shí)停止，累計(jì)劑量為119 J/cm2。C組小鼠在實(shí)驗(yàn)的第1、5、10天，分別將200 μL DMBA丙酮液涂抹于背部脫去毛發(fā)處，每次涂藥前1 d進(jìn)行皮膚脫毛處理，從第3周開始每周四和周日涂抹200 μL巴豆油丙酮液，每周脫毛一次，每周其余5 d進(jìn)行NB-UVB照射，照射條件、起始劑量、累計(jì)劑量等與B組相同。

1.3.3腫瘤計(jì)數(shù): 采用數(shù)碼相機(jī)拍攝小鼠背部皮膚的變化，記錄直徑≥1 mm且持續(xù)時(shí)間≥2周的新生物，每周觀察各組小鼠荷瘤數(shù)和直徑的變化。

1.3.4病理學(xué)檢查:第20周末肉眼觀察小鼠成瘤情況，并統(tǒng)計(jì)成瘤率及存活率，局部固定小鼠，在利多卡因局麻下切取瘤體。置于4%中性甲醛液中固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片，HE染色，針對(duì)病理學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法: 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。小鼠荷瘤率及皮膚鱗癌發(fā)生率使用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組荷瘤小鼠和荷瘤率

從第5周末開始，C組部分小鼠皮膚開始出現(xiàn)直徑≥l mm的丘疹，且新生物隨著時(shí)間逐漸增大，數(shù)量漸增多，且部分皮損相互融合。每組小鼠的荷瘤比例及各組小鼠荷瘤的瘤體數(shù)逐漸增多，分別見于表1、2。每組小鼠荷瘤比例=每組荷瘤小鼠只數(shù)/每組小鼠存活只數(shù)，成瘤率 = 各組成瘤小鼠數(shù)/該組存活小鼠數(shù) × 100%，SCC發(fā)生率=各組小鼠SCC發(fā)生總數(shù)/該組存活小鼠數(shù) × 100%。各組成瘤率分別為86.67%、7.14%、94.12%；SCC發(fā)生率分別為：13.34%、0%、70.59%。

表1　各組小鼠荷瘤比例

注：第10周時(shí)A組、C組荷瘤率比較，P<0.05；第15周、20周P>0.05

Note. Compared the group A with group C，P<0.05；P>0.05 at 15 weeks and 20 weeks.

表2　各組小鼠荷瘤總個(gè)數(shù)

2.2小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況

C組于第5周后皮膚開始出現(xiàn)直徑≥l mm的丘疹，A組、B組分別于第6周、第12周后部分小鼠才出現(xiàn)類似新生物，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，新生物表面逐漸形成斑塊、結(jié)節(jié)、疣狀增生、潰瘍或基底浸潤(rùn)，表面糜爛或有壞死組織。實(shí)驗(yàn)期間，由于對(duì)環(huán)境不耐受死亡1只，脫毛手法錯(cuò)誤死亡1只，脫毛膏配置不合格引起小鼠死亡2只，誘癌中后期小鼠出現(xiàn)明顯消瘦、體重下降等惡病質(zhì)體質(zhì)，暫無死亡。

2.3小鼠腫瘤組織病理學(xué)改變

根據(jù)小鼠瘤組織病理學(xué)表現(xiàn)，將其劃分為正常、良性、異型增生、SCC，見表3。正常小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，表皮、真皮及皮下組織層次清晰，隨著實(shí)驗(yàn)周期的延長(zhǎng)，小鼠皮膚組織逐漸出現(xiàn)角化過度，棘層肥厚，表皮呈簇狀向下延伸，鱗狀細(xì)胞侵入真皮，見圖1、2；高倍鏡下呈現(xiàn)非典型角質(zhì)形成細(xì)胞增生，細(xì)胞核大小不等，染色質(zhì)豐富等表現(xiàn)，見圖3，部分高分化鱗癌可見角珠形成，見圖4。

表3　各組小鼠瘤組織病理改變

注：第20周時(shí)A組、C組SCC發(fā)生率比較，P<0.05

Note. Compared the group A with group C at 20 weeks，P<0.05.

圖1　鱗狀細(xì)胞侵入真皮，角化過度(HE，×100)，標(biāo)尺=100 μm)Fig.1　Squamous cell invasion of the dermis and hyperkeratosis.(Bar=100 μm)

圖2　棘層肥厚，表皮呈簇狀向下延伸(HE，×100，標(biāo)尺=100 μm)Fig.2　Epidermal acanthosis and the epidermis clustered with a downward extension.(Bar=100 μm)

圖3　非典型角質(zhì)形成細(xì)胞增生，細(xì)胞核大小不等，染色質(zhì)豐富(HE，×400，標(biāo)尺=100 μm)Fig.3　Atypical keratinocytes proliferation, cell nucleus ranging in size and rich in chromatin(Bar=100 μm)

圖4　 瘤細(xì)胞異型性明顯，有角珠形成(HE，×400，標(biāo)尺=100 μm)Fig.4　Marked cytological atypia with keratin pearls(Bar=100 μm)

