胡治銘， 梁叢叢，國(guó)洪旭，鄧先余，林連兵

（昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650500）

屎腸球菌和枯草芽孢桿菌混合培養(yǎng)條件的優(yōu)化

胡治銘， 梁叢叢，國(guó)洪旭，鄧先余，林連兵*

（昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650500）

以屎腸球菌和枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象，以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)、Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)屎腸球菌和枯草芽孢桿菌的混合培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：初始pH、裝液量和氮源對(duì)活菌數(shù)影響顯著。最優(yōu)條件為：初始pH 6.5、裝液量50/500 mL、氮源用量35 g/L、接種比1∶12、轉(zhuǎn)速180 r/min，在此條件下活菌數(shù)達(dá)到6.99×1010CFU/mL，比優(yōu)化前提高了5倍，屎腸球菌菌株和枯草芽孢桿菌菌株的活菌數(shù)分別達(dá)到4.58×1010CFU/mL和2.41×1010CFU/mL。

屎腸球菌；枯草芽孢桿菌；混合培養(yǎng)

益生素（Probitics）俗稱益生菌、生菌素、微生態(tài)制劑等，是活的微生物飼料添加劑［1］。它在改善動(dòng)物體內(nèi)微生態(tài)或酶的平衡、預(yù)防疾病、提高飼料利用率、促進(jìn)生長(zhǎng)及凈化養(yǎng)殖環(huán)境等方面發(fā)揮重要作用［2］。益生素中常用的益生菌包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌。

屎腸球菌為動(dòng)物腸道益生菌，能提供一些必需氨基酸和維生素、產(chǎn)生酶類幫助宿主消化、發(fā)酵產(chǎn)生乳酸降低腸道pH、分泌細(xì)菌素從而抑制致病菌的生長(zhǎng)，并且以粘附抗性和競(jìng)爭(zhēng)排斥限制有害菌體內(nèi)定植［3］。枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生維生素、各種酶以及多種代謝產(chǎn)物，對(duì)飼料的降解消化吸收和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝起到促進(jìn)作用［4］，還能夠產(chǎn)生抗菌素、刺激畜禽的免疫器官發(fā)育，從而提高機(jī)體免疫力［5］。

屎腸球菌為兼性厭氧菌，枯草芽孢桿菌為好氧菌，兩者的生長(zhǎng)特性及營(yíng)養(yǎng)要求差異很大。屎腸球菌在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)會(huì)阻礙枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖，兩者的混合發(fā)酵過(guò)程十分復(fù)雜，控制其過(guò)程比較困難，特別是生產(chǎn)上兩者的混合發(fā)酵難以實(shí)現(xiàn)［6］，因此工業(yè)生產(chǎn)中通常采用單獨(dú)培養(yǎng)，然后再混合的工藝，由此造成設(shè)備利用率低、周期延長(zhǎng)、生產(chǎn)成本增加。

有研究表明，枯草芽孢桿菌對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，并且在溶氧較高時(shí)，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)十分迅速。據(jù)此，作者通過(guò)對(duì)屎腸球菌和枯草芽孢桿菌菌株單獨(dú)培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)基中的碳源、氮源、營(yíng)養(yǎng)因子等成分和培養(yǎng)條件如溫度、初始pH、裝液量、轉(zhuǎn)速等因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得能夠同時(shí)顯著促進(jìn)屎腸球菌和枯草芽孢桿菌菌株生物量的因素，然后通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化，探索能夠提高兩種微生物混合培養(yǎng)生物量的方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種屎腸球菌（Enterococcus faecium）ET11菌株和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BY06菌株：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

1）MRS液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母粉 5.0，C6H12O6·H2O 20.0，K2HPO4·3H2O 2.0，（NH4）2HC6H5O72.0，CH3COONa·3H2O 5.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.04；吐溫-80 1.0 mL/L，pH 6.2～6.8。

2）LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子液制備將斜面保存的枯草芽孢桿菌BY06菌株接種LB液體培養(yǎng)基，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)14 h，連續(xù)增殖三代，備用。將斜面保存的屎腸球菌ET11菌株接種MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)14 h，連續(xù)增殖三代，并用MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使以上兩種菌液的菌體濃度一致，備用。

1.2.2搖瓶培養(yǎng)將種子液按照3%的接種體積分?jǐn)?shù)接入裝有150 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)16 h，進(jìn)行單因素和響應(yīng)面的發(fā)酵條件研究。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基組分對(duì)屎腸球菌和枯草芽孢桿菌生物量的影響

