劉兆臣，邴欣，王琦（.山東師范大學生命科學學院，山東濟南25004；2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，山東濟南25002）

基于適配體的食源性致病菌檢測方法研究進展

劉兆臣1，邴欣2，*，王琦1
（1.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014；2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，山東濟南250012）

食源性致病菌是危害食品安全的重要因素，對人類健康造成了巨大的危害，越來越受到世界范圍的廣泛關(guān)注，因此建立簡單高效的檢測方法是食品衛(wèi)生安全檢測中的重要組成部分。適配體（Aptamer）是一段寡核苷酸序列，通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從構(gòu)建的隨機文庫中篩選得到。適配體對靶物質(zhì)具有高度親和力與選擇性，多種用于食品中致病菌檢測的適配體已被成功篩選和應(yīng)用。介紹了基于適配體的食源性致病菌檢測方法，討論了適配體的發(fā)展及應(yīng)用前景。

食源性致病菌；適配體；檢測

1　食源性致病菌的危害

食源性致病菌是指隨食物侵入機體可引發(fā)人畜共患病的一類病原微生物，目前我國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)重點監(jiān)測的食源性致病菌有水副產(chǎn)品中的副溶血性弧菌、禽畜制品中的沙門氏菌、乳制品中的金黃色葡萄球菌、剩菜剩飯中的蠟樣芽胞桿菌、罐頭制品中的肉毒梭狀芽孢桿菌、涼菜中的李斯特菌以及腸出血性大腸桿菌等，其中有些致病菌還可以產(chǎn)生細菌毒素，一般的滅菌辦法很難將其清除，一旦監(jiān)管不嚴格，將會嚴重威脅人類的生命健康。近20年來，向衛(wèi)生部上報的食品中毒人數(shù)逐年遞增，其中大部分由食源性致病菌引起［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，70%的食源性疾病由致病性微生物引起［2］。據(jù)中國疾病預(yù)防和控制中心統(tǒng)計，我國每年的食源性疾病病例中，45%～55%是由微生物因素造成的［3］。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在全球范圍內(nèi)，每年有高達15億的兒童深受食源性腹瀉的困擾，其中約300萬人因此死亡，并且由食源性致病菌引發(fā)的飲用水和食品污染造成的病例占70%［4］。食源性致病菌一方面給國家經(jīng)濟造成了巨大的損失，另一方面也極大地威脅了人們的身體健康和生命安全，已成為目前最為關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一。

2　食源性致病菌的傳統(tǒng)檢測方法

目前常用的致病菌的檢測方法主要有經(jīng)典微生物檢驗法（微生物培養(yǎng)法）、微量儀器分析法、分子生物學技術(shù)和免疫學檢測法等。

2.1經(jīng)典微生物檢驗技術(shù)

微生物檢測方法主要對微生物進行選擇性培養(yǎng)與生化分析，微生物經(jīng)過在營養(yǎng)培養(yǎng)基中増菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)、形態(tài)學觀察、生化鑒定和血清分型一系列步驟［5］，根據(jù)其不同的生理生化特征來對樣品中細菌進行定性、定量測定。傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)具有檢測符合率及結(jié)果穩(wěn)定率較高的優(yōu)點，因而被評為是食源性致病菌檢測的經(jīng)典方法。但這種傳統(tǒng)方法的檢測周期長（一般需要一周），工作量大，并且該方法特異性不強，靈敏度偏低，較易發(fā)生錯檢和漏檢，較難實現(xiàn)食源性致病菌現(xiàn)場的快速檢測［6］。

2.2儀器分析方法

氣相色譜法（Gas chromatography，GC）、毛細管電泳技術(shù)（Capillary electrophoresis，CE）、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）和質(zhì)譜技術(shù)（Mass spectrometry，MS）等［7］是當前進行微生物分析的主要儀器分析法，根據(jù)不同病原體的形態(tài)特征及表面物質(zhì)的特性或產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的差異經(jīng)儀器分析后可以呈現(xiàn)不同的圖譜特征。利用色譜分析樣液中的各種物質(zhì)成分，從而明確病原菌的特征性標志成分，協(xié)助病原菌的診斷檢測。微量儀器分析法操作簡單快速、精確度靈敏度高，但使用的儀器設(shè)備較為龐大且價格較昂貴，不適合應(yīng)用于食源性致病菌現(xiàn)場的快速檢測［8］。

2.3分子生物學技術(shù)

實時熒光PCR技術(shù)（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）、多重 PCR檢測技術(shù)（Multiplex PCR）、基因芯片技術(shù)（Gene chip technology）、DNA指紋圖譜技術(shù)是當前應(yīng)用較為廣泛的分子生物學技術(shù)，這些新型方法成功應(yīng)用于實際樣品的檢測，可以實現(xiàn)快速靈敏地檢測食源性致病菌［9］。但在檢測中易出現(xiàn)假陽性。

2.4免疫學檢驗技術(shù)