3討論

皮膚是腫瘤好發(fā)部位，其發(fā)生與人們的生活方式、空氣污染以及外界環(huán)境中所接觸到的砷劑等化學(xué)物質(zhì)等有關(guān)，目前我國(guó)惡性皮膚腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。作為皮膚惡性腫瘤中較為常見的皮膚鱗癌，已得到越來越多學(xué)者的關(guān)注和研究。DMBA是存在于大氣、空氣、水、煙塵、土壤中的一種多環(huán)芳香烴，已廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)胰腺癌、乳腺癌、頜下腺腺癌等動(dòng)物模型的建立[3-5]。目前，DMBA/巴豆油作為國(guó)內(nèi)構(gòu)建小鼠皮膚癌的主要造模方法之一，在印度、馬來西亞等國(guó)家皮膚腫瘤的研究中也得到廣泛應(yīng)用[6-7]。紫外線輻射能夠?qū)е翫NA光損傷，從而引起基因突變、免疫抑制等一系列反應(yīng)，導(dǎo)致皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。王秀麗等人在應(yīng)用日光模擬器模擬日光照射SKH-l無毛小鼠構(gòu)建鱗癌小鼠模型的過程中發(fā)現(xiàn)紫外線照射能夠誘導(dǎo)SKH-1無毛小鼠的皮膚組織增生，而且皮損嚴(yán)重程度隨著照射劑量累積而逐漸加重[1]。Kunisada M等[8]通過研究日光導(dǎo)致皮膚腫瘤中最重要的成分，發(fā)現(xiàn)窄譜UVB更易導(dǎo)致皮膚癌。文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用DMBA/巴豆油單獨(dú)構(gòu)建皮膚鱗癌模型需要24周的時(shí)間[9]。單獨(dú)用NB-UVB作為光源，每周照射5次，構(gòu)建模型也需要28周的時(shí)間[10]，應(yīng)用日光模擬器造模到20周時(shí)成瘤率為39.3%，鱗癌發(fā)生率為60%[1]。本模型在早期采用DMBA外涂，促癌期使用巴豆油以及窄譜UVB共同作用，20周荷瘤率達(dá)到了94.12%，鱗癌發(fā)生率達(dá)到了70.59%，成功的縮短了造模周期。盡管A、C兩組小鼠荷瘤率無明顯差異，但組織病理學(xué)顯示A組誘發(fā)的鱗癌數(shù)與C組相比有差異顯著性，P<0.05，這可能與DMBA、巴豆油和窄譜UVB的聯(lián)合作用有關(guān)，即與物理、化學(xué)因素的協(xié)同作用機(jī)制有關(guān)。這與皮膚鱗癌高危人群所接觸到的致病因素，如長(zhǎng)期、高強(qiáng)度照射紫外光，DMBA、砷劑等環(huán)境污染因素共同作用的機(jī)制相似。這提示我們?cè)陬A(yù)防皮膚鱗癌的過程中，要盡量避免長(zhǎng)期、高強(qiáng)度的暴露于紫外光下，尤其是起重要作用的窄譜UVB，同時(shí)還要防止和減少促癌因素，如環(huán)境中存在的DMBA、巴豆油等致癌劑。

本次試驗(yàn)通過比較DMBA/巴豆油二階段法、紫外光、NB-UVB等常見的構(gòu)建皮膚腫瘤模型的方法，發(fā)現(xiàn)DMBA/巴豆油二階法聯(lián)合NB-UVB構(gòu)建皮膚鱗癌模型的優(yōu)越性，為進(jìn)一步研究人類皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制、發(fā)展規(guī)律、防治措施提供了更好的模型構(gòu)建方法。

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〔修回日期〕2015-12-25

Establishment of a mouse model of cutaneous squamous cell carcinoma induced by 7,12-DMBA, croton oil and narrow-band ultraviolet B irradiation

LV Chao1, LIU Bao-guo2, ZHENG hai-ping2, LIU Qing2, LI Zhi-feng2, GU Jing1, ZHOU Meng1

(1. Postgraduate Department of Chengde Medical College, Chengde 067000, China;2. Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering，Handan, Hebei 056000)

【Abstract】ObjectiveTo establish a mouse model of cutaneous squamous cell carcinoma induced by 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (7,12-DMBA)/croton oil and narrow-band ultraviolet B (NB-UVB) irradiation. Methods A total of fifty 6-8-week old BALB/c mice (male:female 1:1) were randomly divided into three experimental groups. The group A was treated with chemical carcinogens alone, group B was treated with NB-UVB alone, and group C was treated with chemical carcinogens plus NB-UVB. The general status and skin appearance of mice were observed during the experiment．The survival rate and tumor formation rate of each group was calculated at weeks 5, 10, 15, and 20. Pathological examination was carried out to observe the histological changes of skin lesions. ResultsPapules measuring ≥l mm in diameter began to develop in some mice of the group C at 5 weeks after the first treatment with chemical carcinogens. The tumor formation rates at 20 weeks after treatment were 86.67%, 7.14%, 94.12% in the groups A, B, C, respectively. Pathological examination revealed characteristic changes of squamous cell carcinoma in 13.34%, 0%, 70.59% of the mice in the group A, B, C, respectively. ConclusionsEstablishment of a mouse model of cutaneous squamous cell carcinoma induced by 7,12-DMBA/croton oil and NB-UVB is a better method than treated with chemical carcinogens alone or NB-UVB alone. This method can increase the tumor formation rate and incidence rate of SCC, and within a shorter period.

【Key words】Squamous cell carcinoma; 7,12-dimethylbenz(a)anthracene, 7,12-DMBA; Croton oil; Narrow-band ultraviolet B irradiation; Mouse models

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.011

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 02-0051-04

[作者簡(jiǎn)介]呂超(1989-)，女，研究方向：光與皮膚病研究。E-mail: nokky1@163.com。[通訊作者]劉保國(guó)(1966-)，男，研究方向：光與皮膚病研究。E-mail: lbg66@163.com。

[基金項(xiàng)目]河北省衛(wèi)計(jì)委2015年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20150074)；河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)項(xiàng)目(編號(hào)：361037)。