1）碳源對(duì)生物量的影響：分別用蔗糖、麥芽糖、乳糖等量替代MRS液體培養(yǎng)基中的葡萄糖。

2）氮源對(duì)生物量的影響：分別用蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸銨等量替代MRS液體培養(yǎng)基中的混合氮源（蛋白胨+牛肉膏+酵母粉）。

3）營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)生物量的影響：在MRS液體培養(yǎng)基中分別添加體積分?jǐn)?shù)5%的西紅柿汁、胡蘿卜汁、土豆汁、玉米汁［7］、無(wú)菌水，用于最適營(yíng)養(yǎng)因子的篩選。

1.2.4發(fā)酵條件對(duì)屎腸球菌和枯草芽孢桿菌生物量的影響

1）溫度對(duì)生物量的影響：分別設(shè)置28、32、37、42℃4個(gè)溫度梯度作為搖床培養(yǎng)溫度。

2）初始pH對(duì)生物量的影響：針對(duì)屎腸球菌分別設(shè)置 5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9共 9個(gè) pH梯度；針對(duì)枯草芽孢桿菌分別設(shè)置6、6.5、7、7.5、8、8.5、9共7個(gè)pH梯度。

3）轉(zhuǎn)速和裝液量：針對(duì)枯草芽孢桿菌分別設(shè)置100、150、180、210 r/min共 4個(gè)轉(zhuǎn)速梯度和 50 mL/500 mL、70 mL/500 mL、100 mL/500 mL、150 mL/500 mL、200 mL/500 mL、250 mL/500 mL共6個(gè)裝液量梯度用于篩選最適轉(zhuǎn)速和裝液量。

1.2.5混合培養(yǎng)最適接種比篩選將屎腸球菌和枯草芽孢桿菌按照1∶3、1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15接種體積分?jǐn)?shù)接種到MRS培養(yǎng)基中，篩選最適的接種比。

1.2.6混合培養(yǎng)的響應(yīng)面優(yōu)化根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和先前已做的單因素篩選，選取對(duì)屎腸球菌和枯草芽孢桿菌皆有顯著影響的初始pH、氮源、裝液量3個(gè)因素為Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量，以總活菌數(shù)為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析（Response Surface Analysis，RSA）進(jìn)行混合培養(yǎng)條件的優(yōu)化。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

1.2.7測(cè)定方法由于兩種菌的菌落形態(tài)差異較大，故單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)時(shí)每種菌的活菌數(shù)的測(cè)定均采用平板稀釋涂布計(jì)數(shù)法；pH測(cè)定儀測(cè)定菌液pH。

表1　　響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of response surface

1.2.8數(shù)據(jù)處理采用 Microsoft Excel 2003整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪制表格；采用SPSS21進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基組分對(duì)屎腸球菌和枯草芽孢桿菌生物量的影響

碳源是微生物生長(zhǎng)繁殖最基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，ET11菌株和BY06菌株對(duì)各種碳源均可利用但差異不顯著 （P＞0.05）。ET11菌株的最適碳源為麥芽糖，對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)為6.2×109CFU/mL；BY06菌株的最適碳源為蔗糖，對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)為9.6×108CFU/mL。

氮源利用結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，ET11菌株和BY06菌株均可利用各種有機(jī)氮源并且差異較為顯著（P＜0.05），且二者的最適氮源都是混合氮源，對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)分別為 8.2×109CFU/mL和 9.5×108CFU/mL。ET11菌株和BY06菌株對(duì)無(wú)機(jī)氮源幾乎都不能利用。

圖1　氮源對(duì)ET11和BY06活菌數(shù)的影響Fig.1　Effects of nitrogen sources on the viable counts of strain ET11 and strain BY06

在添加了各種不同的營(yíng)養(yǎng)因子之后，ET11菌株和BY06菌株的生物量均有所增加但差異不顯著，并且以土豆汁和胡蘿卜汁的加入效果最為明顯，土豆汁中含有ET11菌株較易利用的糖類、礦物質(zhì)和維生素等，而B(niǎo)Y06菌株較易利用胡蘿卜汁中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［8］，ET11菌株和BY06菌株的活菌數(shù)分別為8.0×109CFU/mL和1.5×109CFU/mL。

