何熹，王彥寧，李超，王艷萍（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

乳酸菌與乳糖酶

何熹，王彥寧，李超，王艷萍*
（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

介紹了β-半乳糖苷酶的來源分布、基因組成差異、工業(yè)中的用途以及生產(chǎn)制備方法；并以乳酸菌為例，闡述了不同來源乳酸菌中乳糖酶的種類，乳酸菌中乳糖酶基因的克隆，相關(guān)的表達體系，以及利用乳酸菌生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的方法以及發(fā)展前景。

β-半乳糖苷酶；乳酸菌；基因克隆

1　乳糖酶研究

1.1乳糖酶的分布

乳糖酶主要存在于年幼動物腸道、植物以及真菌、酵母和細菌等微生物中。目前已經(jīng)從多種微生物中發(fā)現(xiàn)乳糖酶，比如：細菌中有乳酸菌、芽孢桿菌、大腸桿菌等；霉菌有米曲霉、黑曲霉、疏球曲霉；酵母菌有脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、乳酸酵母等；放線菌有天藍色鏈球菌等［2］。

1.2乳糖酶基因

乳糖酶的編碼基因為β-半乳糖苷酶基因，對該基因的研究非常早，1961年，法國的雅各布（Jacob）和莫諾德（Monod）通過對大腸桿菌β-半乳糖苷酶的研究，提出了乳糖操縱子學說。1969年，哈佛大學Beekwith博士研究小組應(yīng)用DNA分子雜交技術(shù)首次分離得到大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因［3］。此后，許多其他不同生物的β-半乳糖苷酶基因先后被發(fā)現(xiàn)并克隆。

通過對來自不同生物的乳糖酶基因進行比對，發(fā)現(xiàn)來自同一屬種的生物，其乳糖酶基因相似性較高，以保加利亞乳酸菌為例，Zhang（2012）［4］對不同菌株的Lb.bulgaricusstrainwch9901和Lb.bulgaricusstrainstrain 1.1480進行測序分析，并且通過GenBank比較分析，二者的相似度達到99.3%以上。與之相對，不同屬種中存在的乳糖酶，其基因差異性就很大，張偉（2002）［5］將來源于一株亮白曲霉（Aspergillus candidus）的乳糖酶基因與酵母等乳糖酶基因比較，發(fā)現(xiàn)該基因與來源于酵母、擬南芥以及人的乳糖酶基因同源性均較低，與人的相似度只有3.1%，最低如海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）僅為1.9%。

國際生物化學與分子生物學聯(lián)盟（IUBMA），根據(jù)氨基酸序列相似度，將已發(fā)現(xiàn)的各種糖基水解酶（比如葡萄糖基水解酶，木聚糖酶等）分成了不同家族，以GH+數(shù)字命名（http：//www.cazy.org/Glycoside-Hydro－lases.html），截止到2015年8月，一共發(fā)現(xiàn)133個家族。其中乳糖酶位于GH1，GH2，GH35以及GH42家族：GH1類的乳糖酶主要具有6-磷酸-β-半乳糖苷酶活性，作用底物是某些含有磷酸基團的糖類；GH35家族中的乳糖酶絕大多數(shù)來源于動植物等真核生物；而GH2，GH42家族中的乳糖酶許多都是來自大腸桿菌、乳酸菌等原核生物。

1.3乳糖酶的用途

綜上所述，實施任務(wù)打包定價方案，價格方面會產(chǎn)生很大的影響，單個任務(wù)的價格會適當?shù)亟档?，減少了商家的投資費用，有利于眾包投放市場[12]．同時，將任務(wù)打包發(fā)布，商家為會員設(shè)計了最優(yōu)的工作路徑，雖然單個任務(wù)的定價降低了，但會員的工作效率卻有了相應(yīng)的提高．此方案的實施有利于任務(wù)完成度的提高，保證所有的任務(wù)都有人去做，所有的人都有任務(wù)做．

乳糖酶在工業(yè)上主要用于乳品工業(yè)，利用其水解作用水解牛乳等乳制品中的乳糖，生產(chǎn)低乳糖乳制品供乳糖不耐受人群食用。此外，利用乳糖酶的半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用生產(chǎn)的低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）已經(jīng)開始投放市場，GOS不為人體吸收，但能被腸道內(nèi)雙歧桿菌所利用，是很好的益生元［6］。

1.4乳糖酶的生產(chǎn)

乳糖酶的工業(yè)生產(chǎn)方法主要是微生物發(fā)酵法。目前已經(jīng)投放市場的乳糖酶產(chǎn)品，一種是克魯維酵母制備的乳糖酶，另一種是曲霉制備的真菌乳糖酶?？唆斁S酵母菌的乳糖酶的分子量是201 kD，是由3 078核苷酸編碼的1 025個氨基酸組成的復合蛋白，該酶最適pH值為6.0～7.0，最適溫度40℃～45℃，而且產(chǎn)酶方式是胞外分泌表達。來源于黑曲霉乳糖酶的分子量較小，一般為100 kD～130 kD，最適pH3.5～4.0，最適溫度50℃～60℃，黑曲霉的乳糖酶也能胞外分泌表達［7］。目前除了克魯維酵母和曲霉外，其他來源的乳糖酶也在研究當中，近年來就有不少乳酸菌乳糖酶研究的報道。