免疫學方法屬于超微量分析方法，根據(jù)致病菌產(chǎn)生的特異性分泌物和代謝物進行抗原-抗體反應(yīng)，須結(jié)合免疫放大技術(shù)放大抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technology，IFT）、免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique，GICT）、免疫磁珠分離技術(shù)是當前免疫學檢驗技術(shù)的研究熱點方向。此類方法雖然操作簡單、特異性強、樣品處理量大［10］，但抗體制備難度大、周期長、成本高。

在食源性致病菌檢測領(lǐng)域，適配體可以彌補以上傳統(tǒng)檢測方法的不足。與以上檢測方法相比，適配體的篩選周期短，成本低，可以特異性識別靶物質(zhì)。因此基于適配體的食源性致病菌檢測方法不斷發(fā)展并逐漸完善。

3　適配體的起源、特點及其在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

3.1適配體的起源

1990年，Tuerk和Gold［11］創(chuàng)建了指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），并使用該技術(shù)篩選獲得特異性結(jié)合噬菌體T4DNA聚合酶的核酸分子。同年，Nature報道了Ellington［12］等應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選6種有機小分子染料的核酸分子，并命名這種核酸分子為“Aptamer”，即適配體。3.2適配體的特點

1）高特異性和高親和力：適配體與靶物質(zhì)結(jié)合的原理是空間構(gòu)象的契合，可以在氫鍵、序列中堿基的堆積作用、范德華力等作用力下與相應(yīng)的靶分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物［13］，而且適配體能夠識別靶物質(zhì)與其類似物結(jié)構(gòu)上的細微差別。

2）靶分子范圍廣：由于隨機區(qū)域核苷酸排布是隨機的，所以文庫容量在1×1013～1×1015［14］，理論上SELEX技術(shù)幾乎可以獲得任何一個與靶分子特異性結(jié)合的適配體。迄今為止，已經(jīng)篩選出了200多種靶物質(zhì)的適配體，適用范圍非常廣［8］。

3）篩選周期短：適配體的篩選是一個體外完成的過程，經(jīng)過8輪～15輪的循環(huán)篩選后可獲得高親和力的序列，篩選過程約1個月～2個月時間，然而利用動物試驗制備抗體歷時長達6個月甚至更久。

3.3適配體在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用

應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選得到的適配體可直接應(yīng)用于食源性致病菌檢測，也可與磁珠、抗體等物質(zhì)結(jié)合后應(yīng)用于食源性致病菌檢測。

3.3.1基于游離適配體的食源性致病菌檢測方法

適配體對目標菌有高度的特異性和親和力，篩選得到后可直接應(yīng)用于食源性致病菌檢測。李華等［15］通過SELEX技術(shù)成功篩選到特異性識別產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88菌體的適配體，可對該菌定性及定量檢測，并首次建立了熒光基團標記適配體快速鑒定產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88的檢測方法。Cao X等［16］篩選得到對于金黃色葡萄球菌具有高特異性及高親和力的5條適配體。這5條適配體可識別不同的分子位點，試驗結(jié)果顯示與單獨使用一種適配體相比，將5條適配體同時加入到樣品中檢測金黃色葡萄球菌效果更好。楊小嬌等［17］以沙門氏菌O8為靶分子篩選得到9條特異性適配體并熒光標記親和力最高的B10適配體用于檢測沙門氏菌O8，靈敏度可達102cfu/mL。

3.3.2基于適配體-磁珠結(jié)合的食源性致病菌檢測方法

氨基化磁珠與適配體結(jié)合后可以分離富集適配體，基于適配體的親和力與特異性，可提高反應(yīng)的靈敏度。韓曉曉等［18］基于SELEX技術(shù)，以阪崎腸桿菌ATCC 12868與DSM 18703為靶標篩選得到特異性適配體?；谶m配體的特異性，將生物素化的適配體與親和素化磁珠連接構(gòu)建了阪崎腸桿菌的新型檢測方法。在最佳試驗條件下，阪崎腸桿菌ATCC 12868與DSM 18703的檢出限均為50 cfu/mL，嬰幼兒配方奶粉中加標回收率分別為93.55%～106.67%和94.74%～103.55%。王鑫等［19］篩選得到化膿鏈球菌和無乳鏈球菌適配體，以適配體-磁珠為捕獲探針，熒光素標記的適配體為顯色探針，可以快速高效的檢測以上兩種致病菌。在優(yōu)化試驗條件下，化膿鏈球菌和無乳鏈球菌的檢出限分別為70 cfu/mL和50 cfu/mL，牛奶樣品中的加標回收率分別為83.9%～103.3%和95.2%～102.5%。Raghavendra Joshi等［20］利用適配體-磁珠為捕獲探針在雞肉殘骸清洗液樣品中檢測沙門氏菌，檢測限為102cfu/ 25 mL～103cfu/25 mL樣品。