2.2發(fā)酵條件對(duì)屎腸球菌和枯草芽孢桿菌生物量的影響

細(xì)胞內(nèi)的酶都有其最適溫度，無(wú)論外界溫度是低于還是高于此溫度，都會(huì)影響酶的活性，進(jìn)而影響菌體的代謝活動(dòng)，而且培養(yǎng)溫度不同，菌體的細(xì)胞膜流動(dòng)性也會(huì)不同。ET11菌株和BY06菌株的最適生長(zhǎng)溫度分別是42℃和37℃。對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)分別為7.3×109CFU/mL和1.1×109CFU/mL。

培養(yǎng)基pH會(huì)影響菌體細(xì)胞膜內(nèi)外的電荷狀態(tài)，從而使細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生改變，而且還會(huì)改變營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化狀態(tài)，二者的共同作用會(huì)影響菌體細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改變菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)。由圖2可知，ET11菌株和BY06菌株生物量都隨著pH的變化而變化，且差異較為顯著。ET11菌株在pH 7.5～9范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好，pH為8.5時(shí)生物量最高，活菌數(shù)為1.3×1010CFU/mL；BY06菌株的適宜生長(zhǎng)范圍為pH 6～7，當(dāng)pH為6.5時(shí)BY06菌株的生物量最高，其活菌數(shù)為2.0×109CFU/mL。

圖2　初始pH對(duì)ET11和BY06活菌數(shù)的影響Fig.2　Effects of initial pH on the viable counts of strain ET11 and strain BY06

裝液量和轉(zhuǎn)速都會(huì)影響溶氧水平，裝液量越少則溶氧越多，越利于好氧菌的生長(zhǎng)，反之亦然，但是較少的裝液量會(huì)增加經(jīng)濟(jì)成本。在一定范圍內(nèi)，隨著轉(zhuǎn)速的提高溶氧也會(huì)增加，但是如果轉(zhuǎn)速過(guò)大，雖然溶氧較多，但較高的剪切力會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞造成傷害，影響菌體的生長(zhǎng)。BY06菌株的最適轉(zhuǎn)速為180 r/min，活菌數(shù)為2.2×109CFU/mL，由圖3可知，BY06菌株的最適裝液量為50 mL，活菌數(shù)為4.6× 109CFU/mL。

圖3　裝液量對(duì)BY06活菌數(shù)的影響Fig.3　Effects of liquid volume on the viable counts strain BY06

2.3接種比對(duì)混合培養(yǎng)總生物量的影響

混合培養(yǎng)時(shí)總的生物量隨著接種比的減小而呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)ET11與BY06接種比為1∶12時(shí)，總的生物量最高，其活菌數(shù)為1.3× 1010CFU/mL。屎腸球菌屬于乳酸菌，能降低pH值，合成分泌細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，從而抑制枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，當(dāng)ET11和BY06二者接種比較小時(shí)，枯草芽孢桿菌數(shù)量多，能迅速繁殖，待含氧量減小，有利于乳酸菌的繁殖且分泌細(xì)菌素，此時(shí)枯草芽孢桿菌已形成數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)，故最后表現(xiàn)為二者的生物量都比較高。但如果二者的接種比過(guò)小，就會(huì)造成枯草芽孢桿菌的過(guò)快繁殖，從而快速消耗培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，乳酸菌的繁殖受到影響，最終的總生物量就會(huì)下降。

2.4混合培養(yǎng)的響應(yīng)面優(yōu)化：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行了17次試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方差分析見(jiàn)表2-3。

利用Design Expert 8.0擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果并以 Y代表響應(yīng)值，以A、B、C分別代表初始 pH、氮源、裝液量，得到回歸方程：

Y=28.43－5.77A+4.26B－12.28C+1.98AB+ 11.50AC+3.11BC－2.08A2+2.04B2+10.38C2

由表3可知，該模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.002 5），這說(shuō)明該方程在被研究的回歸區(qū)域擬合較好；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.943 3，說(shuō)明該模型相關(guān)性較好，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)ET11菌株和BY06菌株的混合培養(yǎng)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由對(duì)回歸方程的方差分析表明，A、B對(duì)混合培養(yǎng)菌體濃度影響顯著，C、AC影響極顯著。

表2　　響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Experimental design and results of response surface