2　乳酸菌研究

2.1乳酸菌簡介

乳酸菌是一類利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱。乳酸菌是廣義范疇的概念，是非規(guī)范的細菌分類學名稱［8］。乳酸菌廣泛地存在于自然界、動植物體、乳制品和發(fā)酵食品中，且大多數(shù)為非致病菌，由于具有許多有益的代謝特征和人類長期安全使用等特點，被廣泛認為是GRAS（GenerallyRecognizedAsSafe）級的微生物。

乳酸菌細胞常呈球狀和桿狀。乳酸桿菌族中食品工業(yè)經(jīng)常使用的發(fā)酵菌種諸如德氏乳桿菌（Lactobacillus delbreckii）、植物乳酸桿菌（Lactobaillus plantarum）等，而保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricus）是制作酸奶以及乳酸飲料的重要菌種。鏈球菌族中的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是制作發(fā)酵乳制品的重要菌種之一。

2.2乳酸菌中的乳糖酶

來源于乳制品中的乳酸菌，由于其生活環(huán)境的需要，其碳源來源主要是乳制品中的乳糖，需要利用自身的乳糖酶將乳糖降解利用，而且鑒于這些乳酸菌具有無毒安全的特性，有些乳酸菌還具有改善腸道菌群，增強人體免疫力，抗腫瘤，降低血液膽固醇，降血壓等保健功能［9］，如果將其作為提取乳糖酶的材料，則具有得天獨厚的優(yōu)勢，這就是近些年來對乳酸菌乳糖酶研究較多的原因之一。而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的來自乳酸菌的乳糖酶基因，都來自于GH2，GH42家族。

2.2.1GH2家族

目前所有在乳酸菌種發(fā)現(xiàn)的β-半乳糖苷酶基因，絕大部分都屬于GH2家族（Clarissa Schwab 2010）［10］，而該家族的基因又分2大類：lacZ和lacLM。

含有l(wèi)acZ基因的乳酸菌主要有St.thermophilus，Lb.delbrueckii subsp［11］，LB.bulgaricu［12］以及部分雙歧桿菌。LacZ蛋白是由1～4個亞基組成的同源多聚體［13］，從不同物種提取的半乳糖苷酶的蛋白質(zhì)序列有著較高的同源性和相似性，分子量在100 kD～850 kD之間，其中大腸桿菌的半乳糖苷酶分子量最大，為520 kD～850 kD。

含有l(wèi)acLM基因的乳酸菌比較多，包括Leuconostoc lactis，Lb.sakei［14］，Lb.coryniformis［15］，Lb.acidophilus［16］，Lb.plantarum［17］，Lb.helveticus以及Lb.reuteri［18］。該蛋白的特點是含有2個亞基：lacL編碼的大亞基蛋白分子量為73 kD～75 kD，由長1 800 bp～1 900 bp核酸編碼；lacM編碼小亞基蛋白分子量為35 kD，由長900 bp～1 000 bp核酸編碼。

2.2.2GH42家族

在Lactobacillus crispatus、Lactobacillus acidophilus以及Lactobacillus sp中還發(fā)現(xiàn)另一種β-半乳糖苷酶基因，該基因編碼的乳糖酶只有一個亞基，編碼的氨基酸序列與GH2家族差異明顯。此外本實驗室分離的一株馬乳酒樣乳酸桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3）也發(fā)現(xiàn)了這種類型的乳糖酶基因的存在。

3　乳糖酶的異源表達

為了獲得高產(chǎn)酶量高的菌株，除了常規(guī)的微生物誘導篩選方法外，目前常采取將乳糖酶基因克隆后轉(zhuǎn)化到其他細胞中過量表達的方法，常見的表達載體有以下幾種。

3.1大腸桿菌表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)是研究最為透徹的系統(tǒng)，由于其具有遺傳機理研究清晰、易于培養(yǎng)操控、發(fā)酵周期短和工藝簡單等諸多優(yōu)點，已經(jīng)成功的實現(xiàn)了多種蛋白的原核表達。許多外源的乳糖酶已在大腸桿菌中得到了高量的表達：章莎莎（2011）［19］通過從乳桿菌（Lactobacillus sp.B164）中克隆得到一個乳糖酶基因bg42-164，將其連接pET-30a載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，成功表達出了乳糖酶的活性，該酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH6.0，經(jīng)50℃處理30min后，剩余酶活力保留80%以上，該酶具有較好的高溫活性和熱穩(wěn)定性。王政（2010）［20］從保加利亞德氏乳酸中擴增出3 048 bp的乳糖酶基因并將其克隆至載體pGEX-6p-1，同樣在大腸桿菌中成功表達出乳糖酶活性，經(jīng)誘導后蛋白的表達量最高能達到菌體蛋白總量的41.9%。