3.3.3基于適配體-抗體結(jié)合的食源性致病菌檢測方法

因抗體能特異性識別抗原，常會被應(yīng)用與適配體結(jié)合作為捕獲探針識別靶細菌。S.H.Ohk等［21］將抗體與適配體連接后修飾光導(dǎo)纖維，應(yīng)用此傳感器檢測李斯特菌。在純培養(yǎng)或混合培養(yǎng)條件下，當該菌的濃度為103cfu/mL時此傳感器可將其有效檢出。

3.3.4基于適配體-96孔板結(jié)合的食源性致病菌檢測方法

96孔板作為一種吸附材料常會被用于固定適配體形成夾心法。Nuo Duan等［22］將生物素化的單核細胞增生性李斯特菌適配體固定于96孔板，并分別連接目標菌和熒光標記的適配體，通過熒光值定量檢測目標菌。該方法的檢測限為75 cfu/mL。徐寶霞等［23］將篩選得到的李斯特菌適配體用親和素標記，與辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素吸附到96孔板作為捕獲探針，分別加入待檢樣品與另一條親和素標記的適配體以及酶作用底物。顯色反應(yīng)之后通過吸光度值檢測李斯特菌數(shù)目。該方法的檢測限為104cfu/mL。

3.3.5基于適配體-石墨烯結(jié)合的食源性致病菌檢測方法

石墨烯機械強度大，室溫下導(dǎo)電能力低，廣泛應(yīng)用于生物傳感器當中。段穎芬等［24］應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選得到鼠傷寒沙門氏菌適配體。將熒光標記的適配體吸附于氧化石墨烯表面，加入目標菌后，利用熒光猝滅構(gòu)建熒光適配體傳感器。該方法的檢測限為102cfu/mL，并在103cfu/mL～108cfu/mL濃度之間呈線性關(guān)系，同時有很高的選擇性。賈飛等［25］將氧化還原石墨烯修飾到玻碳電極表面，并連接巰基化適配體作為捕獲探針。沙門氏菌被適配體捕獲并固定在電極表面，從而引起電流變化。該電流型適配體通過電信號變化對沙門氏菌進行定量檢測。檢測限為80 cfu/mL，檢測時間僅為1 h。

3.3.6基于適配體-納米金結(jié)合的食源性致病菌檢測方法

在溶液中適配體可與納米金結(jié)合，當靶物質(zhì)存在時，適配體從納米金表面脫落與靶物質(zhì)特異性結(jié)合，納米金粒子的顏色和形態(tài)發(fā)生變化。基于顏色變化，可對靶物質(zhì)定性及定量檢測。Jun Hui Soh等［26］將赭曲霉素適配體與納米金粒子孵育，加入目標菌后測定溶液吸光值可以對目標菌定量。當目標菌濃度為1 nmol時，該方法可將其有效檢出。Bin Wang等［27］將黃曲霉素適配體修飾到納米金粒子上，通過靜電相互作用修飾熒光碳、氮量子點。在目標菌存在的條件下，發(fā)生熒光猝滅。該方法的線性范圍為5 pg/mL～2.00 ng/mL，檢測限為5 pg/mL。

4　總結(jié)與展望

綜上所述，適配體方法在食源性致病菌檢測領(lǐng)域得到了初步應(yīng)用，展現(xiàn)了廣泛的發(fā)展應(yīng)用前景。然而就適配體而言，還有部分問題需要解決，包括如何創(chuàng)建更有效的篩選平臺，提高篩選效率，研究適配體與結(jié)合復(fù)合物的親和作用機制等。相信隨著適配體技術(shù)研究的發(fā)展，以適配體為基礎(chǔ)的食源性致病菌的高效快速檢測方法會不斷建立，并在其他領(lǐng)域有著更深入的應(yīng)用。

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Research Progress of Detection Method of Food-borne Pathogenic Bacteria Based on Aptamers

LIU Zhao-chen1，BING Xin2，*，WANG Qi1
（1.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China；2.Shandong Product Quality Inspection Research Institute，Jinan 250012，Shandong，China）

Food-borne pathogenic bacteria is the main factors that endanger food safety and it has done great harm to human health，which has received more and more widespread attention.So establishing simple and efficient detection methods is an important part of food hygiene and security detection.Aptamers are single-stranded oligonucleotides that bind to target molecules with high affinity and specificity，which are selected by SELEX from a synthetic random ssDNA pool.A variety of aptamers for the detection of food-borne pathogenic bacteria have been successfully screened out and applied.This paper will introduce detection methods of food-borne pathogenic bacteria baesd on aptamers and discuss its application process and development prospect.

food-borne pathogenic bacteria；aptamer；detection

2016-05-12

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2014QK122）

劉兆臣（1990—），男（漢），碩士，研究方向：產(chǎn)品質(zhì)量安全。

邴欣（1977—），男（漢），高級工程師，博士，研究方向：產(chǎn)品質(zhì)量安全。