曾兆祿， 韓繼超， 薛　云，馬玉奎

(1. 山東省臨朐縣人民醫(yī)院，臨朐，山東　262600；2. 濟(jì)南市第一人民醫(yī)院，濟(jì)南，山東　250011；

3. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南，山東　250033)

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研究報(bào)告

針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

曾兆祿1， 韓繼超2， 薛云3，馬玉奎3

(1. 山東省臨朐縣人民醫(yī)院，臨朐，山東262600；2. 濟(jì)南市第一人民醫(yī)院，濟(jì)南，山東250011；

3. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南，山東250033)

【摘要】目的研究針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有無保護(hù)作用。方法采用大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線阻斷法(MCAO)制備大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注損傷模型，缺血2 h后將線拔出實(shí)現(xiàn)再灌注，分別于再灌注后立刻靜脈注射丹紅注射液2 mL/kg，并針刺百會(huì)、足三里，每天1次，連續(xù)3 d，72 h后采用Zea-Longa的5級(jí)4分制評(píng)分方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，TTC染色法測(cè)定腦梗死面積， Western blot法檢測(cè)缺血側(cè)腦皮層中Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果與模型和單用丹紅注射液組比較，針刺結(jié)合丹紅注射液治療后大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯降低，腦梗死面積減少，Bcl-2 的蛋白表達(dá)增多，Bax蛋白表達(dá)減少。結(jié)論針刺結(jié)合丹紅注射液比單用丹紅注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有更明顯的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】針刺；腦缺血再灌注損傷；Bcl-2；Bax

臨床上對(duì)于缺血性腦血管病的首要治療原則是盡早重建血液再灌，恢復(fù)腦部的血氧供應(yīng)，使缺血腦組織重新獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)并及時(shí)地將有害的代謝產(chǎn)物清除掉。重建血液再灌，一方面可使缺血的腦組織及時(shí)得到血氧供應(yīng)，抑制受損腦組織神經(jīng)細(xì)胞死亡，有利于神經(jīng)元功能的恢復(fù)；另一方面可進(jìn)一步加重缺血腦組織的病理損害，使病情惡化，引起腦缺血再灌注損傷，故防止再灌注損傷是目前治療缺血性腦血管疾病的重要環(huán)節(jié)和瓶頸[1]。丹紅注射液是從丹參和紅花中提取的含有丹參素、丹參酚A等成分的中藥注射液，具有抗炎抗氧化及神經(jīng)保護(hù)作用，臨床上被廣泛用于急性缺血性腦病[2]。但是缺血性腦病發(fā)病機(jī)理比較復(fù)雜，單用一種藥物難以取得滿意的療效。針灸作為一種中醫(yī)治療方法已經(jīng)在腦血管病治療中得到應(yīng)用[3]，但單用療效有限，治療作用難以得到證實(shí)，這也直接影響了該方法在臨床上的應(yīng)用。本文采用針刺結(jié)合丹紅注射液的方法研究其對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，為臨床推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境： SD大鼠(SCXK(京)2012-0001)，雄性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫(20～26)℃，濕度40%～70%，日溫差≤4℃，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(魯)2014 0008。

1.1.2藥品與試劑： 丹紅注射液(菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司提供，批號(hào)130808)；Western blot用抗體Bcl-2，Bax，GAPDH(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司提供)；紅四氮唑(TTC)(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心提供，批號(hào)20100413)。

1.1.3儀器：HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司制造)；封膜機(jī)(美國(guó)Fisher Scientific制造)；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造)；微量加樣器(美國(guó)艾本德公司制造)。