表3　　方差分析Table 3　Analysis of variance

初始pH和裝液量之間的三維響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖4。由表2-3及圖4可知，裝液量對(duì)ET11菌株和BY06菌株混合培養(yǎng)的菌體濃度影響極為顯著，隨著裝液量的減少，菌體濃度呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，當(dāng)裝液量為50 mL時(shí)，菌體濃度呈現(xiàn)最大值6.994× 1010CFU/mL，ET11菌株菌體濃度為 4.581×1010CFU/mL，BY06菌 株 菌 體 濃 度 為 2.413×1010CFU/mL，并且和pH的交互作用也比較明顯。當(dāng)裝液量為50 mL時(shí)，隨著pH的降低，菌體濃度逐漸增加。pH和氮源對(duì)菌體濃度影響也較顯著，當(dāng)?shù)春吭黾忧页跏紁H降低，菌體濃度也會(huì)隨著增加，但二者的交互作用不明顯。由響應(yīng)面的等高點(diǎn)和等值線分析可知，在所選范圍之內(nèi)有極大值，極大值為6.994×1010CFU/mL，對(duì)應(yīng)的氮源用量為35 g/L、初始pH為6.5、裝液量為50 mL。以此條件進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)， 所得菌體濃度的均值為 6.989×1010CFU/mL，可見(jiàn)以上分析較為可靠。

圖4　pH和裝液量交互影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Interactive effect of pH and liquid volume on the response surface

3結(jié)語(yǔ)

通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、營(yíng)養(yǎng)因子）和培養(yǎng)條件（溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、裝液量）對(duì)屎腸球菌和枯草芽孢桿菌生物量的影響。氮源、初始pH、裝液量對(duì)其影響比較顯著，然后通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化并綜合考量成本、易操作等因素得到二者混合培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為（g/L）：蛋白胨14.0，牛肉膏14.0，酵母粉7.0，葡萄糖（C6H12O6·H2O）20.0，K2HPO4·3H2O 2.0，檸檬酸氫二銨 （NH4）2HC6H5O72.0，CH3COONa·3H2O 5.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.04；pH 6.5。最優(yōu)培養(yǎng)條件為：接種比（ET11/BY06）1∶12、裝液量50 mL/500 mL、溫度37℃、轉(zhuǎn)速180 r/min。

孔健等混合培養(yǎng)乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌，結(jié)果OD值得到了顯著提高［9］；趙鎮(zhèn)國(guó)等利用廉價(jià)培養(yǎng)基混合培養(yǎng)植物乳桿菌、釀酒酵母及枯草芽孢桿菌得到了和利用MRS培養(yǎng)基相同的效果［10］。屎腸球菌和枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，且枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)過(guò)程中芽孢形成率也比較低。作者通過(guò)調(diào)節(jié)接種比、初始pH、裝液量等因素讓好氧的枯草芽孢桿菌快于屎腸球菌而迅速繁殖，然后帶動(dòng)和促進(jìn)屎腸球菌的生長(zhǎng)，以此減弱屎腸球菌對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用，最終表現(xiàn)為混合培養(yǎng)的最高總生物量比單獨(dú)培養(yǎng)的最高生物量提高了5倍，且此時(shí) ET11菌株生物量為 2.413×1010CFU/mL，BY06菌株生物量為4.581×1010CFU/mL，為進(jìn)一步研究屎腸球菌和枯草芽孢桿菌的混合培養(yǎng)提供了依據(jù)，也為以后的工業(yè)化益生素制備中的菌種混合發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。

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Study on Mixed Culture of Enterococcus faecium and Bacillus subtilis

HU Zhiming，LIANG Congcong，GUO Hongxu，DENG Xianyu，LIN Lianbing*
（College of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kuming 650500，China）

In order to investigate the effect of Enterococcus faecium and Bacillus subtilis mixed culture on their biomass，MRS medium，single factor experiment，Box-Behnken Design were adopted to optimize the mixed culture.Results showed that medium initial pH，liquid volume and nitrogen source had significant effects on the viable counts of the strains.The optimal culture conditions were as follows：initial medium pH 6.5，50 mL liquid medium in 500 mL flask with 180 rpm in shake，35 g/L of nitrogen source，the inoculation of Enterococcus faecium and Bacillus subtilis at a ratio of 1∶12.Under this conditions，the total viable counts reached to 6.99×1010CFU/mL，with 4.58×1010CFU/mL of Enterococcus faecium and 2.41×1010CFU/mL of Bacillus subtilis，which was five times higher than that of before optimization.

Enterococcus faecium，Bacillus subtilis，mixed culture

TQ 92

A

1673—1689（2016）05—0537—06

2014-11-13

云南省科技創(chuàng)新強(qiáng)省項(xiàng)目（2014AB015）。
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林連兵（1969—），男，湖南通道人，理學(xué)碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)方面的研究。E-mail：linlb@sohu.com