3.2酵母表達系統(tǒng)

酵母是單細胞真核生物，不但具有大腸桿菌易操作、繁殖快、易于工業(yè)化生產(chǎn)的特點，還具有真核生物表達系統(tǒng)基因表達調(diào)控和蛋白修飾功能，能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工、修飾的不足［21］。因此酵母表達系統(tǒng)受到越來越多的重視和利用。常見的酵母表達系統(tǒng)主要有釀酒酵母和畢赤酵母表達系統(tǒng)。與釀酒酵母相比，畢赤酵母質(zhì)粒穩(wěn)定高，拷貝數(shù)穩(wěn)定，表達的重組蛋白產(chǎn)量大，活性高，而且重組基因穩(wěn)定，不易丟失［22］。張偉、范云六等［23］將克隆的亮白曲霉、（Aspergillus candidus）乳糖酶基因插入到畢赤酵母中，畢赤酵母表達系統(tǒng)可高效地表達有生物活性的乳糖酶，分泌表達量近6 g/L，酶活為3 600 U/mL。不過對于來源于乳酸菌這類原核生物乳糖酶基因的表達，成功的例子并不多，這可能是因為在酵母這種真核表達系統(tǒng)中，缺乏轉(zhuǎn)運原核微生物中某些氨基酸的tRNA，從而導致蛋白質(zhì)無法正常翻譯。

3.3乳酸菌表達系統(tǒng)

以乳酸菌為載體的高效表達系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用成為近年來的研究重點，主要是因為與大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)相比，乳酸菌表達系統(tǒng)在安全性方面具有明顯的優(yōu)勢：首先乳酸菌本身即為安全級益生菌，作為一種原核表達系統(tǒng)，易構(gòu)建成食品級的基因克隆及表達系統(tǒng)，可以有效提高基因工程產(chǎn)品的安全性［24］；其次在乳酸菌載體中使用的選擇標記主要是乳酸菌素Nisin，Nisin是乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp）產(chǎn)生的一種小肽，對金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有強烈的抑制作用，而且作為一種天然食品防腐劑，已經(jīng)通過美國FDA的安全認證，對人體無毒［25］?？赏ㄟ^構(gòu)建含有Nisin抗性基因nisr的質(zhì)粒，當含有外源片段質(zhì)粒的乳酸菌在Nisin瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)化子就能篩選出來，因此是目前常用的安全性選擇標記。Clarissa Schwab（2010）將Lb.acidophilus，Lb.plantarum，St.thermophilus等乳酸的乳糖酶基因插入表達載體pAMJ586，并在乳酸乳球菌（Lactococcus lacti）中成功表達［26］。當然，乳酸菌表達系統(tǒng)目前尚未在工業(yè)化方面大規(guī)模使用，主要是其還有許多需要完善的地方，比如經(jīng)改造后的無質(zhì)粒營養(yǎng)缺陷型菌株，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的復雜環(huán)境中難以存活；乳酸菌中大部分質(zhì)粒功能還不是很透徹，開發(fā)乳酸菌質(zhì)粒載體種類有限；特別是外源基因在乳酸菌中表達之后，由于乳酸菌細胞壁為緊密編織，導致一些分泌蛋白無法分泌而滯留在細胞壁上，影響的產(chǎn)品的提取效率［24］。

4　乳糖酶展望

中國預防醫(yī)學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃色人種，尤其是亞洲人中乳糖不耐癥患者較多，我國成年人飲奶后乳糖吸收不良可達80%［27］，因此只有開發(fā)添加乳糖酶后的低乳糖的乳制品方能滿足他們的需要。乳酸菌種類繁多，大部分安全無毒，而且能在溫度、酸堿度差異較大的環(huán)境下生存，這就為我們制取能適應(yīng)不同生產(chǎn)加工條件的乳糖酶提供了豐富的資源庫。此外，如果將不同來源的乳酸菌乳糖酶制成復合酶制劑，不僅可用于降解乳制品中的乳糖，還能合成作為腸道益生元的低聚半乳糖GOS，這樣大大提高了食品的營養(yǎng)價值。因此通過開發(fā)乳酸菌來制取乳糖酶等產(chǎn)品，是具有非常廣闊市場前景的。

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Lactobacillus and Lactase

HE Xi，WANG Yan-ning，LI Chao，WANG Yan-ping*
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The source and the distribution，the difference，industrial application and production method of βgalactosidase were introduced.Using lactobacillus as example，the paper also expounds the type of β-galactosidase in different lactobacillus，gene cloning and related expression system from lactobacillus，and the method of β-galactosidase production by lactobacillus as well as the prospects for development.

β-galactosidase；lactic acid bacteria；gene cloning

2015-09-08

“十二五”科技部高科技發(fā)展研究計劃‘863計劃'項目（2011AA100904）；國家自然基金（青年基金）項目（31301678）

何熹（1972—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品科學。