1.2方法

1.2.1大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立[4]：大鼠造模前禁食24 h不禁水，采用腹腔注射350 mg/kg的10%水合氯醛麻醉后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，剪去切口部位的被毛，切開頸部正中部位的皮膚，分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，向上分離右頸外動(dòng)脈(ECA)遠(yuǎn)端1 cm、結(jié)扎ECA分支，在近CCA分叉處結(jié)扎ECA，用動(dòng)脈夾夾閉CCA近心端，用眼科剪在ECA結(jié)扎處與分叉處之間做一切口，將栓線自切口處插入，收緊線結(jié)，將動(dòng)脈夾松開，將尼龍線順ECA經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)慢慢送入顱內(nèi)，插入深度為 (18.5±0.5)mm，阻斷MCA的血供，收緊絲線，將線尾端暴露于切口外，層層縫合切口。阻斷血流2 h后，同法將再次麻醉大鼠，將尼龍線線栓慢慢退出至有阻力感，使其頭端回到CCA分叉處，大腦中動(dòng)脈重新獲得血液供應(yīng)，實(shí)現(xiàn)再灌注，剪斷線栓， 完成MCAO模型制備。假手術(shù)組僅進(jìn)行右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈的分離，不進(jìn)行栓塞。

1.2.2動(dòng)物分組及給藥：選取造模成功大鼠40只，按照神經(jīng)功能缺陷評(píng)分均衡原則分為4組，分別為假手術(shù)組、模型組、丹紅注射液 2 mL/kg組和針刺結(jié)合丹紅注射液 2 mL/kg組，造模后丹紅注射液組靜脈給予丹紅注射液，另一組給予丹紅注射液后針刺百會(huì)穴和左側(cè)足三里穴，得氣后接脈沖電療儀，采用疏密波，頻率2～100 Hz，強(qiáng)度2 mA，每次20 min[5]。每天給藥或針刺1次，連續(xù)3 d。假手術(shù)組和模型組給予相同容積的生理鹽水。

1.2.3神經(jīng)功能缺陷評(píng)分：腦缺血2 h再灌注72 h后，參考Zea-Longa[4]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行5級(jí)4分制神經(jīng)功能評(píng)分，各個(gè)分值之間按照觀察的具體情況可增減0.5分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0分：未觀察到明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：提尾懸空時(shí)梗死半球?qū)?cè)前肢不能完全伸展；2分：行走時(shí)向偏癱側(cè)及左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：自主運(yùn)動(dòng)時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。MCAO模型組1-3分提示模型復(fù)制成功，0分、4分或死亡者剔除。

1.2.4腦缺血面積測(cè)定[6]：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，打開胸腔暴露心臟，用4℃預(yù)冷生理鹽水快速進(jìn)行心臟灌流。取腦經(jīng)生理鹽水漂洗后置-20℃冰箱中冷凍10 min，然后將以2 mm為間隔進(jìn)行腦組織冠狀切片，置于2% TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)生理鹽水溶液中，37℃避光染色30 min。待顯色后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后對(duì)采用圖像處理軟件(Adobe Photoshop 7.0)對(duì)缺血面積進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)，計(jì)算缺血面積。最終腦缺血面積以占總面積的百分率表示。

1.2.5Western blot檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)Bcl-2、Bax蛋白水平：取50 mg腦組織，剪碎，用預(yù)冷PBS液洗滌兩遍，加入300 μL RIPA組織裂解液和3 μL PMSF，超聲波粉碎，置冰上裂解20 min。4℃離心，15 000 r/min，20 min。吸取上清液采用BCA法測(cè)定組織蛋白濃度。用12%分離膠和5%積層膠灌膠后，將凝膠置電泳槽中，上下游均加入電泳緩沖液。取蛋白樣品上樣。Bcl-2、Bax每孔均上樣50 μg，同時(shí)對(duì)稱上樣marker。電泳開始電壓為30 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至100 V，電泳3.5 h后切斷電源。取下凝膠用于轉(zhuǎn)膜。分別剪取6塊濾紙和1塊硝酸纖維素膜(NC膜)，浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中將塑料架放入含有轉(zhuǎn)移緩沖液的托盤中，按負(fù)極到正極的順序?qū)⑥D(zhuǎn)移海綿，濾紙，PAGE膠，NC膜，濾紙，轉(zhuǎn)移海綿依次放置在塑料架上，夾上轉(zhuǎn)移夾，放入轉(zhuǎn)移槽中。膠靠負(fù)極，NC膜靠正極。 接通電源，電壓100 V，冷室轉(zhuǎn)膜l h。 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將NC膜浸入麗春紅染液中染色后將NC膜放入培養(yǎng)皿中，加5%脫脂奶粉，4℃封閉過夜。平皿中加入一抗，放入NC膜，4℃搖床過夜后加二抗反應(yīng)。反應(yīng)完畢后將ECL顯色液加到NC膜的正面，反應(yīng)1 min，進(jìn)入暗室，將NC膜放入Kodak增感屏，于NC膜正上方放置膠片，曝光，顯影，定影。顯影后可見密度強(qiáng)度不同的條帶。將顯色的膠片圖像輸入凝膠分析系統(tǒng)，應(yīng)用ID Image Analysis Software進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度測(cè)定。

