脂肪氧合酶高效制備關鍵技術研究

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12）屬于氧化還原酶，是一類含有非血紅素鐵的蛋白質，能夠專一催化氧化含有Z，Z-1，4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸，形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物的雙加氧酶，可作為面粉增白劑和增香劑、抗腫瘤藥物前體、涂料與洗滌劑等生產(chǎn)原料，具有巨大的市場需求。由于商品化的LOX主要通過大豆浸提獲得，受大豆來源的影響，產(chǎn)品批次間的性質差異較大，不利于下游產(chǎn)品的開發(fā)和應用。

近年來，隨著LOX應用領域的拓展，國內(nèi)外科學家等通過分子改造、高產(chǎn)菌構建及發(fā)酵過程優(yōu)化的研究，以獲得應用性能優(yōu)良的LOX并實現(xiàn)其高效生產(chǎn)。Cristea，M（2005）研究在畢赤酵母中表達含錳的脂肪氧合酶和推定金屬配體的定點突變；Bae，JH（2010）從銅綠假單胞菌PR3中發(fā)現(xiàn)了一種新的熱穩(wěn)定的LOX。其被純化了34.3倍，復得率為5.14%，純化后酶的Km和Vmax值分別為3 57 mmol/L和0 73 mu mol/min//mg。María等（2012）克隆了西蘭花基因組中的脂肪氧合酶（BoLOX1）基因，序列分析顯示BoLOX1和其他高等植物脂肪氧合酶相似，并分析了該基因的表達，結果表明BoLOX1在植物采后衰老過程中有較大提高。 María等（2012）克 隆 了 橄 欖 脂 肪 氧 合 酶c DNA（Oep2LOX1），并對光照、溫度、損傷對脂肪氧合酶在橄欖果表皮中的表達的影響進行了研究。國內(nèi)的江南大學、南京農(nóng)業(yè)大學等在脂肪氧合酶高效制備技術上進行了深入的研究。如：CN201310287699.X公開了一種熱穩(wěn)定脂肪氧合酶突變體及其構建方法，通過PCR法分別對脂肪氧合酶的蓋子結構201-TQRGQG-206進行G204P、G206P、G204P/G206P 及L6loop→PT linker突變，并得到具有熱穩(wěn)定性的脂肪氧合酶。與野生酶相比，脂肪氧合酶突變體在50℃下的半衰期及最適反應溫度均有顯著提高，改造后的酶更適合工業(yè)應用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。CN201210578451.4公開了一種酶活性及熱穩(wěn)定性提高的脂肪氧合酶，是在GenBank PA119公布的基因序列編碼的蛋白質基礎上，其N端氨基酸缺失，其中缺失尤以缺失30個為佳。使用該方法得到的新型脂肪氧合酶，酶學性質較好的突變株，熱穩(wěn)定性提高2.1倍，比酶活仍能維持初始的90%。陸信曜（2013）將來源于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的LOX基因在大腸桿菌（Escherichia coli）Rosetta（DE3）中進行分泌表達，并對重組酶進行了性質分析和熱穩(wěn)定性改造。其通過分段缺失重組LOX N端高柔性區(qū)域，在未影響催化效率的前提下提高了酶的熱穩(wěn)定性；通過突變、替換和缺失等策略降低“蓋子”結構鉸鏈loop的柔性，以提高LOX熱穩(wěn)定性；通過N末端融合表達自組裝雙親短肽（SAP）提高LOX熱穩(wěn)定性和催化效率。陸信曜（2013）以研究室保存的脂肪氧合酶生產(chǎn)菌株重組大腸桿菌Rosetta（DE3）/pre-LOX為研究對象，在搖瓶水平上對培養(yǎng)基、誘導溫度、誘導劑濃度、外源添加物進行優(yōu)化；在3L發(fā)酵罐水平上對初始誘導菌體濃度（OD600）進行優(yōu)化。搖瓶發(fā)酵條件下，誘導溫度為20℃，當菌體OD600達到0.6，添加1 mmol/L誘導劑及0.5%吐溫-20，胞外酶活達到8.4 U/mL；在3 L發(fā)酵罐上，誘導溫度為20℃，當菌體OD600達到8.0，添加1 mmol/L誘導劑及0.5%十二烷基磺酸鈉，胞外酶活為8.3 U/mL。章棟梁（2012）采用Plackett-Burman設計法，對影響重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪氧合酶的7個相關因子進行篩選，并建立枯草芽孢桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶的最佳工藝。結果表明對重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著影響的因子是乳糖、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度。刁含文（2015）研究了重組魚腥藻脂肪氧合酶定點突變及突變酶酶學性質，重組魚腥藻脂肪氧合酶（Ana-LOX）基因來自于Anabaena sp.PCC 7120。利用定點突變技術將Ana-LOX的421位和40位的纈氨酸（Val）突變?yōu)楸彼幔ˋla），獲得突變體V421A、V40A和V421A/V40A。野生型Ana-LOX在50℃下半衰期為3.8 min。而突變酶V421A和V40A在50℃的半衰期分別為4.4 min和7.0 min。突變酶V421A/V40A的半衰期為8.3 min，與野生型Ana-LOX相比，提高了1.18倍。相對于野生酶，突變酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分別提高了4.83%、41.58%、80.07%。突變酶的最適反應溫度均比野生酶（35℃）高5℃。CN201410053650.2公開了一種酶活與熱穩(wěn)定性同時提高的脂肪氧合酶突變體及制備方法，利用定向進化技術對魚腥藻脂肪氧合酶分子進行定向改造，經(jīng)多輪易錯PCR和DNAShuffling，獲得了酶活與熱穩(wěn)定性同時提高的脂肪氧合酶突變體，酶活力為21 420 U/mL，比野生型提高了2.17倍。

隨著應用研究的深入，LOX在食品加工、化工、醫(yī)藥等領域展現(xiàn)良好的應用前景。在此背景下，如何獲得具有良好應用性能的LOX并實現(xiàn)其高效發(fā)酵生產(chǎn)，將成為國內(nèi)外相關研究的重要方向。

（江南大學圖書館張群）