2結(jié)果

2.1針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分的影響

與模型組比較，給予丹紅注射液后大鼠的神經(jīng)功能缺陷有一定程度減輕，而結(jié)合針刺后神經(jīng)功能缺陷明顯減輕，與模型組和單用丹紅注射液組比較差異均有顯著性(P<0.05或P<0.01)，說明針刺結(jié)合丹紅注射液能明顯改善模型大鼠神經(jīng)功能缺陷，其效果好于單用丹紅注射液。見圖1。

*P<0.05, **P<0.01 vs 模型組; #P<0.05 vs. 丹紅注射液組圖1　針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分的影響Note. DH: Danhong injection group. AC+DH: Acupuncture plus Danhong injection. The same as below.Fig.1　The effects of acupuncture combined with Danhong injection on the neurological deficit scores of the rats ±s，n =10).

2.2針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)MCAO大鼠腦缺血面積的影響

與模型組比較，給予丹紅注射液后大鼠腦缺血面積減少，而結(jié)合針刺后腦缺血面積減少更明顯，與模型組和單用丹紅注射液組比較差異均有顯著性(P<0.05或P<0.01)，說明針刺結(jié)合丹紅注射液能明顯抑制模型大鼠腦缺血，其效果好于單用丹紅注射液，見圖2。

*P<0.05, **P<0.01 vs. 模型組; #P<0.05 vs. 丹紅注射液組圖2　針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)MCAO大鼠腦缺血面積的影響Fig.2　The effects of acupuncture combined with Danhong injection on infarct volume in the rat brains ±s，n =5).

2.3針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)區(qū)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平的影響

與模型組比較，給予丹紅注射液后大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū) Bcl-2 蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，而結(jié)合針刺后腦缺血皮質(zhì)區(qū) Bcl-2 蛋白表達(dá)增加更明顯，Bax蛋白表達(dá)降低更顯著(P<0.01)，與模型組和單用丹紅注射液組比較差異均有顯著性(P<0.05或P<0.01)，說明針刺結(jié)合丹紅注射液能更明顯抑制模型大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，其效果好于單用丹紅注射液，見圖3。

s. 模型組; ##P<0.01 vs. 假手術(shù)組; P<0.05, vs. 丹紅注射液組圖3　針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)區(qū)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3　Effect of acupuncture combined with Danhong Injection on Bcl-2 and Bax expression levels in the ischemic penumbra cortex. ±s，n=5)

3討論

大腦中動(dòng)脈栓塞 (MCAO)模型是目前用來評(píng)價(jià)急慢性腦缺血再灌注損傷藥物最為經(jīng)典的模型，此模型與人類腦卒中病理生理過程最為接近。通過閉塞大腦中動(dòng)脈2 h后再復(fù)灌，使大腦中動(dòng)脈供應(yīng)區(qū)的血流先減少或全無后再恢復(fù)血液和氧氣供應(yīng)，造成腦組織缺血缺氧，能量代謝障礙，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡，與臨床局灶性腦缺血的發(fā)病過程和機(jī)制基本類似。此模型可以用來定性、定量地觀察缺血腦組織的病理生理變化和評(píng)價(jià)治療的療效。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和腦梗死面積是評(píng)價(jià)腦缺血再灌注損傷程度的重要指標(biāo)之一。以往研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2表達(dá)高低與腦缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，在缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型中，Bcl-2表達(dá)量與神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，Bcl-2基因被敲除后，神經(jīng)功能缺陷變嚴(yán)重，梗死面積會(huì)擴(kuò)大，會(huì)加劇腦缺血再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞損傷[7]。Bax被稱為“死亡基因”，表達(dá)過多則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重缺血再灌注損傷。故腦缺血再灌注損傷后 Bcl-2 和Bax 表達(dá)的比例決定著細(xì)胞在凋亡信號(hào)的作用下是否出現(xiàn)凋亡及凋亡的發(fā)生率，當(dāng)Bax 蛋白表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而當(dāng) Bcl-2 蛋白表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)則抑制細(xì)胞凋亡[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用了Zea-Longa評(píng)分法對(duì)神經(jīng)功能缺陷進(jìn)行評(píng)分，采用可以快速對(duì)梗塞范圍能夠直觀定量的TTC 染色法對(duì)梗死區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，Western lot法檢測(cè)了模型大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)區(qū)Bcl-2和Bax蛋白水平，探討針刺結(jié)合丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯升高，腦缺血面積明顯增加，腦組織內(nèi)Bax蛋白表達(dá)顯著升高，而Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，充分證實(shí)了模型復(fù)制成功。與模型組比較，丹紅注射液組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分降低，缺血面積減少，腦缺血皮質(zhì)中 Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，而Bax蛋白表達(dá)降低。同時(shí)應(yīng)用針刺后，以上指標(biāo)的變化更明顯，且與丹紅注射液組比較均有顯著性差異。以上結(jié)果提示，丹紅注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，但結(jié)合針刺后效果更明顯，故臨床上對(duì)于腦缺血性疾病的治療可靜脈滴注丹紅注射液后再給予針刺治療，可進(jìn)一步提高療效。

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〔修回日期〕2015-11-17

Neuroprotective effect of acupuncture combined with Danhong injection on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats

ZENG Zhao-lu1, HAN Ji-chao2, XUE Yun3, MA Yu-kui3

(1. People’s Hospital of Linqu County, Shandong Linqu 262600, China;2. the first People’s Hospital of Jinan, Jinan 250011; 3. Shandong Pharmaceutical Academy, Jinan 250033)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the neuroprotective effect of acupuncture combined with a Chinese medicine, Danhong injection, on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Methods Middle cerebral artery (MCA) occlusion was prepared by putting a nylon suture in the MCA. The MCA blood flow in the animals was restored at two hours after the MCA occlusion by withdrawing the suture to the external carotid artery (ECA). The acupoints “Baihui”(DU20) and “Zusanli”(ST36) were acupunctured and stimulated by twirling the acupuncture needle after reperfusion, and the rats were also administered with Danhong injection by intravenous injection, once every day for three days. Zea-Longa scores were recorded to assess the changes of neurological function. The rats were sacrificed at 72 h after reperfusion. Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining was used to measure cerebral infarction size. Western blot was used to test the level of Bcl-2 and Bax in the ischemic penumbra. ResultsThe acupuncture combined with Danhong injection treatment group displayed markedly lower neurologic deficit scores, reduced ischemic infarct surface, increased expression of Bcl-2 protein, and reduced expression of Bax protein, compared with those in the model group and Danhong injection alone group. ConclusionsAcupuncture combined with Danhong injection show more significant neuroprotective effect than Danhong injection treatment alone on rat models of cerebral ischemia/reperfusion injury.

【Key words】Acupuncture; Danhong injection; Cerebral ischemia/reperfusion injury; B cell lymphoma/lewkmia-2; Bcl-2-associated protein

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.013

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 02-0062-05

[作者簡(jiǎn)介]曾兆祿(1971-)，男，主管藥師，本科， 研究方向： 針灸理療。[通訊作者]馬玉奎 (1975-)，男， 副主任藥師，博士，研究方向：新藥藥理毒理評(píng)價(jià)。 E-mail： yukuima@sina.com。